SouthernBlot- Analyse

3.2.7.1 Erstellung, Markierung und Quantifizierung einer Hybridisierungssonde

Mittels PCR mit den Primern „SouthernI“ und „SouthernIII“ konnte eine spezifische Hybridisierungssonde erstellt werden. Das erhaltene PCR- Amplifikat wurde mit dem NucleoSpin®ExtractII- Kit von Macherey- Nagel auf gereinigt. Anschließend erfolgte die Markierung der Sonde mit Hilfe des DIG DNA Labeling and Detection- Kit von Boeringer Mannheimer; dabei handelt es sich um ein nicht- radioaktives Verfahren, bei dem das an dUTP angelagerte Steroidhapten Digoxigenin (DIG) durch das Klenow- Enzym mit der Sonden- DNA verbunden wird. Die Markierung erfolgte nach Angabe des Herstellers.

Eine Quantifizierung der Hybridisierungssonde war nötig, um die Menge der

einzusetzenden Sonden- DNA zu bestimmen. Dafür wurde eine Verdünnungsreihe der Sonden- DNA mit TE- Puffer von 10^-1- 10^-6 angelegt und je 1 µl auf eine

Nylonmembran aufgetragen. Um die Konzentration der Sonden- DNA nun ablesen zu können, wurde die in dem Kit enthaltene Kontroll- DNA mit den Konzentrationen 100 pg/µl, 10 pg/µl,1 pg/µl, 0,1 pg/µl und 0,01 pg/µl ebenfalls auf die Nylonmembran

aufgetragen. Die Entwicklung der Nylonmembran erfolgte wie in Kapitel 1.2.7.2.

beschrieben. Das Signal der Hybridisierungssonde wurde mit dem Signal der Kontroll- DNA verglichen. Das Signal der Hybridisierungssonde sollte etwa 100 Mal stärker sein als das der Kontroll- DNA. War dies der Fall, so wurden 6 µl pro

SouthernBlot- Analyse verwendet (siehe folgenden Abschnittl „SouthernBlot“).Die Hybridisierungssonde wurde bei-20°C gelagert.

3.2.7.2 SouthernBlot

Bei der Methode, die von dem Biochemiker Southern 1975 erstmals beschrieben wurde, wird genomische DNA mittels ausgewählter Restriktionsendonucleasen gespalten und mit Hilfe der Gel- Elektrophorese ihrer Größe nach in Fragmente aufgetrennt. Anschließend wird diese DNA auf eine Nylonmembran übertragen ("blotting") und sichtbar gemacht.

Die zu untersuchenden DNA- proben wurden in 20 µl- Ansätzen mit ausgewählten Restriktionsendonukleasen und den entsprechenden Puffern über Nacht bei 37°C im Heizblock inkubiert; diese lange Zeit sollte die vollständige Spaltung gewährleisten.

Die eingesetzt DNA- Menge lag bei etwa 1000 µg. Zusätzlich wurde Kontroll- DNA mitgeführt: dazu wurde die genomische Wildtyp- DNA von M. tb., bzw. M. bovis BCG ebenfalls mit verdaut. Für die anschließende Gel- Elektrophorese wurde zudem die genomische Wildtyp- DNA zusätzlich auch unverdaut auf das Gel geladen. Die Gel- Elektrophorese wurde in einer großen Gelkammer bei180 V/280 mA oder in einer kleinen Gelkammer bei 140 V/230 mA für 1-3 Stunden durchgeführt. Nach Färbung des Gels mit Ethidiumbromid wurde es mit einem seitlich angelegten und an der Slot- Ebene geeichtem Lineal unter Einwirkung von UV- Licht fotografiert. Als Vorbereitung für das Blotten wurde das Gel anschließend für 20 Minuten in 0,25 M HCL geschwenkt, kurz mit Wasser gewaschen, für 30 Minuten in

Denaturierungslösung DNAI geschwenkt, erneut kurz mit Wasser gewaschen und für weitere 30 Minuten zum Neutralisieren in Denaturierungslösung DNAII geschwenkt.

Der Transfer der DNA auf die Nylonmembran erfolgte unter Vakuum bei 600 mbar für

1 Stunde. Dafür wurde die Nylonmembran mit 2x SSC angefeuchtet und auf die Filterplatte des aufgebauten Vakuum-Blot- Gerätes gelegt. Darüber wurde

überlappend ein Autoklavierbeutel gelegt, so dass ein hinein geschnittenes Fenster unmittelbar über der Nylonmembran zu liegen kam. Nachdem auf diese Konstruktion das Gel gelegt worden war, wurde es mittels Vakuum angesaugt und um das Gel herum 2x SSC- Lösung, sowie auf das Gel direkt 20x SSC- Lösung gegeben. Die SSC- Lösung stellte dabei die Transfer- Lösung für die DNA dar; durch diese wurde die DNA mit Hilfe des Vakuum auf die unter dem Gel liegende Nylonmembran übertragen.

Nach dem Transfer wurde die Nylonmembran mit einem Stift und durch

Wegschneiden der oberen rechten Ecke markiert und die DNA durch beiderseitiges Bestrahlen mit UV- Licht (UV- crosslinken) fest mit der Nylonmembran vernetzt.

Anschließend folgte die Prähybridisierung für 1 Stunde bei 65°C in einem

Hybridisierungsofen. Dafür wurde die Nylonmembran mit der DNA- Seite nach innen in eine Hybridisierungsröhre gegeben und mit 10-20 ml Hybridisierungspuffer (1 ml pro cm²) befeuchtet. Ziel dieses Schrittes war die Entfernung von unerwünschtem Hintergrund, der durch unspezifische Bindung der DIG- DNA- Sinde an der

Nylonmembran entstehen kann. Für die anschließende Hybridisierung wurden 6 µl der DIG- markierten Hybridisierungssonde in 50 µl TE- Puffer gegeben und diese Lösung für 5 Minuten im Wasserbad gekocht und dann schnell auf Eis abgekühlt.

Die Sonde wurde anschließend in 10-20 ml frischen Hybridisierungspuffer gegeben und nach Abgießen des alten Puffers aus der Hybridisierungsröhre neu in die Röhre hinzu gegeben. Die Hybridisierung fand bei 65°C über Nacht im Hybridisierungsofen statt. Am nächsten Tag wurde der Puffer mit der Sonde abgekippt und die

Nylonmembran gewaschen: zunächst wurde die Membran einmal kurz mit 2x SSC/0,1 SDS abgespült, es folgten zwei Waschschritte mit 2x SSC/0,1 SDS für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur im Hybridisierungsofen. Anschließend wurde die Membran zwei Mal für 15- 30 Minuten in 0,1 SSC/0,1 SDS bei 65 °C im

Hybridisierungsofen gewaschen. Mit diesen Waschschritten wurden

Basenpaarungen mit weniger als 95%ige Homologie zwischen Sonde und DNA entfernt. Nun wurde die Nylonmembran aus der Hybridisierungsröhre genommen und die nachfolgenden Waschschritte für die Chemilumineszenz- Detektion fanden bei Raumtemperatur in einer Glaswanne auf einem Schwenktisch statt. Die

Nylonmembran wurde 1 Minute in Wasch- Puffer äquilibriert und anschließend 30 Minuten mit Puffer2 abgesättigt. Dann kam die Membran 30 weitere Minuten in Puffer2 mit 0,01% Anti- DIG AP Mix. Nach Abgießen der Lösung wurde für zwei Mal 15 Minuten Wasch- Puffer hinzu gegeben und die Membran abschließend 2 Minuten in Puffer3 äquilibriert. Nun folgte das Einschweißen der Membran in Plastikfolie, wobei eine Seite offen gelassen wurde und über diese Öffnung 15 Tropfen CSPD auf die DNA- Seite der Membran getropft wurden. CSPD ist ein

Chemilumineszenzsubstrat, das unter alkalischen Bedingungen zu einem instabilen Zwischenprodukt dephosphoryliert und unter Lichtemission zu einem stabilen

Endprodukt zerfällt. Die Flüssigkeit wurde gleichmäßig auf der Membran verstrichen und 5 Minuten bei Raumtemperatur im dunklen inkubiert. Die überschüssige

Flüssigkeit wurde aus der Plastikfolie heraus gedrückt, die verbliebene vierte Seite nun ebenfalls zugeschweißt und die Membran für weitere 10 Minuten im dunklen bei 37°C im Brutschrank inkubiert.

Die anschließende Exposition eines Röntgenfilms erfolgte für 0,5- 2 Stunden. Nach der Entwicklung des Röntgenfilms war das Ergebnis der Hybridisierung zu sehen.