Das Ntr- System

Das Ntr- System (nitrogen regulatory system) ist ein System zur Stickstoff- Regulierung in der Zelle und somit zur Kontrolle des Stickstoff- Status. Am ausgiebigsten wurde es an Enterobakterien erforscht (MERRICK u. EDWARDS 1995).

Es setzt sich zusammen aus vier Enzymen, die eine Enzymkaskade bilden:

Uridyltransferase/Uridyl-removing- Enzym (Utase/UR), welches durch glnD kodiert wird, dem Protein PII, welches durch glnB kodiert wird, der Histidin Protein Kinase NtrB, welches durch ntrB (=glnL) kodiert wird und dem

Transkriptionsaktivator NtrC, welcher durch ntrc (=glnG) kodiert wird (MERRICK u.

EDWARDS 1995). Das Ntr- System ist in seinem ursprünglichem Zustand inaktiv; es wird erst bei Bedarf aktiviert.

Abbildung 2: Stickstoffassimilation bei Bakterien; Quelle: Eigene Darstellung Periplasma

Die Verfügbarkeit von fixiertem Stickstoff in der Zelle spiegelt sich in dem

intrazellulären Verhältnis von Glutamin zu α-Ketoglutarat wieder: ein hohes Glutamin/

α-Ketoglutarat- Verhältnis lässt auf eine ausreichende Menge Ammonium in der Zelle schließen. Ein Ammonium- Mangel dagegen wird durch ein niedrigeres Verhältnis signalisiert (MERRICK u. EDWARDS 1995). Glutamat scheint bei der Signalisierung des Stickstoff- Status keine Rolle zu spielen (GOSS et al. 2001).

Utase/UT fungiert als Messfühler für den Glutamin- und α-Ketoglutaratspiegel. Das Enzym misst das Verhältnis beider Komponenten zueinander und setzt anschließend entsprechend seinem Ergebnis eine Enzymkaskade in Gang.

Aktivierung des Ntr- Systems

Die UTase- Aktivität wird bei niedrigem Glutaminspiegel und hohem

α-Ketoglutaratspiegel stimuliert; in diesem Fall katalysiert es die Uridylierung (Einfügen einer UMP- Einheit) von PII.(siehe Abbildung 3) Das Protein PII -UMP katalysiert darauf hin die Deadenylierung (Entfernen einer AMP- Einheit) des inaktiven GS- AMP durch Stimulation der Adenyltransferase. Die GS wird aktiv und synthetisiert Glutamin (siehe Abbildung 4).

Abbildung 3: Das Ntr- System;

Quelle:MERRICK u. EDWARDS 1995

Parallel dazu signalisiert PII -UMP Stickstoffmangel und beeinflusst mit diesem Signal die NtrB- Aktivität, in dessen Folge NtrC phosphoryliert wird. NtrC-P aktiviert im letzten Schritt die Transkription von Stickstoff- regulierten Promotoren (MERRICK u. EDWARDS 1995).

Die Hemmung des Ntr- Systems

Die UR- Aktivität wird bei hohen Glutaminspiegel und niedrigem α-Ketoglutarat-Spiegel stimuliert; dabei kommt es zur Deuridylierung von PII -UMP (Entfernen einer UMP- Einheit). PII stimuliert nun zum Einen die Adenylierung und damit die

Inaktivierung von GS durch die Adenyltransferase und zum Anderen signalisiert es dem NtrB Stickstoffüberschuß. NtrB katalysiert auf dieses Signal hin die

Dephosphorylierung von NtrC-P. Die Transkription von Stickstoff- regulierten Promotoren kann nun nicht mehr stattfinden, da nur die phosphorylierte Form von NtrC ist in der Lage, die Transkription zu aktivieren (MERRICK u. EDWARDS 1995).

In Enterobakterien unterliegen nach gegenwärtigem Wissensstand folgende Gene der Kontrolle des Ntr- Systems:

das Ammonium- Transportsystem amt, das Arginin- Transportsystem argT, die Glutaminsynthetase glnA, das Glutamin- Transportsystem glnHPQ, das

Abbildung 4: Die Regulierung von GS durch das Ntr- System;

Quelle:RHODES 2004

Histidin- Transportsystem hisJQMP, die für die Nitrat- und Nitritassimilation

benötigten Gene nasFEDCBA, bei K. aerogenes das für die Stickstoff- Regulierung zuständige Gen nac und bei K. pneumoniae die für die Regulierung der Stickstoff- Fixierung benötigten Gene nifLA. (MERRICK u. EDWARDS 1995)

nasFED kodiert dabei für ein Transportsystem für Nitrat und Nitrit, nasCA kodiert für eine assimilatorische Nitratreduktase und nasB kodiert für eine assimilatorische Nitritreduktase (WU u. STEWART 1997).

2.5.1 Die Regulation des Ammonium- Transporters amtB

Bei E. coli konnte die Regulation des Ammonium-Transportsystem durch das Ntr- System nachgewiesen werden. Da dieses System einen höchst empfindlichen Mechanismus bildet, den Ammoniumfluss in die Zelle zu kontrollieren und die Verbindung von amtB zu glnK, welches ein Protein der PII - Familie kodiert, ausnahmslos erhalten geblieben ist, liegt die Vermutung nahe, dass dieser

Regulationsmechanismus in allen Prokaryonten stattfinden könnte. Eine Regulation des Amt- Proteins durch Interaktion mit intrazellulären Signal- Proteinen für

Eukaryonten wird diskutiert (JAVELLE et al. 2003).

In E. coli geschieht die Regulation des AmtB- Protein durch Bildung, bzw. Auflösen eines Komplexes mit GlnK. Diese Regulation wird dabei über die

Uridylierung/Deuridylierung von GlnK als direkte Antwort auf den intrazellulären Glutaminspiegel vermittelt (JAVELLE et al. 2003) (siehe Abbildung 5)

Bei einem niedrigen Ammoniumspiegel von 5 µM oder weniger gelangt das Ammonium über den AmtB- Transporter in die Zelle und wird mittels der

Glutaminsynthetase zu Glutamin umgesetzt. Da der Glutaminspiegel noch niedrig ist, uridyliert die Utase GlnK und PII.(= GlnB). NtrB phosphoryliert daraufhin NtrC und die NtrC- abhängige Gen Expression wird aktiviert.

Bei einem hohen Ammoniumspiegel von über 50µM gelangt das Ammonium zunächst ebenfalls über den AmtB- Transporter in die Zelle und wird zu Glutamin umgesetzt. Steigt nun der intrazelluläre Glutaminspiegel übermäßig an, so reagiert das Ntr- System, indem UT GlnK und PII deuridyliert. Als Folge bildet GlnK einen Komplex mit AmtB und inaktiviert es auf diese Weise; der Ammoniumfluss in die Zelle wird unterbrochen. In einem solchen Fall kann Ammonium nur noch durch Diffusion oder ein unidentifiziertes Transportsystem mit niedriger Affinität zu Ammonium in die Zelle gelangen.

Gleichzeitig dephosphoryliert NtrB das NtrC- Protein und hemmt so die NtrC- abhängige Gen- Expression.

2.5.2 Die Stickstoff- Regulierung durch das Gen nac

Bei K. aerogenes unterstehen folgende Enzyme der Kontrolle des durch nac kodierten Proteins Nac:

die Histidase (hut), die Prolin Oxidase (put), die Urease (ure), die Glutamatdehydrogenase (gdh) und die Glutamatsynthase (gltBD).

Abbildung 5: Das Ammoniumtransport- System und sein Eingliederung in das Ntr- System; Quelle: JAVELLE et al. 2003

Die Expression von nac ist Stickstoff- reguliert, da nur das phosphorylierte und damit aktivierte NtrBC-P des Ntr- Systems die Transkription des nac- Promotors aktivieren kann. Das bedeutet, das Nac nur unter Stickstoff- limitierenden Bedingungen (Signal

„Glutaminmangel“ in der Zelle) exprimiert wird. Nac aktiviert die Gene hut, put und ure, bzw. hemmt die Expression von gdh und gltBD (SCHWACHA u. BENDER 1993;

MERRICK u. EDWARDS 1995).

Auf diese Weise wird sichergestellt, dass der Mangel an Glutamin schnellstmöglich behoben wird: bei aktiviertem Ntr- System katalysiert die Histidase zum Beispiel die Metabolisierung von Histidin in Glutamat und Ammonium. Die Urease katalysiert die Umsetzung von Harnstoff in Kohlenstoffdioxid und Ammoniak. Die Prolin Oxidase katalysiert die Umwandlung von Prolin in Glutamat. Gleichzeitig wird durch die Hemmung der Expression von gdh und gltBD verhindert, dass Glutamin durch die Aktivität des GltBD und Ammonium durch GDH verbraucht wird. Die genannten Reaktionen gewährleisten damit, dass genügend Ammonium als Substrat für die Glutaminsynthetase zur Verfügung steht und Glutamin synthetisiert werden kann.

nac wurde zuerst in K. aerogenes beschrieben, ist aber auch in K. pneumoniae und E. coli vorhanden (MERRICK u. EDWARDS 1995); die Funktion in E. coli ist jedoch noch nicht hinreichend geklärt.

In anderen Organismen, wie zum Beispiel in Mykobakterien, ist nac (noch) nicht identifiziert worden.