Als Reporterproteine bezeichnet man ganz allgemein Proteine, die sich in Zellen leicht nachweisen lassen. Sie dienen so in der jeweiligen zellbiologischen Fragestellung als eine Art Indikator. Am häufigsten zeigen sie dabei die Aktivität eines Promotors (s. Kap. 1.10.) an, die Promotorsequenz wird dazu in geeigneten Plasmid-Vektoren vor das Reportergen gesetzt. Reporterproteine können aber auch gleichzeitig mit zelleigenen Eiweißen hergestellt werden und so deren Aufenthaltsort im Gewebe oder in bestimmten Kompartimenten von Zellen anzeigen. Hierfür setzt man Reporterprotein und zelleigenes Protein unter die Kontrolle eines gemeinsamen Promotors, die Eiweiße werden dann je nach Konstrukt entweder gleichzeitig oder als ein großes, fusioniertes Protein synthetisiert. Nicht allein die einfache Nachweisbarkeit qualifiziert ein Protein zum Reporter. Weitere wichtige Anforderungen sind: das Protein sollte nicht schon endogen in den Zellen vorhanden und möglichst ungiftig sein; bestimmte Untersuchungen verlangen darüber hinaus nach einer Quantifizierbarkeit des synthetisierten Reporterproteins (Alam, 1990).
Oft dienen Zellkulturen als überschaubares in vitro System, um Reportergene unter einem Promotor zu exprimieren. Mäuse sind wegen ihrer Ähnlichkeit mit größeren Säugetieren und dem Menschen bezüglich Physiologie sowie Größe und Zusammensetzung des Genoms häufige Modellorganismen für Promotorstudien in vivo (Hadjantonakis, 2001). Moderne Bildgebungsverfahren ermöglichten in den vergangenen Jahren einen – im wahrsten Sinne des Wortes – direkten Blick auf biologische Prozesse, sogar unmittelbar im lebenden Tier (Hadjantonakis, 2003).
Für das Quantifizieren von Promotoraktivität eignet sich z.B. das Enzym Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), das den Acetylrest von Acetyl-CoA auf Chloramphenicol überträgt. Im entsprechenden Test wird ein Zell-Lysat mit markiertem Acetyl-CoA und Chloramphenicol inkubiert. Nachteil dieses Assays ist unter anderem die mit 50 Stunden sehr lange Halbwertszeit des Enzyms in der Zelle (Davey, 1995). Ein weiteres, quantitativ in eukaryonten Zellen nachweisbares Reporterprotein ist das β-Galactosidase-Gen aus dem Bakterium Escherichia coli (Scrable, 2002). Enzymaktivität wird sowohl für CAT als auch für β-Galactosidase je nach Substrat colorimetrisch, fluoreszent oder chemilumineszent gemessen.
Luziferase, ein Enzym aus Glühwürmchen (Photinus pyralis), eignet sich wegen seiner hohen Sensitivität als Reporterprotein besonders in Studien an schwachen Promotoren. Die kurze Halbwertszeit des Proteins von drei Stunden qualifiziert es darüber hinaus für Induktionsstudien. Luziferase setzt proportional zur Enzymmenge Licht frei, das in einem Luminometer quantitativ erfasst werden kann. Die Reaktion erfolgt durch die Zugabe des Substrats Luziferin zusammen mit ATP und Mg2+ zum Zelllysat. Durch Kotransfektion von Zellen mit der unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors stehenden Quallen-Luziferase aus Renilla reniformis sind interne Standards möglich (s. Kap. 2.) (Ford, 1995).
Der qualitative Nachweis von Reporterproteinen sollte eine klare Ja-Nein-Antwort zur Aktivität eines Promotors liefern und das Reporter-Protein mit möglichst geringem Aufwand – etwa durch direktes Beobachten unterm Mikroskop - detektierbar sein. Qualitative Nachweismethoden eignen sich, um die Aktivität eines Promotors einer Zellpopulation in vitro oder bestimmten Geweben eines Organismus zuzuordnen.
β-Galactosidase-Aktivität z.B. lässt sich nicht nur quantitativ messen, sondern auch qualitativ beobachten, indem man X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) als Substrat zugibt, Blaufärbung zeigt dann Enzymaktivität an. Nachteil ist, dass Gewebe oder Zellen vor der Detektion fixiert werden müssen.
Fluoreszierende Proteine wie z.B. das monomere Green Fluorescent Protein (GFP) (Prasher, 1992) strahlen – durch UV-Licht angeregt – sichtbares Licht ab, und zwar ohne die Zugabe von Substraten oder Kofaktoren. Damit sind fluoreszierende Reporterproteine einfach unterm Fluoreszenzmikroskop in lebenden oder fixierten Zellen nachweisbar und eignen sich dank fehlender Zytotoxizität für qualitative Promotorstudien an transgenen Tieren (Hadjantonakis, 2001).
Das aus der Qualle Aequorea victoria klonierte GFP wurde mit Hilfe gezielter Sequenz-Mutationen für die Expression in Säugerzellen optimiert und kann in seiner verstärkten Form als „enhanced“ (engl. = verstärkt) GFP oder EGFP schneller und sensitiver in Zellen nachgewiesen werden (BD/Clontech, Heidelberg). Durch weitere Manipulation am GFP erzeugte man Proteine, die unterm Mikroskop blau (ECFP, enhanced cyan fluorescent protein) oder gelb (EYFP, enhanced yellow fluorescent protein) erscheinen. Das Gen DsRed, welches für ein rot fluoreszierendes Protein kodiert, stammt dagegen aus einem anderen Organismus als GFP. Es wurde
ursprünglich aus einer Koralle kloniert und eignet sich zusammen mit EGFP für die simultane Detektion z.B. von zwei verschiedenen Promotoraktivitäten in Zellen oder Organismen. DsRed ist ein tetrameres Protein, das auf geringe Aggregation und schnellere Expression in Säugerzellen optimiert wurde und in dieser verbesserten Form als DsRed2 auf dem Markt ist (BD/Clontech, Heidelberg).
Wie überall in der Biologie werden auch für die Erforschung der Neurogenese Reporterproteine vielfältig eingesetzt, beispielsweise exprimiert unter Kontrolle des neuronalen Stammzell-spezifischen Enhancers des Nestin-Gens, des pan-neuronalen Tubulin-alpha1-Promotors, des oligodendroglialen Vorläuferzell-Promotors der 2',3'-zyklischen Nukleotid 3'-Phosphodiesterase (CNP), des postmitotischen neuronalen Tis21-Lokus, des neuronalen Vorläuferzell-spezifischen regulatorischen Elements des Proopiomelanocortin(POMC)-Gens und des neuronalen Stammzell-spezifischen Lokus des TLX-Gens (Frisen, 1995; Gloster, 1994; Gravel, 1998; Haubensak, 2004;
Overstreet, 2004; Shi, 2004).
Für die vorliegende Arbeit wurden Reporterproteine mittels gentechnischer Verfahren unter die Kontrolle der regulatorischen Sequenz des Doublecortin-Gens gestellt, für Kontrollen exprimierte man Reporterproteine unter dem konstitutiv aktiven Promotor des Cytomegalie-Virus (s. auch Kap. 2.). Reporter-Konstrukte mit DCX-regulatorischer Sequenz wurden sowohl in verschiedene Zellkulturen transient transfiziert, als auch zur Herstellung transgener Mäuse verwendet. Im ersten Fall kommt es durch die Aufnahme eines zirkulären Vektors in die kultivierten Zellen zur vorübergehenden Expression des Reporters. Diese Expression ist jedoch nicht stabil und endet mit dem Abbau der Fremd-DNA durch Nukleasen. Im Falle transgener Tiere dagegen ist die Fremd-DNA – zusammengesetzt aus der regulatorischen Region, dem Reportergen und einem Poly-Adenylierungssignal – als lineares Fragment stabil ins Genom eingebaut; dies geschieht nach Injektion des Sequenzabschnitts in befruchtete Eizellen von Mäusen oder Ratten per nicht-homologer Rekombination (s. auch Kap.
2). Das Transgen kann auf Nachkommen übertragen werden. Wegen der direkten Nachweisbarkeit unterm Fluoreszenzmikroskop kamen für qualitative Assays die Fluoreszenzproteine EGFP und DsRed2 zum Einsatz, für quantitative Assays bevorzugte man wegen der hohen Sensitivität und der Möglichkeit zur internen Standardisierung Luziferasen aus Photinus pyralis und Renilla reniformis.