Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Braunschweig
Messenger RNA-Expressionsprofile histon-assoziierter Gene in präimplantatorischen Rinderembryonen und Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene in einem High-density-cDNA-Microarray
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer
D O K T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Monika Anna Nowak-Imiałek aus Olsztyn/Polen
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
2. Gutachter: Prof. Dr. O. Distl
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2005
Die vorliegende Arbeit wurde von der H. WILHELM SCHAUMANN-Stiftung gefördert.
Diese Arbeit widme ich Diese Arbeit widme ich Diese Arbeit widme ich Diese Arbeit widme ich
meinem Vater meinem Vater meinem Vater meinem Vater Prof. Dr
Prof. Dr Prof. Dr
Prof. Dr.... hab. GRZEGORZ NOWAK hab. GRZEGORZ NOWAK hab. GRZEGORZ NOWAK hab. GRZEGORZ NOWAK (1946
(1946 (1946
(1946- - - -2002) 2002) 2002) 2002)
1 EINLEITUNG 1
2 SCHRIFTTUM 4
2.1 Genexpressionen bei eukaryontischen Zellen 4
2.1.1 Transkription 5
2.1.2 Translation 7
2.2 Epigenetische Genregulation 8
2.2.1 Imprinting 9
2.2.2 DNA-Methylierung 12
2.2.3 X-Chromosom-Inaktivierung 13
2.2.4 Regulation der Telomerlänge 14
2.2.5 Histonmodifizierungen 17
2.2.5.1 Histonacetylierung 18
2.2.5.2 Histonmethylierung 20
2.2.6 Zusammenhang zwischen Histonmodifikationen und DNA-Methy-
lierung im „Chromatin-Remodeling“ 21
2.3 Genexpression bei präimplantatorischen Embryonen 25 2.3.1 Gene, die an Histonmodifikationen beteiligt sind 26 2.3.1.1 Histonacetyltransferasen (HATs): Histone acetyltransferase 1 (HAT1)
und General control of amino-acid synthesis protein 5-like 2 (GCN5) 26 2.3.1.2 Histondeacetylasen (HDACs): Histone deacetylase 2 (HDAC2) 27 2.3.1.3 Histonmethyltransferasen (HMTs): Suppressor of variegation 3-9
homolog 1 (SUV39H1), HLA-B associated transcript 8 (G9A, BAT8)
und Nicht-Histon-Protein: Heterochromatin Protein 1 (HP1) 28 2.3.2 Maternale Gene: Zygote arrest 1 (ZAR1) und Maternal antigen that
embryos require (MATER) 30
2.3.3 Imprinted Gene: Paternally expressed gene 3 (PEG3) 31
2.3.4 Pluripotenz-spezifische Gene: Homeobox transcription factor Nanog
(NANOG) 33
2.4 Methoden zur Erstellung von Genexpressionsprofilen bei
Embryonen 36
2.4.1 Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT- PCR) 37
2.4.1.1 Reverse Transkription (RT) 37
2.4.1.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) 38
2.4.1.2.1 Endpunkt-RT-PCR 39
2.4.1.2.2 Real-Time-RT-PCR 40
2.4.2 Microarray-Technologie 41
2.4.2.1 Grundlagen und Anwendung der cDNA-Array-Technologie 42 2.4.2.2 Herstellungsprozess und Ablauf einer cDNA-Array-Analyse 43 2.4.2.3 Grenzen und Probleme der cDNA-Array-Analyse bei präimplantato-
rischen Embryonen 45
3 MATERIAL UND METHODEN 47
3.1 Erstellung von Rinderembryonen verschiedener Herkunft 47
3.1.1 In vivo produzierte bovine Blastozysten 47
3.1.2 In vitro produzierte bovine Embryonen 48
3.1.2.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOKs) und In-vitro-
Maturation (IVM) 48
3.1.2.2 In-vitro-Fertilisation (IVF) 49
3.1.2.3 In-vitro-Kultur (IVC) und Medien 49
3.1.3 Erstellung parthenogenetischer Rinderembryonen 53 3.1.4 Erstellung androgenetischer Rinderembryonen 53 3.1.5 Erstellung geklonter Rinderembryonen durch Kerntransfer (NT) 53
3.2 Nachweis der mRNA-Expression einzelner Gene in präimplan- tatorischen Rinderembryonen mit Hilfe eines semi-quantita-
tiven Endpunkt-RT-PCR-Assays 55
3.2.1 Extraktion der mRNA 56
3.2.1.1 Lösungen zur mRNA-Extraktion aus Embryonen 56
3.2.1.2 Messenger RNA-Extraktion aus Embryonen 57
3.2.2 Reverse Transkription (RT) 57
3.2.2.1 Lösungen und Reagenzien 57
3.2.2.2 Herstellung der Reaktionsgemische und Ablauf der reversen
Transkription (RT) 58
3.2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 59
3.2.3.1 Lösungen und Reagenzien 59
3.2.3.2 Herstellung der Reaktionsgemische für die PCR 60 3.2.3.3 Primer und Temperaturbedingungen für PCR 61
3.2.3.4 Kontrollen in der RT-PCR 63
3.2.4 Gelelektrophorese und Quantifikation der RT-PCR Produkte 63
3.2.4.1 Lösungen und Reagenzien 63
3.2.4.2 Elektrophorese 64
3.2.4.3 Quantifizierung der RT-PCR Produkte 64
3.2.4.4 Verifizierung von RT-PCR-Produkten aus Agarose-Gelen 65
3.3 Statistische Auswertungen 65
3.4 Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer
Gene in einem High-density-cDNA-Microarray 66
3.4.1 Herstellungsprozess von cDNA-Microarrays 66
3.4.2 Extraktion der Gesamt-RNA 67
3.4.3 Markierung und Array-Hybridisierung 67
3.4.4 Scannen der Arrays und Datenanalyse 68
3.4.5 Bestätigung der Arrayergebnisse mittels RT-PCR 68
3.5 Allgemeiner Versuchsaufbau 70
4 ERGEBNISSE 72
4.1 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen 72
4.2 Optimierung der PCR-Parameter für ausgewählte Gene 72 4.2.1 Optimierung der PCR-Bedingungen für die Gene ZAR1, HDAC2,
SUV39H1, G9A, HP1, HAT1 75
4.2.1.1 Bestimmung der optimalen Annealingtemperatur 75
4.2.1.2 Optimierung der Zyklenzahl 75
4.2.1.3 Einsatz von Embryonenäquivalenten 79
4.2.1.4 Bestimmung der optimalen MgCl2-Konzentration 83
4.2.1.5 Einsatz von Dimethylsulfoxid (DMSO) 84
4.2.1.6 Darstellung der mRNA-Expression für die Gene ZAR1, HDAC2, SUV39H1, HP1, G9A und HAT1 in in vitro produzierten Rinder-
embryonen 85
4.2.2 Versuche zur Optimierung der PCR-Bedingungen für die Gene
MATER, NANOG, PEG3, GCN5 88
4.3 Nachweis und Quantifizierung der Transkriptmengen in bovinen
Embryonen unterschiedlicher Herkunft 90
4.3.1 Expression der mRNA des ZAR1-Gens 90
4.3.2 Expression der mRNA des HDAC2-Gens 93
4.3.3 Expression der mRNA des SUV39H1-Gens 96
4.3.4 Expression der mRNA des G9A-Gens 99
4.3.5 Expression der mRNA des HP1-Gens 102
4.3.6 Expression der mRNA des HAT1-Gens 105
4.4 Eignung eines humanen cDNA-Microarrays für Cross-species- Hybridisierung und Verifizierung der Genexpression mittels
Endpunkt-RT-PCR-Analyse 108
5 DISKUSSION 112 5.1 Genexpressionanalyse bei präimplantatorischen Rinder-
embryonen unterschiedlicher Herkunft 113
5.2 Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner ortho-
loger Gene in einem High-density-cDNA-Microarray 118
5.3 Schlussfolderungen 120
6 ZUSAMMENFASSUNG 122
7 SUMMARY 128
8 LITERATURVERZEICHNIS 133
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 171
10 VERZEICHNIS DER TABELLEN UND ABBILDUNGEN 173
1 1 EINLEITUNG
Untersuchungen auf Transkriptionsebene bei präimplantatorischen Säugerembryonen können wertvolle Hinweise auf Entwicklungskompetenz, physiologischen Status sowie Überlebensfähigkeit der untersuchten Embryonen liefern. Damit ist es möglich, einen Einblick in die Regulation der Expression zahlreicher Gene während der frühen Embryonalentwicklung zu erhalten. Die Verwendung von in vitro produzierten Embryonen hat in den letzten Jahren erheblich an Bedeutung gewonnen, nicht nur beim Menschen, sondern auch bei landwirtschaftlichen Nutztieren, insbesondere beim Rind (KATO u. IRITANI 1993; HEYNER u. TUCKER 2000; MOHAN et al.
2004). Trotz zahlreicher methodischer Fortschritte ist diese Technologie sowohl beim Menschen als auch bei Nutztieren noch mit Problemen behaftet (STRÖMBERG et al.
2002; BERTOLINI et al. 2004). In vitro produzierte und/oder durch Kerntransfer erstellte Embryonen weisen deutliche Unterschiede in Entwicklungsgeschwindigkeit, Morphologie, Metabolismus, Zellzahl und Genexpression im Vergleich zu in vivo gewonnenen Embryonen auf. Außerdem wurde nach Transfer in vitro produzierter oder geklonter Embryonen das sogennante „Large Offspring Syndrome“ (LOS) beobachtet (SINCLAIR et al. 2000; McEVOY et al. 2003; HEYMAN 2005).
Vorherrschende Symptome sind verlängerte Trächtigkeitsdauern, erhöhte Abortraten, kongenitale Missbildungen und erhöhte postnatale Sterblichkeit (YOUNG et al. 1998). Als kausale Ursachen bei der Entstehung des LOS werden insbesondere anhaltende Abweichungen vom normalen Genexpressionsmuster, bedingt durch epigenetische Modifikationen während der frühembryonalen Entwicklung vermutet (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000).
Unter Epigenetik werden alle Mechanismen zusammengefasst, die die Aktivität der Gene nicht auf der Ebene der Basensequenz beeinflussen. Epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierungen und Histonmodifikationen sind auch für die Regulation der embryonalen Gentranskription von herausragender Bedeutung (WRENZYCKI et al. 2005a). Neben den DNA-Methyltransferasen sind deshalb insbesondere Gene, die an den Histonmodifikationen beteiligt sind, von besonderem Interesse. Histone dienen nicht nur als Verpackungsmaterial der DNA. Sie können posttranslational auf verschiedene Weise modifiziert sein und in Folge davon das
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Expressionsmuster der Gene verändern. Eine Acetylierung der Histone findet insbesonders im aktiv transkribierten Chromatin (Euchromatin) statt. Durch Histonacetyltransferasen (HAT) werden Acetylreste auf bis zu 4 Lysin-Reste an den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 übertragen. Acetylierungen sind reversibel durch Deacetylasen, die die Bindungsfähigkeit von Aktivierungsfaktoren beschränken und dadurch die Genexpression hemmen. Störungen im Gleichgewicht zwischen Acetylierung und Deacetylierung führen zu Veränderungen in der Expression bestimmter Gene (GRANT u. BERGER 1999; YAMAGOE et al. 2003). Die Anheftung von Methylgruppen an die Aminogruppe der Lysin-Reste bei den Histonen H3 und H4 entscheidet wesentlich darüber, welche Gene bei der Entwicklung an- oder abgeschaltet werden. Aus vorangegangen Untersuchungen ist bekannt, dass das maternale Gen ZAR1 (Zygote arrest1), das ein PHD-Motiv (plant homeodomain motif) trägt, wahrscheinlich an der chromatinvermittelten Transkriptionsregulation beteiligt ist (WU et al. 2003).
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde von Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien aus unterschiedlichen Produktionssystemen das mRNA- Expressionsmuster von Genen, die an kritischen Prozessen der Histonmodifikationen beteiligt sind, untersucht. Die Embryonen wurden nach Standardprotokollen für die In-vitro-Produktion (SOF/BSA oder TCM/Serum), In-vivo-Gewinnung, für somatischen Kerntransfer mit adulten weiblichen oder männlichen Fibroblasten als Spenderzellen, nach parthenogenetischer oder androgenetischer Aktivierung erstellt (LUCAS-HAHN et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2002). Mit Hilfe eines semi-quantitativen Endpunkt- RT-PCR-Assays (WRENZYCKI et al. 1999) wurde der relative Gehalt folgender Gentranskripte, die in der Histondeacetylierung [Histone deacetylase 2 (HDAC2)], Histonacetylierung [Histone acetyltransferase 1 (HAT1)], Histonmethylierung [Histonmethyltransferasen (SUV39H1, G9A)], Heterochromatin-Bildung [Heterochromatin Protein 1 (HP1)] und chromatinvermittelten Transkriptionsregulation [Zygote arrest 1 (ZAR1)] eine wichtige Rolle spielen, in Oozyten, Zygoten, 8-16-Zell-Embryonen sowie in Blastozysten aus den unterschiedlichen Herkünften bestimmt.
3
Im zweiten Teil der Arbeit wurden bovine orthologe Gene auf einem humanen cDNA- Array hybridisiert, um Einblicke in die Brauchbarkeit einer Cross-species- Hybridisierung zu erlangen. Die Analyse von Genexpressionsprofilen ermöglicht Studien zu Auswirkungen einzelner Parameter der In-vitro-Kultur sowie verschiedene Kerntransferverfahren auf den transkriptionellen Status der Embryonen. Zum Nachweis der Genexpression in Embryonen können verschiedene Methoden angewendet werden. Genexpressionsanalysen von in vitro produzierten Embryonen beim Rind haben in den letzten Jahren rasant zugenommen. Durch die Technik der RT-PCR wurde es möglich, die Expression einzelner oder mehrerer Gene in präimplantatorischen Embryonen qualitativ und quantitativ nachzuweisen (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; WRENZYCKI et al. 2005b). Neben dem semi-quantitativen Endpunkt-RT-PCR-Assay zur Bestimmung der relativen Häufigkeit von Gentranskripten können komplexe Expressionsprofile aus biologischen Proben unterschiedlicher Herkunft durch die cDNA-Array-Technologie erstellt werden. Die cDNA-Array- Analyse ermöglicht die Erfassung aller potenziellen Transkripte in einer einzigen Hybridisierungsreaktion. Von kommerziellen Anbietern sind heute verschiedene Arrays entwickelt worden, die über 10.000 Sonden pro Array enthalten. Der Zahl der Sonden pro Array ist dabei nach oben hin theoretisch unbegrenzt (SCHENA et al.
1996; NAKANISHI et al. 2001).
Die erhältlichen Arrays für die Analyse bei höheren Organismen konzentrierten sich bislang auf die Spezies Mensch, Maus und Ratte, also Spezies, deren Genom vollständig und detailliert genug sequenziert worden ist. Da nur ein kleiner Teil des bovinen Genoms zu Beginn dieser Arbeit sequenziert war, war die Erstellung von cDNA-Arrays mit bovinen Sonden stark erschwert. Ein kommerzielles Rinder-cDNA- Array-System war nicht erhältlich. Deswegen wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Brauchbarkeit eines humanen cDNA-Microarrays für den Nachweis von mRNA- Expression im Rindergewebe geprüft. Die Untersuchungen zur Eignung der Cross- species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene wurden in einem High- density-cDNA-Microarray durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass zwischen Spezies bei Einhaltung geeigneter methodischen Konditionen aussagekräftige Expressionsdaten erhalten werden können.
4 2 SCHRIFTTUM
2.1 Genexpressionen bei eukaryontischen Zellen
Unter Genexpression versteht man die Umsetzung der in der DNA gespeicherten Information über die mRNA in ein entsprechendes Protein und damit die Ausbildung eines von diesem Genprodukt abhängigen Merkmals (CRICK 1970). Die Genexpression wird in zwei Abschnitte unterteilt, wobei der erste Schritt als Transkription bezeichnet wird. Hierbei wird die Nukleotidsequenz des kodierenden DNA-Abschnittes mit Hilfe von DNA-abhängigen RNA-Polymerasen in die komplementäre Basensequenz der RNA umgeschrieben (KARLSON 1984). Der zweite Schritt, die Übersetzung der Information der mRNAs in die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, wird als Proteinsynthese bzw. Translation bezeichnet (LÖFFLER 1997). Der Informationsfluss verläuft wie folgt:
Das grundlegende Unterscheidungsmerkmal zwischen eukaryontischer und prokaryontischer Transkription ist die Kernmembran, die bei Eukaryonten die Chromosomen vom Zytoplasma trennt. Die Synthese der RNA erfolgt im Zellkern.
Nach dem Transport durch die Zellkernmembran wird diese in spezifischer Weise verändert. Die Prozesse laufen getrennt ab, die Transkription im Zellkern und die Translation im Zytoplasma (Abb. 1).
DNA TRANSKRIPTION RNA TRANSLATION PROTEIN
DNA TRANSKRIPTION RNA TRANSLATION PROTEIN
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Abb. 1: Schritte von der Transkription eines Gens bis zur Proteinbildung nach GELDERMANN 2005.
2.1.1 Transkription
Die Transkription im Zellkern eukaryontischer Zellen lässt sich in drei Schritte unterteilen:
• Initiation
• Elongation
• Termination.
Die Initiation beginnt mit der Bindung der RNA-Polymerase an eine spezifische DNA- Sequenz, die als Promotorsequenz bezeichnet wird. Es treten drei verschiedene RNA-Polymerasen auf, die unterschiedliche Gen-Gruppen in den eukaryontischen Zellen transkribieren. Die RNA-Polymerase I transkribiert die Gene, die für die drei ribosomalen RNAs (rRNAs) kodieren, die RNA-Polymerase II synthetisiert proteincodierende messenger-RNA-Vorläufer (prä-mRNAs, hnRNAs), während die Produkte der RNA-Polymerase III die tRNAs, 5S-rRNA und andere RNAs sind
6
(KNIPPERS 2001). RNA-Polymerasen sind große Proteinkomplexe, die mindestens 12 Untereinheiten besitzen und zusammen mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren eine Promotorregion erkennen. Molekulargenetische Analysen haben gezeigt, dass die meisten eukaryontischen Promotoren ähnlich aufgebaut sind (DYNAN u. TIJAN 1985). Abhängig von der Sequenzanalyse können zwei für eukaryontische Promotoren typische Konsensussequenzen nachgewiesen werden. Eine ist die AT- reiche Region, die als TATA-Box bezeichnet wird, und ein sogenanntes Initiatorelement (Inr; KOLLMAR u. FARNHAM 1993). Bei den meisten eukaryontischen Genen liegt die TATA-Box etwa 25-30 Basenpaare stromaufwärts vor dem Transkriptionsstart (SMALE et al. 1990). Neben TATA-Box und Initiator (Inr) sind weitere Regulationselemente, die die Effizienz der Initiation erhöhen, gefunden worden. Diese Elemente wurden als UPEs (Upstream Promotor Elements) bezeichnet (BRENIG u. BREM 1989). Dazu zählen die CAAT-Box, die von verschiedenen regulatorischen Proteinen erkannt wird, und die sogenannte GC-Box mit der Sequenz GGGCGG, an die das Zinkfinger-Protein Sp1 bindet (ALTMANN et al. 1994; HOLLER et. al 1998). Diese Sequenzelemente beeinflussen die Initiation der Transkription insofern, dass sie durch die gebundenen Proteine die RNA- Polymerase rekrutieren und so die Transkription starten. Nach Bindung der RNA- Polymerase II wird die DNA-Doppelhelix lokal entwunden. Während der Elongation wandert die RNA-Polymerase entlang der DNA-Matrize in 5’–3’ Richtung. Unter Pyrophosphatabspaltung bindet sie komplementäre Nukleosidtriphosphate am kodogenen Strang und verknüpft diese zum primären Transkriptionsprodukt, der prä- mRNA. Da sich die DNA/DNA-Helix hinter der wandernden Polymerase wieder schließt, wird die neu entstandene RNA verdrängt und dadurch aus dem Enzymkomplex freigegeben. Die Kettenverlängerung geht so lange weiter, bis das Enzym auf eine spezifische Sequenz, die das Ende der Transkription initiiert, trifft.
Dann löst sich die Polymerase von der DNA-Matrize und von der neu produzierten prä-mRNA (ADHYA u. GOTTESMAN 1978; KNIPPERS 2001). Aus der nicht funktionsfähigen prä-mRNA entsteht durch verschiedene Modifikationsschritte die fertige mRNA (DREYFUSS et al. 1993). Zu diesem sogenannten RNA-Processing zählt neben dem Spleißen das Anhängen einer Cap-Struktur (7-Methylguanosin-
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Rest) an das 5´- Ende der mRNA und das Hinzufügen einer Poly-AMP-Sequenz (100-200 Basen) an das 3´- Ende der mRNA (LAMOND 1991). Unter Spleißen wird das enzymatische Herausschneiden der nicht-kodierenden Introns durch Endonukleasen und Zusammenfügen der kodierenden Exons mit Hilfe von Ligasen verstanden.
Dieser Vorgang erfolgt an den aus snRNA aufgebauten Spleißosomen (LÖFFLER 1997).
2.1.2 Translation
Während der Proteinbiosynthese wird die in der Nukleinsäuresequenz gespeicherte Information in die Aminosäuresequenz eines Proteins übersetzt. Die Translation findet an den Ribosomen statt. Nach Abschluss der nukleären Modifikationen erfolgt der Transport der reifen mRNA durch die Kernporen ins Zytoplasma (MEHLIN et al.
1992). Eukaryonte Ribosomen setzen sich aus Proteinen und den rRNAs zusammen (NIERHAUS 1982). Sie befinden sich entweder frei im Zytoplasma oder sind gebunden am endoplasmatischen Retikulum und bestehen aus einer großen und einer kleinen Untereinheit. Die große Untereinheit katalysiert die Peptidbildung, während die kleine Untereinheit mRNA und tRNA bindet. Ein Ribosom hat drei Bindungsstellen für tRNAs, eine erste Bindungsstelle P für die Peptidyl-tRNA, eine sogennante A-Bindungsstelle für die hinzukommende Aminoacyl-tRNA und eine dritte Bindungsstelle E für abgehende tRNA (ALBERTS et al. 1990; VOET u. VOET 1992).
Die Translation erfolgt analog zur Transkription in drei Schritten:
• Initiation
• Elongation
• Termination.
Die Initiation beginnt mit der Bildung der Initiator-tRNA, der sogennanten Aminoacyl- tRNA, an der P-Bildungsstelle des Ribosoms. Die kleine Untereinheit bindet an das 5’-Ende mRNA, was durch die Erkennung der Cap-Struktur der mRNA erleichtert wird (RHOADS 1988). Die Untereinheit mit Initiator-tRNA wandert an der mRNA entlang bis zum Initiator-AUG (Startkodon). Anschließend werden auch verschiedene Initiationsfaktoren sowie Mg2+ und GTP benötigt, die die Anlagerung eines tRNA-
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Startmoleküls und Bindung der großen ribosomalen Untereinheit erleichtern.
Während der Elongationsphase wird die mit der passenden Aminosäure (entsprechend dem Kodon der mRNA) beladene tRNA angelagert. Die Enzyme, die für die Verbindung von einzelnen Aminosäuren mit ihren entsprechenden tRNA- Molekülen verantwortlich sind, heißen Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Sie weisen eine doppelte Spezifität auf: Sie erkennen einerseits die zu übertragende Aminosäure und andererseits die zugehörige tRNA. Die Polypeptidkette wird in einem dreistufigen Zyklus verlängert. Zu Beginn der Proteinsythese wird die Inititions-tRNA an einer A-Bindungsstelle des Ribosoms gebunden. Dort bilden sich mit mRNA-Nukleotiden Basenpaare aus. Während des zweiten Schrittes erfolgt eine Peptidbildung und die Aminoacyl-tRNA verdrängt die Peptidyl-tRNA an der P- Bindungstelle. Dadurch wird die Peptidkette an ihrem Karboxyl-Ende um eine Aminosäure verlängert und auf die tRNA der A-Bildungsstelle übertragen.
Peptidtransferasen katalysieren diese Reaktion. Darauf folgt die Translokation, der dritte Schritt, wobei die neue Peptidyl-tRNA von der A-Bildungsstelle in die P- Bildungsstelle verschoben wird. Das Ribosom bewegt sich relativ zur mRNA und die leere tRNA löst sich vom Ribosom ab. Am Ende des dritten Schrittes der Elongation wird wieder die A-Bildungstelle frei und der ganze Vorgang kann wieder von vorn beginnen (CLARK 1980). Der Elongationszyklus wiederholt sich bis zum Erreichen eines der drei Stoppkodons (UAG, UAA oder UGA). Da es keine entsprechende tRNA gibt, wird die Peptidkette in Gegenwart verschiedener Terminationsfaktoren hydrolytisch von der tRNA gespalten und gelangt ins Zytoplasma. Die mRNA wird freigesetzt und das Ribosom dissoziiert in die beiden Untereinheiten. Durch verschiedene Modifikationsschritte werden die Proteine in ihre biologische Form umgewandelt (LÖFFLER 1997).
2.2 Epigenetische Genregulation
Die Genetik behandelt die Funktionen der DNA, die eine direkte Folge ihrer Struktur bzw. Sequenz sind. Dazu gehört ihre Organisation zu Genen, zu regulatorischen Sequenzen und Veränderungen aufgrund von Modifikationen, z.B. Mutationen, d.h.
Veränderungen in der Basenabfolge. Unter Epigenetik versteht man die vererbbaren,
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reversiblen chromosomalen Modifikationen, die den regulatorischen Zustand der Gene und die Genexpression aufrechthalten oder unterdrücken, wobei die Nukleotidabfolge der Gene unverändert bleibt (LI 2002). Die epigenetische Kontrolle der Genexpression ist für die normale Entwicklung eines Organismus von essentieller Bedeutung, da viele Gene nur zu bestimmten Zeitpunkten in einem spezifischen Zelltyp aktiviert sein dürfen. Die epigenetischen Mechanismen bleiben über die Zellteilung hinweg erhalten und werden an die nächste Generation weitergegeben. Aufgrund fehlerhafter epigenetischer Regulation kann es zu einem erhöhten Risiko für die Krebsentstehung sowie Erkrankungen bei Menschen und Tieren kommen (JONES 1996; BAYLIN u. HERMAN 2000). Epigenetische Prozesse werden über eine Vielzahl molekularer Mechanismen gesteuert, wobei DNA- Methylierung, Imprinting, X-Chromosom-Inaktivierung, Regulation der Telomerlänge sowie Histonmodifizierungen eine wichtige Rolle spielen (JAENISCH u. BIRD 2003;
SHI et al. 2003; WRENZYCKI et al. 2005a).
2.2.1 Imprinting
Das genomische Imprinting ist ein epigenetisches Phänomen, bei dem es aufgrund einer gametenspezifischen Methylierung bestimmter Chromosomabschnitte in der Keimbahn entweder zu einer Aktivierung oder Stilllegung eines Allels kommt (BARLOW 1997). Dadurch wird in somatischen Zellen entweder das väterliche (paternale) oder nur das mütterliche (maternale) Allel eines Gens exprimiert.
Infolgedessen unterscheiden sich das maternale und paternale Genom funktionell voneinander. Beide sind für eine physiologische Säugetierentwicklung unbedingt notwendig (SURANI et al. 1984; McGRATH u. SOLTER 1984). So sterben mit fortschreitender Entwicklung parthenogenetische Embryonen mit einem diploiden maternalen Chromosomensatz ab. Ähnliches wurde bei androgenetischen Embryonen mit einem diploiden paternalen Chromosomensatz nachgewiesen, die einige Tage nach der Implantation absterben (BARTON et al. 1984; SURANI et al.
1984; LATHAM u. SOLTER 1991; LOI et al. 1998). In Mäuseembryonen erfolgt der Prozess des Imprintings während der Gametogenese und frühen Embryogenese (LATHAM 1999). Bei den anderen Säugetieren wird davon ausgegangen, dass der
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Prozess des Imprintings wie bei Maus und Mensch während der Gametogenese abläuft.
Obwohl noch kein universeller Mechanismus des Imprintings gefunden werden konnte, wird davon ausgegangen, dass die allelspezifische DNA-Methylierung ein wesentlicher Marker der Gene ist, die dem Imprinting unterliegen. Diese reversible epigenetische Modifikation erfolgt durch die kovalente Bindung einer Methylgruppe an den Kohlenstoff C-5 eines Cytosinringes. Bei Vertebraten wird die Methylierung symmetrisch an beiden DNA-Strängen des 5’-CpG-3’-Palindroms durchgeführt (GRUENBAUM et al. 1982; BESTOR 1992). Die Methylierung durch Methyltransferasen eines Cytosin Moleküls zu Methyl-5-Cytosin erfolgt in bestimmten Regionen der DNA, in Bereichen einer spezifischen Cytosin-Guanin-Ansammlung, die als CpG- Inseln bezeichnet werden (BIRD 1986). Bei Vertebraten weisen die Haushaltsgene, alle „imprinted“ Gene sowie 40% gewebe-spezifische Gene CpG-Inseln auf (GARDINER-GARDEN u. FROMMER 1987; REIK et al.2001). Als CpG-Insel werden DNA-Abschnitte von ca. 200 bp Länge mit mehr als 50% GC-Gehalt definiert (GARDINER-GARDEN u. FROMMER 1987; ANTEQUERA u. BIRD 1999).
Häufig bleiben die Promotorregionen der Gene, die innerhalb von CpG-Inseln liegen, in allen Embryonalstadien und im adulten Organismus unmethyliert (BIRD u.
WOLFFE 1999). Ausnahmen bilden die CpG-Inseln von Genen, die sich auf dem inaktiven X-Chromosom befinden, wo die Methylierung eine wichtige Rolle bei der X-Chromosom-Inaktivierung spielt. Die meisten Gene, die dem Imprinting unterliegen, besitzen differentiell methylierte Regionen (DMRs), wo ein unterschiedliches Methylierungsmuster zwischen paternalem und maternalem Allel gefunden wird. DMRs bestehen zumeist aus CG-reichen Sequenzen oder CpG-Inseln und befinden sich häufig innerhalb von Promotorregionen (BIRD 1986;
TILGHMAN 1999; REIK et al. 2001). Meistens wird infolge der DNA-Methylierung die Genexpression ausgeschaltet (BIRD u. WOLFFE 1999). Bei sieben von achtzehn Genen, die dem Imprinting unterliegen und DMRs besitzen, wurde jedoch gezeigt, dass sie sich auf einem transkriptionell aktiven Allel befinden (REIK u. WALTER 2001). Somit kann die Methylierung von Genen, die dem Imprinting unterliegen, sowohl zur Aktivierung als auch zur Stilllegung der Genexpression führen (BARLOW
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1997). Das Phänomen des Imprintings wurde bei Maus, Ratte, Schaf, Pferd, Rind und Mensch beobachtet (http://www.otago.ac.nz/IGC; MORISON et al. 2001). Bislang konnten etwa 53 Gene beim Menschen sowie 76 bei der Maus als dem Imprinting unterliegend identifiziert werden (http://www.otago.ac.nz/IGC). Die dem Imprinting unterliegenden Gene beeinflussen nicht nur direkt die Embryonalentwicklung, das Wachstum von Fetus und Plazenta, sondern scheinen auch indirekt über den erwachsenen Organismus Einfluss auf die Entwicklung der Nachkommen auszuüben. LEFEBVRE et al. (1998) unterdrückten in Mäusen die Expression des PEG1/Mest-Gen (Mesoderm specific transcript), das maternal exprimiert wird und dem Imprinting unterliegt. Transkripte dieses Gens finden sich sowohl in Embryonen als auch im Gehirn erwachsener Tiere. Nach Ausschaltung dieses Gens in Embryonen wie auch in adulten Mäusen konnte ein retardiertes Embryonenwachstum und ein Ausbleiben des mütterlichen Verhaltens der adulten weiblichen Mäuse beobachtet werden. Gene, die dem Imprinting unterliegen, scheinen im adulten Organismus eine Funktion innerhalb des Verhaltens zu übernehmen.
Eine abweichende Expression von „imprinted“ Genen kann zu Erbkrankheiten und einer Reihe von Tumorerkrankungen führen (TILGHMAN 1999; FALLS et al. 1999).
Ein erhöhtes Risiko für Imprintingstörungen und Imprintingkrankheiten, wie Beckwith- Wiedemann- und Angelman-Syndrom, wurde bei Kindern nach In-vitro- Fertilisierung (IVF) und intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) beobachtet (COX et al. 2002; DEBAUN et al. 2003). Außerdem werden Gene, die dem Imprinting unterliegen, als mögliche ursächliche Kandidaten für die Entstehung des LOS bei Tieren angesehen. An Nachkommen, die ein gestörtes Imprinting aufwiesen, konnten erhöhte frühembryonale, fetale und neonatale Sterblichkeit sowie prä- und postnatale Wachstumsdefekte beobachtet werden (CATTANACH u. BEECHEY 1997).
Die notwendigen Schritte in der In-vitro-Embryonenproduktion fallen mit dem Prozess des Imprintings zusammen, wodurch Fehler im Imprinting nicht ausgeschlossen werden können (YOUNG u. FAIRBURN 2000).
12 2.2.2 DNA-Methylierung
Die DNA-Methylierung ist mit einer Transkriptionhemmung assoziiert und spielt bei vielen regulatorischen Prozessen wie X-Chromosom-Inaktivierung, der Stillegung von Transgenen, bei gewebe-spezifischer Genexpression sowie beim Imprinting eine wichtige Rolle (siehe Kap. 2.2.1; RAZIN u. RIGGS 1980; JAENISCH 1997).
Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um eine reversible epigenetische Modifikation, die in Vertebraten hauptsächlich in sogenannten CpG-Inseln, Regionen, die reich an den aufeinander folgenden Basen Cytosin und Guanin sind, anzutreffen ist (OKANO et al. 1998). Die enzymatische Methylierung bestimmter Cytosinbasen ist z.Z die am besten untersuchte epigenetische Modifikation, die bei der Reprogrammierung des Genoms eine entscheidende Rolle spielt und meistens mit einer Transkriptionshemmung assoziiert ist (RAZIN u. CEDAR 1994; AVNER u.
HEARD 2001; SHI et al. 2003). Die DNA-Methylierung wird durch DNA- Methyltransferasen (DNMTs) durchgeführt, die Methylgruppen von S-Adenosyl- Methionin an das Kohlenstoffatom C-5 der Base Cytosin übertragen (ALBERTS et al.
1995). Je nach Funktion können die DNA-Methyltransferasen in zwei Klassen eingeteilt werden. Für die Aufrechthaltung eines bereits existierenden DNA-Methylierungsmusters nach der DNA-Replikation ist die DNA-Methyltransferase 1 (Dnmt1) zuständig, die aus diesem Grund als Erhaltungsmethyltransferase (maintenance Methyltransferase) bezeichnet wird (BESTOR 1992). Eine zweite Gruppe von Methyltransferasen sind die sogenannten de novo Methyltransferasen, die für die DNA-Methylierungsmuster während der Embryonalentwicklung verantwortlich sind. Dazu zählen die DNA-Methyltransferase 3a (Dnmt3a) und DNA- Methyltransferase 3b (Dnmt3b; OKANO et al. 1998; HSIEH 1999). Eine Mutation das Dnmt3a-Gens auf dem paternalen oder/und maternalen Allel führt zu Störungen in Reproduktion, Embryonalentwicklung sowie Imprinting (KANEDA et al. 2004). Im Gegensatz zu der somatischen Form von Dnmt1 (Dnmt1s), welche vorrangig im Nukleus lokalisiert ist, ist Dnmt1o nur zu Beginn des Oozyten-Wachstums und während des 8-Zell-Stadiums im Nukleus zu finden (BESTOR 2000). Vor der Ovulation und in präimplantatorischen Mäuseembryonen befindet sich Dnmt1o im Zytoplasma und ist erst nach der Implantation im Zellkern lokalisiert, wo es von der
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längeren somatischen Form ersetzt wird (CARLSON et al. 1992). Dnmt3L, die allein keine Methylierungsaktivität aufweist, ist zusammen mit Dnmt3a und Dnmt3b für die Etablierung des genomischen Imprintings bei der Maus essentiell und während der Oogenese für die de novo-Methylierung verantwortlich (BOURC’HIS et al. 2001;
HATA et al. 2002). Die DNA-Methylierung spielt somit eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung der Säugetiere (JAENISCH u. BIRD 2003).
Die geschlechtspezifische Methylierung im Genom von Oozyte und Spermium wird nach der Befruchtung durch Demethylierung entfernt. Ausgenommen von der globalen Demethylierung sind Gene, die dem Imprinting unterliegen. Das väterliche Genom wird innerhalb weniger Stunden nach der Befruchtung aktiv demethyliert, während beim mütterlichen Genom eine passive Demethylierung während der ersten Teilungen stattfindet (MAYER et al. 2000; DEAN et al. 2001). Bei der Maus findet eine de novo-Methylierung des Genoms im Morulastadium und beim Rind bereits ab dem 8-16-Zell-Stadium statt (DEAN et al. 2001; REIK u. WALTER 2001).
Die korrekte Reprogrammierung der Methylierung der beiden elterlichen Genome in der frühen Embryonalentwicklung hat große Bedeutung für die ungestörte weitere Entwicklung. Veränderungen im Methylierungsmuster der DNA wurden beim Rind sowie bei der Maus nach Kerntransfer nachgewiesen (HUMPHERYS et al. 2001;
ENRIGHT et al. 2005). Bei Kerntransferembryonen kommt es zu einer inkompletten, sowie auch variablen Demethylierung des diploiden Spendergenoms (DEAN et al.
2001).
2.2.3 X-Chromosom-Inaktivierung
In weiblichen Säugetierzellen kommt es zur Inaktivierung eines der beiden X- Chromosomen, um einen Ausgleich in der Gen-Dosis im Vergleich zu männlichen Zellen, die nur über ein X-Chromosom verfügen, zu erreichen (LYON 1961). Mary Lyon berichtete als erste 1961 über das inaktive X-Chromosom, das in allen weiblichen Zellen verfügbar ist (BOUMIL und LEE 2001). Noch während der präimplantatorischen Entwicklung findet in extraembryonalen Gewebsanlagen (Trophektoderm, Plazenta und primitives Endoderm) eine präferentielle Inaktivierung des paternalen X-Chromosoms statt. Die X-Inaktivierung wird durch das
14
X-Inaktivierungszentrum (Xic) kontrolliert (LATHAM 2005). Das Xist-Gen (X- chromosome inactive specific transcript) gilt als Kandidatengen für X-Inaktivierungszentrum (GARTLER und GOLDMAN 2001). Die Xist-Transkripten wurden erst ab dem 2-Zellen-Stadium beim Rind (DE LA FUENTE et al. 1999) und Maus (HARTSHORN et al. 2002) nachgewissen worden. Die Xist-RNA wird ausschließlich vom inaktivierten X-Chromosom transkribiert und ist mit dem Heterochromatin verbunden (GOTO u. MONK 1998). Das inaktive X-Chromosom ist durch seine spätere Replikation während der S-Phase, die stark kondensierte Heterochromatin-Struktur während der Interphase des Zellzyklus und die epigenetischen Modifikationen des Chromatins, wie DNA-Methylierung und Hypoacetylierung am Histon H3/H4, gekennzeichnet. Die CpG-Inseln auf dem inaktiven X-Chromosom weisen eine starke Methylierung auf (TRIBIOLI et al. 1992).
Außerdem stehen die beiden Lysin-Methylierungen am Histon 3 (H3-K27) und Histon 4 (H4-K20) mit der Inaktivierung des X-Chromosoms in Verbindung (HEARD et al.
2001).
Techniken der In-vitro-Produktion sowie Änderungen des Kerntransferprotokolls können die mRNA-Expression X-chromosomal lokalisierter Gene beeinträchtigen.
Ein abweichendes mRNA-Expressionmuster von Xist konnte bei Embryonen, die aus adulten Spenderzellen gewonnen wurden, im Vergleich zu denjenigen, die aus fötalen Spenderzellen stammen, nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 2002).
2.2.4 Regulation der Telomerlänge
Als Telomeren werden die Enden linearer Chromosomen von Eukaryonten bezeichnet, die aus einer DNA-Komponente und verschiedenen Proteinen bestehen (ZAKIAN 1995). Die DNA der Telomeren besteht aus sich wiederholenden Basenhexameren. Beim Menschen handelt es sich um eine kurze G-reiche Sequenz –TTAGGG-, die zu mehreren Tausenden Wiederholungen am Ende der Chromosomen vorkommen kann (MOYZIS et al. 1988; MEYNE et al. 1989). Die Telomeren stabilisieren die Chromosomenenden und schützen sie vor enzymatischer Degradation, Rekombination sowie Fusion mit anderen Chromosomenenden, was für die korrekte Weitergabe der Erbinformation wichtig ist (BLACKBURN 1991; XU u.
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YANG 2003). Neben der Schutzfunktion spielen die Telomeren auch bei der Paarung der homologen Chromosomen während der Meiose und bei der Interaktion zwischen Chromosomen und der Kernmatrix während der Zellteilung eine wichtige Rolle (DE LANGE 1992; MORIN 1997). An allen Chromosomenenden gehen geringe Mengen an DNA-Sequenz während der Zellteilung verloren (WATSON 1972).
Die Verkürzung der DNA führt nicht zum Verlust der gen-kodierenden Sequenzen, sondern lediglich zu einer Verkürzung der Telomer-DNA. Verantwortlich hierfür ist die semikonservative Replikation, die von der DNA-Polymerase durchgeführt wird.
Die DNA-Polymerase benötigt einen 8-12 bp umfassenden RNA-Primer um die Polymerisierung in 5’-3’ Richtung zu starten. Nach Beendigung der Polymerisierung werden die Primer entfernt und durch DNA aufgefüllt. Am 5’-Ende der neusynthetisierten Stränge können jedoch die RNA-Primer nicht ersetzt werden, was zu einer replikationsabhängigen Verkürzung der Chromosomen führt (WATSON 1972; XU u. YANG 2003; MEERDO et al. 2005). Es wird geschätzt, dass pro Zellteilung etwa 50-200 Basenpaare der Telomerensequenz verloren gehen (LEVY et al. 1992; HARLEY et al. 1990). Somit könnte die Länge der Telomeren als eine Art
„mitotische Uhr“ der Replikationsfähigkeit somatischer Zellen dienen, deren Teilungsfähigkeit mit dem Aufbrauchen telomerer Sequenzen erschöpft ist (HARLEY 1991). Eine Verkürzung der Telomeren reduziert die Teilungsfähigkeit der Zellen und wird mit dem Auftreten von Tumoren, Alterungsprozessen und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht (DE LANGE 2002).
Einzelne Zelltypen können durch die Reaktivierung des Enzyms Telomerase die Chromosomen wieder stabilisieren und einen Wachstumsstopp verhindern (SHAY u. WRIGHT 2001). Das Enzym Telomerase setzt sich aus RNA- Komponenten, die als Matrize für die Synthese von Telomeren-DNA-Sequenzen dienen, und einer reversen Transkriptase, welche die katalytische Untereinheit des Enzyms ist, zusammen. Das Enzym ermöglicht eine Neusynthese von DNA an den Telomerenden. Die Aktivität der Telomerase wird von mehreren Telomerase- bindenden Proteinen moduliert (CONG et al. 2002). Schwache Telomeraseaktivität wurde in frühen Teilungsstadien beim Rind nachgewiesen, während das Enzym in Blastozysten intensiv aktiv ist (XU u. YANG 2000; BETTS u. KING 1999).
16
Verschiedene Studien mit geklonten Embryonen haben ergeben, dass sich die Telomeren von denen der Kontrollembryonen nicht unterschieden haben (WAKAYAMA et al. 2000; XU u. YANG 2000; TIAN et al. 2000; BETTS u. KING 1999; LE et al. 2004). Im Morulastadium von Rinderembryonen verschiedener Herkunft (Kerntransfer, In-vivo- und In-vitro-Befruchtung) war die Telomerenlänge im Vergleich zu der von Blastozysten signifikant verkürzt. Telomeraseaktivität war im Morulastadium kaum nachweisbar, in Blastozysten aber intensiv festzustellen (SCHAETZLEIN et al. 2004). Das bedeutet, dass während der frühen Embryogenese, beim Übergang von der Morula zur Blastozyste, Telomere wieder auf normale Länge gebracht werden können.
17 2.2.5 Histonmodifizierungen
In eukaryontischen Zellen bildet die DNA des Zellkerns mit Proteinen einen Komplex, der als Chromatin bezeichnet wird. Das Chromatin hat eine hochdynamische Struktur, die verschiedensten Veränderungen, abhängig vom funktionellen Status der Zelle, unterliegt. Die sich wiederholende Grundeinheit des Chromatins ist das Nukleosom, das aus einem Histonoktamer, das um die DNA gewunden ist, besteht (LUGER et al. 1997; ROLOFF u. NUBER 2005). Das Histonoktamer setzt sich aus je zwei H2A/H2B-Dimeren und einem H3/H4-Tetramer zusammen, die die Kern- Histone bilden (Abb. 2; HAYES et al. 1991). Jeder Histon-Kern besteht aus einer globulären Domäne, die für die Histon-Histon- und Histon-DNA-Kontakte verantwortlich ist, und je einer Amino- (NH2) und Carboxy- (COOH) terminalen Domäne (HORN u.
PETERSON 2002).
Abb. 2: Strukturschema des Histons (SPOTSWOOD u. TURNER 2002).
Histone bestehen aus zentralen globulären Domänen und flexiblen Armen, die posttranslationell modifiziert werden können.
Histonmodifizierungen: acK (Lysin-Acetylierung), meR (Arginin-Methylierung),
meK (Lysin-Methylierung), PS (Serin-Phosphorylierung), uK (Lysin-Ubiquitinierung)
18
Die N- und C-terminalen, flexiblen Arme des Histons können durch bestimmte Enzyme kovalent modifiziert werden. Aufgrund der posttranslationellen Modifizierungen spielen die Histone eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression. Neben Acetylierung (Lysin) und Deacetylierung sind auch Methylierung (Lysin, Arginin), Phosphorylierung (Serin/Threonin), Ubiquitinierung (Lysin) und ADP-Ribosylierung möglich (CHEUNG et al. 2000; GRANT 2001; SPOTSWOOD u. TURNER 2002).
2.2.5.1 Histonacetylierung
Die Acetylierung ist die am besten untersuchte Modifikation, die vor allem an den Histonen H3 und H4 stattfindet und eine bedeutende Rolle bei Genregulation spielt.
Enzyme, welche die Acetylierung durchführen, werden als Histonacetyltransferasen
(HATs) bezeichnet. Sie übertragen Acetylreste von Acetyl-CoA auf die ε-Aminogruppen eines Lysins. Diese Übertragung neutralisiert die positive Ladung
der Aminogruppe (KUO u. ALLIS 1998). Es wird davon ausgegangen, dass die Neutralisierung der positiven Ladung die Bindungen zwischen Histonen und negativ geladener DNA schwächt, mit einer Auflockerung der Chromatinstruktur verbunden ist und die Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren an diesen Bereich erleichtert (GRANT u. BERGER 1999; ROTH et al. 2001). Histone in transkriptonsaktiven Bereichen des Chromatins (Euchromatin) sind hyperacetyliert, während sie in inaktiven Chromatinbereichen (Heterochromatin) hypoacetyliert sind (Abb. 3;
GRUNSTEIN 1997). Gegenspieler der Histonacetyltransferasen sind die Histondeacetylasen (HDACs), die Lysinreste deacetylieren und für die Bildung einer positiven Ladung verantwortlich sind (KUO u. ALLIS 1998; GRANT 2001;
MARMORSTEIN 2001). Viele Koaktivatoren der Transkription besitzen Histonacetyltransferase-Aktivität (BROWN et al. 2000). Aufgrund der Lokalisation werden Typ A (nukleäre) und Typ B (zytosolische) HATs unterschieden (BROWNELL u. ALLIS 1996; ROTH u. ALLIS 1996). Es sind drei Familien von nukleären HATs bekannt; die GNAT-, MYST- und die p300/CBP-Familie (ROTH et al. 2001).
Die GNAT-Familie (Gcn5-related N-acetyltransferases) umfasst Proteine, die sowohl bei der Transkriptionsaktivierung (GCN5 und PCAF) als auch bei der Transkriptionelongation (Elp3) beteiligt sind. Sie besitzen außer einer HAT-Domäne,
19
eine Bromodomäne, womit vermutlich acetylierte Lysinreste erkannt werden (DHALLUIN et al. 1999; OWEN et al. 2000). Proteine, die die MYST-Familie repräsentieren, besitzen eine cysteinreiche Region, die durch eine Chromodomäne, die sich am N-Teminus befindet, von methylierten Lysinresten erkannt werden (TAKECHI u. NAKAYAMA 1999). Die Proteine der p300/CBP Familie sind durch eine Bromodomäne sowie ein cysteinreiches Motiv gekennzeichnet und dienen als Koaktivatoren für mehrere Transkriptionsfaktoren (GRANT 2001). Viele bekannte HATs bilden zusammen mit weiteren HATs oder anderen Kofaktoren (z.B. TAFII250/PCFA/GCN5) multiple Histonacetyltransferase-Komplexe, die vermutlich weitere Proteinkomplexe rekrutieren oder bilden können (CARROZZA et al. 2003).
Der humane P/CAF-Komplex und der yGcn5-Komplex der Hefen gehören zu den bestcharakterisierten HAT-Komplexen (ROTH et al. 2001).
Abb. 3: Schematische Darstellung der Entstehung eines Eu- und Heterochromatins (modifiziert nach GRANT 2001).
Acetylierung (Ac) durch Histonacetyltransferasen (HATs) rekrutiert andere Transkriptionsregulatoren, die u.a. eine Bromodomäne besitzen, und führt zur Entstehung eines aktiven Euchromatins und somit zur Genexpression. Die Methylierung (Me) von Histonmethyltransferasen (HMT) rekrutiert HP1 (Heterochromatin-associated Protein 1) und führt zur Entstehung eines inaktiven Heterochromatins.
Ac
Ac AcAc AcAc AcAc AcAc AcAc Bromo
Bromo BromoBromo HAT
HAT
TAFII250/PCAF/GCN5 TAFII250/PCAF/GCN5
Transkriptionsaktivierung Transkriptionsaktivierung
MeMe
Chromo
Chromo ChromoChromo HMT
HMT
HP1 HP1
MeMe MeMe MeMe MeMe MeMe
Transkriptionshemmung Transkriptionshemmung Aktives
AktivesEuchromatinEuchromatin InaktivesInaktivesHeterochromatinHeterochromatin
Ac
Ac AcAc AcAc AcAc AcAc AcAc Bromo
Bromo BromoBromo HAT
HAT
TAFII250/PCAF/GCN5 TAFII250/PCAF/GCN5
Ac
AcAc AcAc AcAc AcAc AcAc AcAc AcAc
Ac AcAcAcAc AcAcAcAc AcAcAcAc AcAcAcAc AcAcAcAc Bromo
BromoBromo
Bromo BromoBromoBromoBromo HAT
HAT HAT HAT
TAFII250/PCAF/GCN5 TAFII250/PCAF/GCN5
Transkriptionsaktivierung Transkriptionsaktivierung
MeMe
Chromo
Chromo ChromoChromo HMT
HMT
HP1 HP1
MeMe MeMe MeMe MeMe MeMe
Transkriptionshemmung Transkriptionshemmung MeMeMe
Me
Chromo
Chromo ChromoChromoChromoChromo HMT
HMT
HP1 HP1
MeMeMe
Me MeMeMeMe MeMeMeMe MeMeMeMe MeMeMeMe
Transkriptionshemmung Transkriptionshemmung Aktives
AktivesEuchromatinEuchromatin InaktivesInaktivesHeterochromatinHeterochromatin
20 2.2.5.2 Histonmethylierung
Die Histonmethylierung wurde 1964 von Murray nachgewiesen. Aber es war lange noch unklar, welche genaue Funktion diese Modifikation hat (MURRAY 1964).
Erst 35 Jahre später konnte ein Zusammenhang zwischen Transkription und Histonmethylierung nachgewiesen werden (CHEN et al. 1999). Die Histonmethylierung wird von Histonmethyltransferasen (HMTs) durchgeführt. Sie übertragen eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin auf Lysin oder Arginin in der NH2-terminalen Region der Histone H3 und H4. Die Methylierung von Lysinresten durch Histon-Lysin-Methyltransferasen findet am Histon H3 an den Positonen K4, 9, 27, 36 und 79 und am Histon H4 an K20 statt (VAN HOLDE 1988; STRAHL et al.
1999; SIMS et al. 2003). Als erste lysinspezifische Histonmethyltransferasen wurden Proteine der SU(VAR)3-9-Familie von Drosophila, Maus und Mensch entdeckt.
Sie methylieren Histon H3 am Lysin 9 und besitzen eine katalytische SET-Domäne, die für ihre Aktivität verantwortlich ist (REA et al. 2000). Diese Domäne wurde nach den drei Proteinen SU(VAR)3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax bezeichnet, wo sie vorhanden ist (TSCHIERSCH et al. 1994; JENUWEIN et al. 1998). Auβer SET- Domäne sind auch zwei weitere cysteinreiche, flankierende Domänen für die enzymatische Aktivität des SUV39H1 Gen wichtig, die prä-SET-Domäne und die post-SET-Domäne (REA et al. 2000; ZHANG u. REINBERG 2001). Die Histonmethyltransferasen, die den cysteinreichen Domänen fehlen, haben ihre HMTs Aktivität in vitro verloren (REA et al. 2000). Es existieren weitere Proteine mit SET- Domänen, die eine H3-K9-Methyltransferaseaktivität aufweisen. Neben SUV39H1 und SUV39H2 sind bei der Maus ESET (YANG et al. 2002a) und G9A zu nennen (TACHIBANA et al. 2002). Methylierte Histone können je nach Position der methylierten Lysinreste aktivierende wie auch hemmende Effekte auf die Genexpression haben (HAKE et al. 2004). Lysin 9 in H3 kann sowohl methyliert als auch acetyliert sein. Abhängig davon, was für eine Gruppe am Lysin bindet, wird Euchromatin oder Heterochromatin gebildet. Dimethylierungen an H3-K9 und Trimethylierungen an H3-K27 stehen mit der X-Chromosom-Inaktivierung bei Säugern im Zusammenhang und mit der Repression der Genexpression (HEARD et al. 2001; BOGGS et al. 2002; PETERS et al. 2002). Die Methylierung von Argininen
21
ist weniger gut untersucht und erfolgt an den Aminogruppen des Guanidinorestes durch Enzyme, den Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs; GARY u. CLARKE 1998). Argininmethylierungen finden am Histon H3 an R2, R17 und R26 sowie am Histon H4 an R3 statt (LI et al. 2002). Die PRMTs besitzen keine SET-Domäne, sondern eine zentrale katalytische Domäne. Die Protein-Arginin-Methyltransferasen werden aufgrund ihrer Fähigkeit zur asymmetrischen oder symmetrischen Bindung der zweiten Methylgruppe an den Guanidinorest in zwei Enzymklassen unterteilt.
Die Typ I Klasse beinhaltet die Enzyme, die die asymmetrische Bildung von NG,NG-Dimethylargininresten katalysieren. Typ-II-Enzyme sind an der Entstehung symmetrischer NG,N’G- Dimethylargininreste beteiligt (ZHANG u. REINBERG 2001).
Die Methylierung von Argininen in Histon H3 und H4 führt zur transkriptionellen Aktivierung und erleichtert die nachfolgende Acetylierung (WANG et al. 2001;
ZHANG u. REINBERG 2001).
2.2.6 Zusammenhang zwischen Histonmodifikationen und DNA-Methylierung im „Chromatin-Remodeling“
Die Struktur des Chromatins spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression. Eine stark kompaktierte Heterochromatinstruktur weist niedrige Transkriptionsaktivität auf, während Euchromatin, das eine offene Struktur bildet, transkriptionell aktiv ist (WEINTRAUB u. GROUDINE 1976; LUO u. DEAN 1999;
TURNER 2000). Drei wesentliche Mechanismen, die unter dem Terminus „Chromatin Remodeling“ zusammengefasst werden, modifizieren Chromatin auf unterschiedliche Weise und können somit seine Struktur beeinflussen. Dabei handelt es sich um Enzyme, die die Histone posttranslational modifizieren können, die DNA- Methylierung (BIRD u. WOLFFE 1999; BERGER 2002), sowie ATP-abhängige Modifikationen an den Nukleosomen (TSUKIYAMA u. WU 1997; TYLER u.
KANDONAGA 1999). Wesentlich für die Regulation der Transkription über die Chromatinstruktur sind vor allem die Acetylierung/Deacetylierung von Lysinresten, Methylierungen von Lysin- und Argininresten sowie Phosphorylierungen von Serinresten. Viele Studien konnten zeigen, dass die Histonacetylierung mit einer Transkriptionsaktivierung und die Histondeacetylierung mit einer Repression der
22
Expression korreliert (WADE et al. 1997; FORSBERG u. BRESNICK 2001; GRANT 2001; SHI et al. 2003). Aufgrund der Homologie zu bekannten Histondeacetylasen der Hefe werden Histondeacetylasen in drei Klassen unterteilt: Enzyme der Klasse I sind ähnlich mit yRPD3, Klasse II fasst die HDACs zusammen, die mit yHDA1 eine Ähnlichkeit zeigen, und Klasse III betrifft HDACs, die mit ySIR verwandt sind (GROZINGER et al. 1999; BERSTEIN et al. 2000; SHORE 2000). Beim Menschen sind die HDACs 1, 2, 3, 8 und 11 in die Klasse I eingeteilt (KHOCHBIN et al. 2001).
HDACs liegen in Zellen in größeren Proteinkomplexen vor. HDAC1 und 2 sind als Komponenten des mSin3A-, NuRD (nucleosome remodeling and deacetylation)- und Co-REST-Komplexes bekannt (DE RUIJTER et al. 2003). In NuRD-Komplexen sind die HDACs mit einem ATP-abhängigen „remodeling factor“ Mi-2 assoziiert (TONG et al. 1998; ZHANG et al. 1999). Als Kofaktoren für HDAC3 sind SMRT (silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptors) und N-CoR (nuclear receptor corepressor) nachgewiesen worden (LI et al. 2000).
Die methyl-CpG-bindenden Proteine (MeCPs) erkennen die methylierte DNA an Cytosinresten und rekrutieren die HDACs Komplexen (BIRD 2002). Methylbindendes Protein 2 (MBP2) ist ein Teil vom Transkriptionsrepressor-Komplex MeCP1, der sowohl den mSin3A-MeCP2-Komplex als auch HDAC1 und 2 besitzt (NG et al. 1999).
Histondeacetylasen entfernen Acetylreste am N-terminalen Ende der Histone H3 und H4. Dadurch entsteht eine dichte Chromatinstruktur. Die Zugängigkeit für Transkriptionsfaktoren wird gehemmt und die Genexpression unterdrückt (KASS et al. 1997; BIRD u. WOLFFE 1999). Die Histonmethyltransferasen, die eine MBD-Domäne besitzen (z.B. CLLD8 oder SETDB1/ESET), können direkt an methyliertes DNA binden (Abb. 5; ZHANG u. REINBERG 2001). Auch zwischen Histonmethylierung und DNA-Methylierung besteht eine Verbindung. Durch MeCP2 können nicht nur HDACs, sondern auch die HMTs binden, die H3-K9 methylieren (Abb. 5; FUKS et al. 2003). Es sind fünf Histonmethyltransferasen identifiziert worden, die H3-K9 methylieren (KOUZARIDES 2002). Die am besten untersuchte HMT ist SUV39H1 (Suppressor of variegation homolog 1), die HP1 (Heterochromatin-associated Protein 1) rekrutiert und zur Bildung von Heterochromatin führt (Abb. 4; AAGAARD et al. 1999; CHEUTIN et al. 2003).
23
Es ist bekannt, dass die DNMTs (Dnmt3a, Dnmt1) mittels ihrer PHD-Motive sowohl in vitro als auch in vivo SUV39H1 rekrutieren können und dadurch weitere Histonmethylierungen ermöglichen (FUKS et al. 2003).
Abb. 4: Schematische Darstellung der Histon 3 Lysin 9 (H3-K9) Methylierung (modifiziert nach SIMS et al. 2003).
Das Zusammenspiel von DNA- und Histonmethyltransferasen führt zu einer Geninaktivierung (KOUZARIDES 2002). Neben Acetylierung und Deacetylierung ist auch eine Histonphosphorylierung möglich, die am Histon 3 am Serin 10 (H3-S10) und Histon 3 am Serin 28 (H3-S28) stattfindet und zur Aktivierung der sogenannten
„early response genes“ führt (CHEUNG et al. 2000). FESTENSTEIN et al. (2003) berichten, dass die Phosphorylierung am Histon 3 am Serin 10 (H3-S10) die Bindung von HP1 am methylierten Histon 3 am K9 (H3-K9) verhindert und dadurch können anderer Enzyme wie Histonacetyltransferasen binden, die zu einer Acetylierung führen und die transkriptionelle Aktivierung induzieren.
HDACHDAC
H3H3 K9K9
Ac Ac
SUV39H1 SUV39H1 MeMe
H3H3
K9 K9
HP1HP1
H3H3
K9 K9
HP1HP1 SUV39H1
SUV39H1 MeMe
Schritt
SchrittI H3-I H3-K9K9--MethylierungMethylierung
Schritt
SchrittII HP1-II HP1-RekrutierungRekrutierung
Schritt
SchrittIII HererochromatinIII Hererochromatin--BildungBildung HDACHDAC
H3H3 K9K9
Ac Ac
SUV39H1 SUV39H1 MeMe
HDACHDACHDAC HDAC
H3H3 K9K9
H3H3 K9K9
Ac Ac
SUV39H1 SUV39H1 MeMe
SUV39H1 SUV39H1 SUV39H1 SUV39H1 MeMe
H3H3
K9 K9
HP1HP1
H3H3
K9 K9
HP1HP1 SUV39H1
SUV39H1 MeMe
H3H3
K9 K9
HP1HP1
H3H3
K9 K9
H3H3H3 H3
K9 K9K9 K9
HP1HP1HP1 HP1
H3H3
K9 K9
HP1HP1 SUV39H1
SUV39H1 MeMe
H3H3
K9 K9
H3H3H3 H3
K9 K9 K9 K9
HP1HP1HP1 SUV39H1 HP1
SUV39H1 MeMe SUV39H1 SUV39H1 MeMe MeMe
Schritt
SchrittI H3-I H3-K9K9--MethylierungMethylierung
Schritt
SchrittII HP1-II HP1-RekrutierungRekrutierung
Schritt
SchrittIII HererochromatinIII Hererochromatin--BildungBildung
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Der zweite Mechanismus des Chromatinremodeling, der die Chromatinstruktur verändern kann, sind ATP-abhängige Prozesse. Es handelt sich um Chromatinremodelingkomplexe, die eine ATPase-Untereinheit besitzen und die Energie aus der ATP-Hydrolyse nutzen, um die Mobilisierung der Nukleosomen zu katalysieren (VIGNALI et al. 2000). Nach diesen ATPasen werden die Chromatinremodelingkomplexe in vier Familien unterteilt: Swi2, ISWI, Mi2 (CHD) und INO80 (SHEN et al. 2000). Neben der ATP-Domäne besitzen die ATPasen weitere Domänen, wie eine Bromodomäne bei der Swi2-Familie, die acetylierte Histone erkennen kann (OWEN et al. 2000), oder eine Chromodomäne bei der Mi2(CHD)- Familie, die an methylierte Histone bindet (BERGER 2002; BREHM et al. 2004).
Chromatinremodelingkomplexe können nicht nur mit einer Transkriptionsaktivierung, sondern auch mit einer Repression der Genexpression verbunden sein.
Die Hemmung der Genexpression erfolgt mittels des NuRD-Komplexes (nucleosome remodeling and deacetylation), der neben der MI-2-ATPase-Untereinheit auch eine HDAC-Untereinheit besitzt (XUE et al. 1998).
Abb. 5: Schematische Darstellung des Zusammenhangs von DNA-Methylierung, Histondeacetylie- rung und Histonmethylierung. Modifiziert nach ZHANG u. REINBERG 2001.
MBD MBD
CH
CH33 CHCH33 HDACHDAC Komplex Komplex
Histondeacetylierung
Histondeacetylierung HMTHMT
CH
CH33 CHCH33 SET SET
MBD MBD
Histonmethylierung Histonmethylierung
CHCH33 Chromo
Chromo DomDomäänene
DNMT DNMT MBD
MBD
CH
CH33 CHCH33 MBD
MBD
CH
CH33 CHCH33 HDACHDAC Komplex KomplexHDACHDAC Komplex Komplex
Histondeacetylierung
Histondeacetylierung HMTHMT
CH
CH33 CHCH33 SET SET
MBD MBD
Histonmethylierung Histonmethylierung
CHCH33 Chromo
Chromo DomDomäänene
DNMT DNMT DNMT DNMT
