Eingrenzung und Beschreibung der regulatorischen Region des Doublecortin-Gens für die Spezies Mensch, Maus und Ratte

Die genomische Sequenz des humanen DCX-Gens umfasst 118,4 kbp, die hieraus transkribierte mRNA 9,5 kbp. Dieses Transkriptionsprodukt geht aus dem alternativen Splicing von 9 Exons hervor (des Portes, 1998a; Gleeson, 1998) (Abb.

4.1). Die ersten 3 Exons bilden das 5' Ende der mRNA, im vierten Exon eröffnet das ATG-Startkodon den 1080 bp weiten offenen Leserahmen, der ein Polypeptid von 360 AS kodiert. Im Exon 3 befindet sich ein weiteres Startkodon, von dem allerdings nicht bekannt ist, ob es tatsächlich verwendet wird; sollte dieses Startkodon funktionell sein, so würde sich das synthetisierte Polypeptid um 42 AS am N-Terminus verlängern (des Portes, 1998a). Als Besonderheit besitzt das DCX-Transkript eine sehr lange untranslatierte Region am 3’ Ende, welche möglicherweise die Stabilität der mRNA beeinflusst (des Portes, 1998a).

Für die vorliegende Arbeit wurden kodierende Sequenzen der Doublecortin-Gene aus den drei Spezies verglichen, wobei große Übereinstimmung gefunden wurde:

auf mRNA-Ebene betrug die Homologie zwischen Mensch und Ratte 81%, zwischen Mensch und Maus 90%, auf Protein-Ebene sogar rund 98 % (basierend auf NCBI Blast). Im nächsten Schritt wurden auch nicht-kodierende Abschnitte der Gene auf Homologie in den drei Spezies untersucht, um so regulatorische Sequenzen des Doublecortin-Gens einzugrenzen. Humane genomische DNA strangaufwärts des Startkodons im Exon 4 wurde hierzu mit homologen Sequenzabschnitten der DCX-Gene von Maus und Ratte verglichen. Insgesamt 30 kbp genomischer DNA strangaufwärts der ATGs in den DCX-Genen der drei Spezies wurden in globalen Alignments auf Übereinstimmungen untersucht. Die hierzu verwendeten Sequenzen sind unter den NCBI Genbank-Zugangsnummern NT_025319, NT_039718 und NW_048037 verfügbar. Nur innerhalb eines rund 3,5 kbp großen Fragments unmittelbar strangaufwärts des Startkodons war die Basenfolge zu mehr als 85%

identisch. Die offensichtlich starke Konservierung dieses genomischen Sequenzbereichs in den drei Spezies ließ ihn als bedeutsam für die Regulation des Gens erscheinen, weshalb sich die weiteren Experimente auf diese 3,5 kbp große Region beschränkten.

Abb. 4.1 Gen-Aufbau und regulatorische Regionen der DCX-Gene aus Mensch, Maus und Ratte. Der Aufbau sowie die Lage der vorgeschlagenen regulatorischen Regionen des DCX-Gens aus A) Mensch, B) Maus und C) Ratte sind gezeigt. Schwarze Rechtecke stehen für Exons, eingezeichnet sind auch mögliche Bindestellen für Transkriptionsfaktoren (s. auch Tab. 4.2) sowie die CAAT/TATA-Boxen.

Exons strangaufwärts des ATGs im DCX-Gen der Ratte fehlen, da hierzu keine vollständigen cDNA-Sequenzen bekannt sind. D) bezeichnet Regionen unterschiedlicher Homologie (s. auch Tab. 4.1).

Mittels PCR wurde ein 3509 bp großer Abschnitt DNA unmittelbar strangaufwärts des ATG-Startkodons in Exon 4 des humanen Gens vermehrt, als Template diente genomische DNA aus humanen fötalen, kortikalen, neuronalen Vorläuferzellen. Dieses Fragment wurde in ein Plasmid kloniert, das kodierende Sequenzen für das Reporterprotein EGFP enthielt (s. Kap. 2.2.1). Der resultierende Vektor wurde phuDCX3509-EGFP genannt.

Region

Postion auf humanem Gen rel.

zum ATG [bp]

homologe Region auf Maus-Gen rel.

zum ATG [bp]

% Identität Mensch /

Maus

homologe Region auf dem Ratten-Gen

rel. zum ATG [bp]

% Identität Mensch /

Ratte Exon 1 - 1776 to – 1739 - 1802 to - 1765 100,0 -1814 to - 1777 97,4 Exon 2 - 1679 to – 1571 - 1706 to - 1592 79,6 -1716 to -1601 80,3 Exon 3 - 747 to – 355 - 744 to - 358 87,4 - 744 to - 353 86,9 Region 1 - 2885 to – 2358 - 2881 to - 2354 47,2 - 2896 to -2408 47,6 Region 2 - 2357 to – 1777 - 2353 to - 1803 79,6 - 2407 to - 1815 78,4 Region 3 - 1738 to – 1680 - 1764 to - 1707 83,1 - 1776 to - 1717 91,7 Region 4 - 1570 to – 748 - 1591 to - 745 75,3 - 1600 to - 745 74,4 Region 5 - 354 to – 22 - 357 to - 23 79,1 - 352 to - 23 78,3 Tab. 4.1 Homologie der vorgeschlagenen regulatorischen Regionen der DCX-Gene aus Mensch, Maus und Ratte. (s. auch Abb. 4.1 D)

Die 3,5 kbp große strangaufwärts des ATG-Startkodons im Exon 4 des humanen Gens gelegene Region wurde nach Bindestellen für allgemeine und spezifische Transkriptionsfaktoren untersucht. Eine mögliche TATA-Sequenz wurde an Position – 1983 bis – 1976, und eine CAAT-Box zwischen – 2079 und – 2071 relativ zum ATG im Exon 4 gefunden (Abb. 4.1 A; Abb. 4.2 A). Im Maus-DCX-Gen liegt die TATA-Box zwischen – 2012 und – 2005, die CAAT-TATA-Box zwischen – 2111 und – 2103 relativ zum Startkodon (Abb. 4.1 B; Abb. 4.2 B). Die TATA-Box im DCX-Gen der Ratte liegt zwischen – 2024 und – 2018, eine CAAT-Box zwischen – 2125 und – 2117 strangaufwärts des ATG (Abb. 4.1 C; Abb. 4.2 C).

Abb. 4.2.A Vorgeschlagene regulatorische Sequenz des humanen DCX-Gens. Die 3509 bp große Sequenz strangaufwärts des humanen DCX-Gens ist gezeigt. Mögliche Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, CAAT- und TATA-Boxen sind unterstrichen, Exon-Sequenzen kursiv gedruckt.

Abb. 4.2.B Vorgeschlagene regulatorische Sequenz des murinen DCX-Gens. Die 2881 bp große Sequenz strangaufwärts des murinen DCX-Gens ist gezeigt. Mögliche Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, CAAT- und TATA-Boxen sind unterstrichen, Exon-Sequenzen kursiv gedruckt.

Abb. 4.2.C Vorgeschlagene regulatorische Sequenz des DCX-Gens der Ratte. Die 3510 bp große Sequenz strangaufwärts des DCX-Gens der Ratte ist gezeigt. Mögliche Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, CAAT- und TATA-Boxen sind unterstrichen, Exon-Sequenzen kursiv gedruckt.

Ein weiteres Startkodon (– 359 bis – 357) ist für das humane Exon 3 beschrieben, allerdings hat man beim Menschen keine Proteine gefunden, welche um die zusätzlichen 42 AS N-terminal verlängert waren (des Portes, 1998a). Das DCX-Gen der Maus enthält eine zum humanen Exon 3 homologe Region, es scheint jedoch bei der Maus kein transkribiertes Exon 3 zu geben, wie sich in RT-PCR-Analysen zeigte. Hierfür wurde cDNA aus Maus-Telenzephalon zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung untersucht, vom Embryonaltag 10 bis zu adultem Gehirngewebe.

Oligonukleotid-Paare, welche die Region zwischen Exon 3 und 4 überspannten, führten in der RT-PCR nicht zu einem Produkt (Abb. 4.3). Wurden Oligonukleotide zur Amplifikation der Abschnitte von Exon 1 zu Exon 4 oder von Exon 2 zu Exon 4 verwendet, so ergaben sich RT-PCR-Produkte; diese enthielten jedoch keine zum Exon 3 des Menschen homologen Sequenzen, wie sich in direkter Sequenzierung zeigte. Der zum humanen Exon 3 homologe Bereich auf dem murinen DCX-Gen wurde deshalb in der Übersichtskarte (Abb. 4.1 B) nicht als Exon eingezeichnet und auch bei der Nummerierung der Exons nicht berücksichtigt. Die vorgeschlagene regulatorische Region des DCX-Gens der Ratte enthält Sequenzen hoher Homologie zum entsprechenden humanen und murinen Sequenzabschnitt, allerdings sind in der Ratte bisher keine cDNA-Sequenzen beschrieben, welche über die Exons 3 bis 8 hinausgehen.

ca. 600 bp

ca. 500 bp

Abb. 4.3 PCR aus Maus cDNA unter Verwendung von Primern für die Exons 1 bis 4. RNA wurde aus Maus-Telenzephalon zum Embryonaltag (E) 10.5 oder 18.5 sowie aus Bulbus olfactorius zum Postnataltag 7 bzw. 40 gewonnen und in cDNA umgeschrieben. Primer zur Amplifikation der cDNA-Abschnitte von Exon 1 bis 4 (1) und von Exon 2 bis 4 (2) lieferten Produkte von ca. 500 bzw. 600 bp Größe, Primer vom möglichen Exon 3 zum Exon 4 (3) dagegen kein Produkt in der RT-PCR.

Beim Vergleich der für die DCX-Gene von Mensch, Maus und Ratte vorgeschlagenen regulatorischen Sequenzen ließen sich mehrere Abschnitte voneinander abgrenzen, welche im Grad ihrer Homologie zueinander differierten.

Interessant waren in diesem Zusammenhang Abschnitte strangabwärts der Region 1.

Diese Region, zwischen Region 2 und dem Startkodon gelegen, war in den drei Spezies zu mehr als 75 % homolog. Demnach schien es wahrscheinlich, dass relevante regulatorische Sequenzen sich innerhalb dieser Regionen befanden (Abb. 4.1 D und Tab. 4.1). Tatsächlich ergab die Suche nach möglichen Bindestellen für Transkriptionsfaktoren mittels der Software Matinspector mehrere entsprechende Konsensus-Sequenzen, wie zum Beispiel Bindestellen für Brn-2, Brn-3, NeuroD1, E2F-1, E2F-2, Fast1, Smad3 und Smad4 (Abb. 4.1 und 4.2, Tab. 4.2).

Transkriptionsfaktor-

Bindestellen Positionen auf humanem

Gen rel. zum ATG [bp] Positionen auf

Maus-Gen rel. zum ATG [bp] Positionen auf Ratten-Gen rel. zum ATG [bp]

Tab. 4.2 Mögliche Transkriptionsfaktor-Bindestellen und ihre Lage relativ zum ATG. ermittelt durch Matinspector, www.genomatix.de

4.2. Spezifische Aktivität der regulatorischen Region des humanen