Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT- PCR)

Die Anwendung technisch hochempfindlicher Nachweisverfahren der mRNA-Expression, wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erlaubt es, einzelne Gentranskripte in präimplantatorischen Rinderembryonen darzustellen. Für dieses Verfahren sind bereits sehr geringe Mengen des zu untersuchenden Materials ausreichend (CLAUDE et al. 2002). Während der RT-PCR wird eine bestimmte mRNA-Sequenz aus einzelnen Embryonen amplifiziert und die bei konstanten Reaktionsparametern erhaltene Amplikonmenge quantifiziert. Dadurch kann man einen Einblick in die Häufigkeit der entsprechenden Gentranskripte in den jeweils analysierten Embryonen erhalten (SALOMON 1995; WRENZYCKI et al. 1999).

Die Methode ist sehr sensitiv und ermöglicht aus einzelnen Blastozysten bis zu zehn verschiedene Gentranskripte gleichzeitig darzustellen. Anwendung von externen oder internen Standards ermöglicht eine semi-quantitative Quantifizierung. Während der Real-Time-PCR kann im Gegensatz zur Endpunkt-RT-PCR der Verlauf der Amplifikationsreaktion aufgezeichnet werden (GIULIETTI et al. 2001; PRELLE et al.

2001). Für die Untersuchung von mRNA-Sequenzen und damit der Aktivität eines Gens ist es notwendig, diese mittels reverser Transkription in komplementäre DNA (cDNA) umzuschreiben. Die während der reversen Transkription umgeschriebene cDNA dient als Ausgangsmaterial in der Polymerasekettenreaktion und wird während der PCR-Zyklen amplifiziert. Die Erststrangsynthese von cDNA aus RNA ist der erste Schritt und Ausgangspunkt für die RT-PCR-Analyse einzelner Gene. Zudem werden auch cDNAs benutzt, um cDNA-Arrays herzustellen oder Proben für die Array-Hybridisierung zu generieren.

2.4.1.1 Reverse Transkription (RT)

Eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) katalysiert die Reaktion, bei der zu einem jeweiligen RNA-Strang der komplementäre DNA-Strang gebildet wird. Das Enzym wurde erstmals in Retroviren entdeckt. Inzwischen wurden Reverse Transkriptasen aus verschiedensten Organismen isoliert, wie die Reversen Transkriptasen des avian myeloblastosis virus (AMV), des Moloney murine leukemia virus (MMLV) und die thermostabilen RTs von Thermus thermophilus oder Thermus

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flavus. Für die Umschreibung der mRNA in cDNA benötigt die Reverse Transkriptase einen Primer, der als Startpunkt dient. Es können verschiedene Primertypen angewendet werden. Oligo(dT)-Primer sind 12-18 Nukleotide kurz, die an eine Abfolge von Adenin-Nukleotiden am Poly(A)-Ende eukaryontischer mRNAs spezifisch binden (RAPPOLEE et al. 1988). Beim locusspezifischen Primer, der an einer spezifischen Stelle der mRNA bindet, wird nur die komplementäre Sequenz umgeschrieben (KAWASAKI 1990). Beim Random-Priming werden Primer, die ein Gemisch aus allen möglichen Sequenzabfolgen beinhalten und aus sechs bis zehn Nukleotiden bestehen und degeneriert sind, verwendet.

2.4.1.2 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die PCR ist eine In-vitro-Technik zur Vermehrung eines spezifischen DNA-Fragmentes, das zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt (SAIKI et al. 1985; MULLIS u. FALOONA 1987). Als Primer dienen kurze Oligonukleotide, die gegenläufig an komplementäre DNA-Stränge binden und die Zielsequenz flankieren. Die DNA-Polymerase heftet Nukleotide an die 3’-OH-Primer –Enden und synthetisiert komplementäre DNA-Strang (KNIPPERS 2001).

Dadurch entsteht die doppelsträngige DNA. Als erstes wurde das Klenow-Fragment der E.coli DNA-Polymerase in einer PCR angewendet. Der Nachteil dieses Enzyms war, dass es während des Denaturierungsschrittes inaktiviert wurde (EHRLICH et al.

1988). Am häufigsten werden heute thermostabile DNA-Polymerasen wie z.B. die Taq-DNA-Polymerase von Thermus aquaticus, die ein Temperaturoptimum bei 72°C aufweist, eingesetzt (SAIKI et al. 1988; BLOCH 1991).

Ein Temperaturzyklus besteht aus den Schritten: Denaturierung (97°C), Annealing (spezifisch für jedes Primerpaar, 50-70°C) und Elongation (72°C), während die DNA exponentiell vermehrt wird. Das amplifizierte PCR-Produkt kann quantifiziert werden, wobei zwei grundsätzliche Prinzipien unterschieden werden können: die Endpunkt- und die Real-Time-Analyse.

39 2.4.1.2.1 Endpunkt-RT-PCR

An die Synthese der cDNA im RT-Schritt schliesst sich eine PCR zur Amplifizierung der cDNA an. Damit sich semi-quantitative Unterschiede zwischen verschiedenen Proben in der Menge des PCR-Produktes darstellen lassen, muss die PCR-Reaktion gestoppt werden, bevor sie die sogenannte Plateau-Phase erreicht. Bei welcher Zyklenzahl diese Phase auftritt, ist von den Reaktionsbedingungen abhängig und muss für jede eingesetzte mRNA getestet werden. In der Vergangenheit wurde die RT-PCR-Methode wegen der schwierigen Standardisierung häufig nur zum Nachweis der Anwesenheit eines Produktes verwendet (qualitativer Nachweis).

Modifizierte RT-PCR-Protokolle können zur Analyse der relativen Transkripthäufigkeit verwendet werden (Mc PHERSON u. MØLLER 2000). Bei der Endpunkt-RT-PCR werden die PCR-Produkte nach Abschluss der Reaktion untersucht (FREEMAN et al.

1999b). Durch Verwendung spezifischer Primer für beide DNA-Stücke kann der zwischen diesen Primern liegende DNA-Abschnitt spezifisch amplifiziert werden.

Quantifizierung derartiger Amplifikate kann Hinweise auf die Menge der eingesetzten Nukleinsäuren im Ausgangsmaterial liefern (SALOMON 1995; BUSTIN 2000).

Amplifizierung einer bestimmten mRNA-Sequenz aus einzelnen Embryonen und deren Quantifizierung bei konstanten Amplifikationsbedingungen können damit Hinweise auf die Häufigkeit des entsprechenden Transkriptes im analysierten Embryonen liefern (WRENZYCKI et al. 1999, 2000, 2001a). Um zu aussagekräftigen Ergebnissen zu bekommen, müssen mehrere Wiederholungen durchgeführt werden.

Nach einer PCR kann eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA oder DNA durch die Bestimmung der Intensität der Banden im Agarose-Gel erfolgen.

Die Quantifizierung erfolgt meist semi-quantitativ, d.h. sie wird auf einen externen oder internen Standard bezogen. Bei Verwendung eines internen Standards (kompetitive PCR) erfolgt die Koamplifizierung eines DNA-Fragmentes, das als interner Standard dient und in den PCR-Ansatz gegeben wird. Als sogenannter interner Standard dient eine definierte Menge eines Templates, die mit dem gleichen Primerpaar unter denselben Reaktionsbedingungen amplifiziert werden kann (MÜLHARDT 2003). Während mehrerer Amplifikationsrunden werden unterschiedliche Mengen an Standard und die gleiche Menge der zu untersuchenden

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Probe eingesetzt und nach gelelektrophoretischer Trennung die Werte miteinander verglichen (MÜLHARDT 2003; ALDAPE et al. 2002). Das Gen, das als externer DNA-Standard dient, wird mit einem anderen Primer amplifiziert, dessen Ausgangs-Menge bekannt ist. Nach Ablauf einer Reaktion wird die Ausgangs-Menge an Template und DNA-Standard errechnet (FREEMAN 1999a). Häufig werden als externer Standard die Haushaltsgene (Housekeeping gene) eingesetzt, von denen angenommen wird, dass sie in den untersuchten Ansätzen in einer konstanten Menge exprimiert werden.

Die Menge des untersuchten Produktes wird dann auf dieses Haushaltsgen, dessen Menge konstant gehalten war, bezogen. Bei der Quantifizierung der RNA bei Embryonen können Haushaltsgene nur bedingt als Standard eingesetzt werden.

Grundsätzlich bleibt das Problem, dass die konstante Expression der Haushaltsgene auch beim präimplantatorischen Embryo sehr häufig betroffen ist. Deswegen wurde für die Quantifizierung bei Embryonen Kaninchen-Globin-mRNA als exogen hinzugegebener Standard eingesetzt. Der relative Transkriptgehalt für jedes Gen wird als Verhältnis aus der Intensität der Bande für das Zielgen und der Intensität der entsprechenden Bande für die Kaninchen-Globin-mRNA errechnet (WRENZYCKI et al. 2004a).

2.4.1.2.2 Real-Time-RT-PCR

Mit der Entwicklung der Real-Time-PCR wurde ein schnelles und vollautomatisiertes Verfahren für Nachweis und Quantifizierung von mRNA etabliert, das den Anstieg des PCR-Produkts fortlaufend in jedem Zyklus aufzeigt. In einem geschlossenen System sind in einem Schritt Amplifikation, Detektion und Quantifizierung so kombiniert, dass nach der PCR keine weiteren Schritte mehr erforderlich sind (GIBSON et al. 1996; GIULIETTI et al. 2001). In Gegensatz zur Endpunkt-RT-PCR wird hier kein Endprodukt, sondern das entstehende Produkt im Verlauf der PCR untersucht (FREEMAN et al. 1999b). Der Nachweis der Genexpression mittels Real-Time-RT-PCR ist heute ein wichtiger Bestandteil vieler Untersuchungen.

Die Technik findet bereits in vielen klinischen Bereichen Anwendung, z.B. für genetische Analysen bei Brustkrebs (BIECHE et al. 2000) sowie zur Bestimmung der mRNA-Expression in präimplantatorischen Embryonen (STEUERWALD et al. 1999;

STEUERWALD et al. 2000). Die Methode erlaubt die direkte Detektion der

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Produkte über Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluoreszenz-markierte Sonden, die in bestimmten Schritten des PCR-Zyklus an die Ziel-DNA binden. Verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Fluoreszenz-markierte-Sonden stehen zur Verfügung.

SYBR Green I ist ein fluoreszierender Farbstoff, ein sogenannter Interkalator, der an jede doppelsträngige DNA bindet (MORRISON et al. 1998). Interkalatoren emittieren unter Anregung von kurzwelligem UV-Licht längerwelliges Licht. Bei Anwendung von

„Molecular Beacons“ und TaqMan-Sonden (TYAGI u. KRAMER 1996) handelt es sich um sequenzspezifische Oligonukleotide, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt sind (TAVEAU et al. 2002). Die Sonden werden mit verschiedenen Farbstoffen markiert, die als „reporter“ und „quencher“ beziehungsweise Donator und Akzeptor von Energie funktionieren. Die Funktion dieser Sonden basiert auf einem Energietransfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). Wenn es zur Interaktion zwischen beiden Oligonukleotiden kommt, ändert sich die Fluoreszenz der Moleküle und ein Signal wird detektiert (JU et al. 1995). Heute steht eine wachsende Anzahl von Real-time-PCR-Systemen zur Verfügung, wie ABI Prism 7700 SDS (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) oder Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Die Real-time-RT-PCR ermöglicht neben relativen Quantifizierungsstrategien auch die absolute Quantifizierung mit der Anwendung externer Standards (PFAFF 2001). Als externer Standard wird die cDNA benutzt, die die Sequenz des untersuchten Gens besitzt. Es werden Standardreihen gleichzeitig mit den untersuchten Proben mitgeführt, um eine Standardkurve zu erstellen und so die absoluten Werte für die Ausgangskonzentrationen unbekannter Proben zu ermitteln. Beim Nachweis des relativen Gehalt des untersuchten Gens wird ein interner Standard eingesetzt und das Verhältnis im Vergleich zu diesem Referenzgen berechnet (BUSTIN 2000).