Robustheit der Methode

Organische Lösungsmittel in der Probe hatten einen deutlichen Einfluss auf den Test. Die Kalibrierkurven veränderten sich in dreierlei Hinsicht. Die Signalstärke (A-Wert) nahm mit steigendem Lösungsmittelanteil ab, gleichzeitig stieg der Testmittelpunkt (C-Wert) an (s. Abbildung 29). Außerdem nahm das Hintergrundsignal (D-Wert) ab. Acetonitril hatte dabei einen deutlich stärkeren Einfluss auf den Test als Methanol.

0 5 10 15

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0 5 10 15

0,0 0,5 1,0 5

D

OD

Volumenanteil [%]

Methanol Acetonitril

A

Testmittelpunkt [µg/L]

Volumenanteil [%]

Abbildung 29: Einfluss des Volumenanteils von Methanol und Acetonitril in einer Probe auf die obere (A) und untere (D) Asymptote sowie den Wendepunkt der Kalibrierkurve des CBZ-ELISAs; ELISA wurde bei pH 7,6 durchgeführt (ELISA Methode A).

Die Abnahme der Signalintensität ist hauptsächlich auf die Denaturierung der eingesetzten Proteine zurückzuführen. Die Änderung des Testmittelpunktes ist vermutlich auf eine Interaktion des organischen Lösungsmittels mit den Liganden und der daraus resultierenden geringeren Affinitätskonstanten des Antikörpers zurückzuführen.

Bei der Quantifizierung von CBZ in Gewässern hat das Vorhandensein von organischen Lösungsmitteln Einfluss auf die Genauigkeit. Die Erhöhung des Testmittelpunkts führt zu einer Unterbestimmung, die Abnahme von Signalstärke und Hintergrundsignal zu einer Überbestimmung der Analytkonzentration. Abhängig von der Analytkonzentration können sich diese Einflüsse gegenseitig aufheben (s. Abbildung 30). Bei einer Konzentration von 2,5 % Methanol oder 0,5 % Acetonitril beträgt die Abweichung im Bereich zwischen 0,05 und 2 µg/L weniger als 25 % und ist für die meisten Anwendungszwecke akzeptabel. In Trinkwasser und kommunalen Abwässern besteht kaum Gefahr, dass diese Werte überschritten werden.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 50 100 150 200

250 0.5% Methanol

2.5% Methanol 12.5% Methanol 0.5% Acetonitril 2.5% Acetonitril

Wiederfindungsrate [%]

CBZ-Konzentration [µg/L]

Abbildung 30: Simulierte Wiederfindungsrate von lösungsmittelhaltigen Standardlösungen bezogen auf lösungsmittelfreie Kalibrierlösungen, in Abhängigkeit von der Analytkonzentration.

Besteht Verdacht, dass in einer Probe aufgrund von vorhandenen Lösungsmitteln eine zu hohe Konzentration gemessen wird, kann durch Verdünnung der Probe die Richtigkeit des Messergebnisses verbessert werden. Um die Denaturierung der Proteine zu verhindern bietet es sich darüber hinaus an, die Kontaktzeit durch eine verkürzte Inkubationszeit zu vermindern. Gegebenenfalls ist hierbei eine Erhöhung der Tracerkonzentration nötig, um die Signalstärke aufrechtzuerhalten.

Darüber hinaus wurde der Einfluss einiger weiterer potentiell störender Stoffe untersucht:

Fe(II)-Ionen, die im Grundwasser vor der Trinkwasseraufbereitung häufig in hohen Konzentrationen vorliegen, haben auf den CBZ-ELISA keinen signifikanten Einfluss [305].

Tests mit synthetischen Huminsäuren zeigten bis zu einer Konzentration von 10 mg/L einen vernachlässigbaren Effekt auf den CBZ-ELISA [306]. Die Zugabe von BSA, das im Ruf steht etwaige Störungen durch Huminsäuren und ähnliche Stoffe verringern zu können [247, 307], führte zu keiner Verschlechterung des Tests, außer einer Erhöhung des Testmittelpunktes um ca. 50 % [306]. Dieser Effekt trat nur bei pH 10,5 und nicht bei pH 7,6 auf. Offenbar liegt bei pH-Wert 10,5 ein Teil des CBZ an BSA gebunden vor. Unter neutralen und basischen Bedingungen ist die Bindung zwischen CBZ und BSA vermutlich zu schwach oder sie

geschieht deutlich langsamer als die Bindung an den Antikörper. BSA wurde zu Beginn der vorliegenden Arbeit (ELISA-Methode A) als Pufferzusatz verwendet. Später wurde jedoch darauf verzichtet (ELISA-Methode B), da BSA wegen seiner Neigung zur Schaumbildung schwierig zu pipettieren war und dabei kaum Vorteile bot.

Der Einfluss von Detergentien auf den ELISA war gering. Der Zusatz von Polysorbat 20 (Tween20) führte bis einschließlich der getesteten Höchstkonzentration von 0,5 % zu keinerlei messbaren Veränderungen des Tests. Auch eine Verbesserung der Sensitivität, wie für einen anderen ELISA nach Zugabe von 0,1 % Tween berichtet wurde [308], konnte nicht festgestellt werden.

4.3.8 Plattenkonservierung

Die Beschichtung der Mikrotiterplatte mit Antikörpern macht einen erheblichen Teil des Aufwands und der Arbeitszeit aus. Dieser Arbeitsschritt wird in der Regel direkt vor der Testdurchführung vorgenommen, kann jedoch durch eine Konservierung der Platte ausgelagert werden, wodurch ein flexiblerer Einsatz des ELISAs möglich wird.

Daher wurde eine von Kolosova et al. vorgeschlagene Konservierungsmethode für den CBZ-ELISA getestet [309]. Um Kosten zu sparen, wurde dabei das ursprüngliche Rezept für die Konservierungslösung verdünnt, wodurch sich keine messbare Verschlechterung der Konservierung ergab. Die Kosten der Konservierung konnten dadurch von 5 Euro auf 40 Cent pro Platte verringert werden.

Die konservierten Platten wurden über einen Zeitraum von 12 Wochen bei 4°C gelagert und im Abstand von zwei Wochen mit einer frisch beschichteten Platte verglichen. Das Signal der konservierten Platten blieb dabei relativ konstant in einem OD-Bereich von 0,6-0,8 (s. Abbildung 31a). Die an verschiedenen Tagen frisch beschichteten Platten lieferten deutlich stärkere Signalschwankungen als die konservierten Platten, die alle am gleichen Tag beschichtet wurden. Dies ist ein Indiz dafür, dass schon kleinere Abweichungen beim Beschichtungsprozess (z. B. Konzentration, Temperatur, Ozonkonzentration in der Luft, etc.) einen erheblichen Einfluss auf das Endsignal im ELISA haben können.

Ebenso wichtig wie die Signalstärke ist die Homogenität der Platten, die durch die gleiche Behandlung aller 96 Kavitäten überprüft wurde. Der Variationskoeffizient der konservierten Platten lag dabei mit durchschnittlich 3,5 % nur geringfügig höher als derjenige der frisch beschichteten Platten (3,2 %).

In einem weiteren Experiment wurde die Langzeitstabilität durch eine 5-wöchige Lagerung bei 40°C im Trockenschrank simuliert. Dabei wurden immer noch 73 % des Signals einer frisch beschichteten Platte erreicht. Der Variationskoeffizient der 96 Kavitäten betrug 3,2 % und war damit nur unwesentlich höher als bei der Referenzplatte. Unter der Annahme, dass bei 40°C im Trockenschrank dieselben Zersetzungsreaktionen ablaufen wie bei 4°C im Kühlschrank, lässt sich mit Hilfe der Arrhenius-Gleichung die Lagerungsfähigkeit im Külschrank extrapolieren. Eine 5-wöchige Lagerung bei 40°C entspricht hiernach ungefähr einer 60-wöchigen Lagerung bei 4°C. Somit erscheint die Lagerung der Platten für ein Jahr oder länger möglich.

Zu erwähnen ist, dass bei einer ungeschützten Lagerung im Kühlschrank schon nach wenigen Wochen einige Kavitäten sehr starke Signaleinbußen zeigten. Offenbar war Feuchtigkeitsbildung hierfür der Grund, da dieses Problem bei der Lagerung in einem geschlossenen Gefäß mit einer kleinen Menge Trockenmittel nicht auftrat.

Bei der Quantifizierung von Gewässerproben wurde hinsichtlich der bestimmten Konzentrationen kein signifikanter Unterschied zwischen einer frisch beschichteten und einer konservierten Platte gefunden.

Konservierte Platten wurden in dieser Arbeit gelegentlich verwendet und insbesondere dann, wenn nur wenige Proben zu messen waren.

2 4 6 8 10 12

0,0 0,5 1,0 1,5

2 4 6 8 10 12

0 2