Genexpressionanalyse bei präimplantatorischen Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft

Untersuchungen zur Darstellung der Transkription spezifischer Gene bei präimplantatorischen Embryonen wurden mittels eines semi-quantitativen Endpunkt-RT-PCR-Assays durchgeführt (WRENZYCKI et al. 1999; YASEEN et al. 2001;

OROPEZA et al. 2004). Mit dieser Methode werden ausgewählte Bereiche einer RNA amplifiziert und die Produkte nach Gelelektrophorese quantifiziert. Der Einsatz einer exogen hinzugefügten Standard-RNA, im vorliegenden Fall Kaninchen-Globin-mRNA, ermöglicht es, eine Transkriptmenge semi-quantitativ (relativ) zu bestimmen (WATSON et al. 2000; WRENZYCKI et al. 2000). Nach Prüfung und Optimierung sämtlicher Parameter, die die PCR beeinflussen, war es möglich, die Transkription mehrerer, beim Rind bisher noch nicht untersuchter Gene darzustellen.

Das maternale ZAR1-Gen (Zygote arrest 1) wird beim Rind nur bis zum 8-16-Zell-Stadium exprimiert. Dies deutet daraufhin, dass ZAR1 nur vom maternalen Genom transkribiert wird. Im 8-16-Zell-Stadium, wo beim Rind die Aktivierung des embryonalen Genoms stattfindet (MEMILI u. FIRST 2000) wurde nur eine niedrige ZAR1-Expression nachgewiesen. Dies unterstützt die Ergebnisse von PENNETIER et al. (2004), die ebenfalls eine maternale Transkription dieses Gens beschrieben haben. Unsere Befunde stehen aber im Gegensatz zu den Daten von BREVINI et al.

(2004), die sowohl eine maternale als auch eine embryonale Transkription gezeigt hatten. Die höchste ZAR1-Expression wurde in unreifen Oozyten festgestellt, mit einem signifikanten Abfall während der Eizellreifung und ebenso nach der Befruchtung, da die maternalen Genprodukte langsam degradiert werden. Diese

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allererste Phase der Entwicklung steht beim Rind unter der Kontrolle maternaler Genprodukte (DURANTHON u. RENARD 2001). Untersuchungen bei der Maus haben gezeigt, dass ZAR1 ähnlich wie beim Rind vom maternalen Genom exprimiert wird (WU et al. 2003). Mittels RT-PCR konnte bei der Maus nur bis zum 2-Zell-Stadium eine Expression nachgewiesen werden. Zu diesem Zeitpunkt findet bei der Maus die Aktivierung des embryonalen Genoms statt (BOLTON et al. 1984;

TELFORD 1990). Durch Analysen des „transcription requiring complex (TRC)“, einem Marker für die Aktivierung des embryonalen Genoms, wurde festgestellt, dass ZAR1-„knock out“-Embryonen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollgruppen eine niedrige Expression des TRC aufweisen. Das deutet auf eine defiziente Aktivierung des embryonalen Genoms hin und zeigt, dass ZAR1 auch an der korrekten Umschaltung vom maternalen auf das embryonale Genom beteiligt sein kann. ZAR1 trägt weiterhin ein PHD-Motiv und ist wahrscheinlich an der chromatinvermittelten Transkriptionsregulation beteiligt (WU et al. 2003). Proteine, die ein PHD-Motiv besitzen, dienen als Aktivatoren, Repressoren oder Kofaktoren der Transkription (GIBBONS et al. 1997). Dieses Motiv wurde auch bei Proteinen, die an Chromatin-Remodelling und an der Transkriptionshemmung beteiligt sind, nachgewiesen (AAPOLA et al. 2002; ZHOU et al. 2002).

Ähnlich wie bei ZAR1 wurde bei anderen Genen, die an Histonmodifikationen beteiligt sind (SUV39H1, HP1, HAT1 und G9A), ein signifikanter Abfall während der Eizellreifung und nach der Befruchtung festgestellt. Nur HDAC2 zeigte keinen Abfall der Transkriptmenge während der Eizellreifung; erst nach der Befruchtung fiel die Transkriptmenge für HDAC2 ab. Eine hohe HDAC2-Expression konnte in unreifen, gereiften und enukleierten Oozyten festgestellt worden. Dies steht im Gegensatz zu Daten von McGRAW et al. (2003), die eine konstante HDAC2-Expression bis zum 8-16-Zell-Stadium feststellten und erst in bovinen Blastozysten eine deutliche Erhöhung fanden. Durch die aufeinander abgestimmte Aktivität der Histon-acetyltransferasen (HATs) und Histondeacetylasen (HDACs) wird ein jeweils spezifischer Acetylierungsgrad eingestellt (KURDISTANI u. GRUNSTEIN 2003). Die Acetylierung von Lysinresten am Histon H3 an den Positionen K9 und K14 wurde in Promotorregionen aktiver Gene nachgewiesen (AGALIOTI et al. 2002). Die Histone

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H3 und H4 sind in aktiven Genen hyperacetyliert und in inaktiven Genen hypoacetyliert (CLARKE et al. 1993; O’NEILL u. TURNER 1995; GRUNSTEIN 1997).

Zwar ist über die verschiedenen Histonmodifizierungen bei präimplantatorischen Rinderembryonen noch nicht viel bekannt, es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die Prozesse ähnlich wie bei der Maus ablaufen. Immunzytochemisch wurde die Acetylierung der Histone H3 und H4 bei murinen Oozyten und Embryonalstadien untersucht (KIM et al. 2003). Eine globale Deacetylierung findet in Oozyten der Maus während der Meiose statt. Das kann darauf hindeuten, dass die Histondeacetylierung eine Rolle in Reprogrammierungsmechanismen der Genexpression in Eizellen spielt. In diesem Stadium wurden eine Aktivierung der Histon-Deacetylasen und eine Inaktivierung der Histonacetyltransferasen festgestellt (KIM et al. 2003).

Vermutlich spielt die Meiose-spezifische Deacetylierung eine bedeutende Rolle beim Genomremodelling während der maternal-embryonalen Transition (MET). Acetylierungen verschiedener Lysinreste der Histone H3 und H4 (H3-K9, H3-K14, H4-K5, H4-K8, H4-K12, H4-K16) wurden während der Interphase und M-Phase in 1-Zell- und 2-Zell-Embryonen sowie im Blastozysten festgestellt (KIM et al. 2003). Bisherige Untersuchungen beim Rind konnten bei IVP-Embryonen im 4-Zell-Stadium eine Hypoacetylierung und eine erhöhte Acetylierung nach dem 8-16-Zell-Stadium nachweisen. Im Gegensatz dazu war in geklonten Embryonen in allen Entwicklungsstadien eine Hyperacetylierung vorherrschend (SANTOS et al. 2003;

ENRIGHT et al. 2005). Die in dieser Arbeit vorgenommene Quantifizierung der Transkripte für die Histon-Acetyltransferase 1 (HAT1) ergab keine Unterschiede bezüglich der Transkriptmengen in in vitro oder in in vivo produzierten sowie geklonten Blastozysten. Während der Eizellreifung sowie nach der Befruchtung fiel die HAT1-Transkriptmenge ab, was die Ergebnisse von McGRAW et al. (2003) nicht bestätigte. In der Histonacetylierung an Histon H4 bestehen Unterschiede zwischen dem weiblichen und männlichen Genom. Eine höhere Transkriptionsaktivität wurde im väterlichen Pronukleus der Maus in der G1-Phase des Zellzyklus festgestellt (ADENOT et al. 1997). Vermutlich ist diese Erhöhung mit dem Austausch von Protaminen gegen Histone im männlichen Pronukleus verbunden. In der

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befruchteten Eizelle wird das Spermienchromatin zunächst dekondensiert, und die Protamine werden gegen Histone ausgetauscht (NONCHEV u. TSANEV 1990).

Zwischen den elterlichen Genomen besteht eine epigenetische Asymmetrie, wobei das mütterliche Genom mehr Heterochromatin und das väterliche mehr Euchromatin besitzt (REIK et al. 2003).

Das mRNA-Expressionsmuster der Histonmethyltransferasen (HMTs) und des Heterochromatin associated protein 1 (HP1) wurden erstmals in Rinderembryonen im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Das SUV39H1-Gen wird in allen präimplantatorischen Stadien der embryonalen Mäuseentwicklung exprimiert (JEONG et al. 2005). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die beiden untersuchten Histonmethyltransferasen SUV39H1 (Suppressor of variegation 3-9 homolog 1) und G9A (HLA-B associated transcript 8) sowie HP1 (Heteochromatin associated protein 1) während der Embryonalentwicklung beim Rind von der unreifen Oozyte bis zur Blastozyste stadienspezifisch exprimiert werden. Interessanterweise wurde bei 8-16-Zellern eine Spleissvariante von HP1 nachgewiesen. Diese HP1-Spleissvariante wurde nur in diesem Stadium, aber bei Embryonen aus allen Produktionssystemen zusätzlich exprimiert. Dies kann daraufhin deuten, dass diese Variante wesentlich für eine ungestörte Entwicklung benötigt ist.

Die Methylierung von H3-K9 scheint eine wichtige epigenetische Modifikationsstelle zu sein. Sowohl SUV39H1 als auch G9A können an dieser Stelle die Methylgruppen übertragen, was mit einer Repression der Genaktivität verbunden ist (TACHIBANA et al. 2002). Die H3-K9-Methylierung durch SUV39H1 kann durch HP1 erkannt werden und stellt somit eine Grundlage für den Aufbau heterochromatischer Strukturen dar (LACHNER et al. 2001; CHEUTIN et al. 2003). Bei der Maus ist die SUV39H1-abhängige H3-K9-Methylierung für eine korrekte Entwicklung und Gewebedifferenzierung notwendig (PETERS et al. 2001). Die H3-K9-Methylierung ist im väterlichen Pronukleus sehr niedrig oder fast nicht nachweisbar, aber deutlich im mütterlichen Pronukleus bei der Maus (LEPIKHOV u. WALTER 2004). Dieser Unterschied in der H3-K9-Methylierung bleibt bei beiden Genomen bis zum 2-Zell-Stadium unverändert erhalten (ARNEY et al. 2002; LEPIKHOV u. WALTER 2004;

LIU et al. 2004). Erst im 4-Zell-Stadium findet eine de novo H3-K9-Methylierung statt

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(LIU et al. 2004). ARNEY et al. (2002) zeigten eine HP1-Bindung an H3-K9 nach der Befruchtung nur im maternalen Genom. Vermutlich ist das mit einer DNA-Demethylierung, die im väterlichen Genom zu diesem Zeitpunkt stattfindet, verbunden, während das maternale Genom noch gleichmäßig methyliert bleibt (SANTOS et al. 2002). Das lässt vermuten, dass die HP1-Aktivität mit der Aktivität von DNA-Methyltransferasen verbunden ist (BACHMAN et al. 2001).

Bei bovinen geklonten Embryonen kann es zu einer erhöhten DNA-Methylierung kommen, die häufig mit einer verstärkten Methylierung des Lysin 9 an Histon H3 assoziiert ist (SANTOS et al. 2003). In dieser Arbeit wurde in geklonten Blastozysten eine erhöhte Expression von SUV39H1, G9A sowie HP1, die mit männlichen Fibroblasten erstellt worden waren, gegenüber in vivo produzierten Embryonen festgestellt. Bei geklonten Zygoten, die mit weiblichen Fibroblasten als Spenderzellen erstellt worden waren, war SUV39H1-mRNA signifikant unterschiedlich im Vergleich zu Embryonen aus SOF- und TCM-System sowie nach parthenogenetischer Aktivierung. HP1-Transkripte waren in geklonten Zygoten (weibliche Fibroblasten) im Vergleich zu Zygoten aus dem TCM-System erhöht. HAT1-Transkriptmengen waren auch in Zygoten, die aus weiblichen Fibroblasten geklont wurden gegenüber solchen aus dem SOF-System und nach parthenogenetischer Aktivierung erhöht. Als Ursachen kann hier eine fehlerhafte Reprogrammierung und dadurch eine abnormale Genexpression bei geklonten Embryonen vermutet werden. Außerdem wurden Unterschiede zwischen geklonten Embryonen, die mit weiblichen und männlichen Fibroblasten erstellt worden waren, nachgewiesen. Vor allem bei G9A und HP1 in Blastozysten und bei ZAR1 in 8-16-Zellern waren die Transkripte bei geklonten Embryonen (männlichen Fibroblasten) in Vergleich zur Embryonen, die mit weiblichen Fibroblasten erstellt worden waren, erhöht. Offenbar kann das chromosomale Geschlecht der Spenderzellen die Reprogrammierungsvorgänge in geklonten Embryonen beeinflussen. Bei Verwendung männlicher Fibroblasten im Kerntransfer wurden Blastozysten erhalten. Nach elf Transfers konnte aber keine Trächtigkeit etabliert werden, während mit zwei weiblichen Spenderzellpopulationen geklonte Nachkommen produziert werden konnten (NIEMANN et al. 2004).

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Erstmals konnten in dieser Arbeit bei präimplantatorischen Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft Transkripte für Gene, die an der Histonmodifizierung beteiligt sind, nachgewiesen werden. ZAR1 ist ein wichtiges maternales Transkript, das nur bis zum 8-16-Zell-Stadium in Rinderembryonen exprimiert wird und für eine ungestörte Entwicklung bis zur Aktivierung des embryonalen Genoms benötigt wird.

Geklonte Embryonen zeigten veränderte Genexpressionsmuster in Vergleich zu solchen aus In-vivo-Produktion. Abberante Genexpressionsmuster von Histonmethyltransferasen und Heterochromatin Protein 1 (HP1) konnten insbesondere in geklonten Blastozysten gezeigt werden. Auch die Art des chromosomalen Geschlechts der verwendeten Spenderzellen kann die mRNA-Expressionsmuster in geklonten Embryonen beeinflussen und somit zu Abweichungen in der normalen embryonalen Genexpression der histonmodifizierenden Gene führen.

5.2 Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene in einem High-density-cDNA-Microarray

Die cDNA-Array-Technologie hat in letzten Jahren eine rasante Entwicklung erfahren (ARCELLANA-PANLILIO u. ROBBINS 2002). Hohe Sensitivität in Verbindung mit der Miniaturisierung der cDNA-Arrays und der Entwicklung leistungsfähiger Verfahren zur Amplifizierung von RNA aus limitierten Ausgangsproben haben die Anwendung bei präimplantatorischen Embryonen möglich gemacht. Der Hauptvorteil der cDNA-Array-Technologie liegt in der semi-quantitativen Erfassung potentiell aller Transkripte einer biologischen oder klinischen Probe in einem Experiment. Das erleichtert das Auffinden unterschiedlich exprimierter Gene in zwei unterschiedlichen biologischen Proben.

Erstmalig wurden Genexpressionsprofile einzelner präimplantatorischer Säugerembryonen mit einem kleinen cDNA-Array (ca. 100 Gene) von BRAMBRINK et al. (2002a) erstellt. Durch die Entwicklung eines effizienten Amplifikationsprotokolls konnten in einzelnen murinen oder bovinen Blastozysten, die 1,5 ng bzw. 5 ng Gesamt-RNA enthalten (PIKO u. CLEGG 1982; BILODEAU-GOESEELS u. SCHULTZ 1997) etwa 10-15 µg amplifizierte RNA erzeugt werden (BRAMBRINK et al. 2002b).

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Für die Hybridisierung in den Array-Analysen werden vor allem für die fluoreszenzmarkierten Proben mindestens 1 µg mRNA benötigt (BERTUCCI et al.

1999). In den vorliegender Arbeit konnte eine heterologe cDNA-Array-Hybridisierung erfolgreich und reproduzierbar durchgeführt werden, so dass Genexpressionsprofile auch von Embryonen anderer Spezies mit cDNA-Sonden muriner oder humaner Herkunft untersucht werden konnten. Weiterhin konnte ein kleiner boviner „Home-made“-Array erstellt werden, der auf der Grundlage einer cDNA-Bibliothek aus bovinen Blastozysten aufbaute war (WRENZYCKI et al. 2004b). Auf dem Array wurde amplifizierte RNA aus Rinderblastozysten unterschiedlicher Herkunft hybridisiert. Die erhaltenen Daten für ausgewählte Gene, die mittels semi-quantitativer Endpunkt-RT-PCR validiert worden waren, zeigten eine hohe Korrelation zwischen cDNA-Array- und RT-PCR-Daten.

Im Gegensatz zum vollständig sequenzierten humanen Genom und den zahlreichen Genbanken für Maus und Ratte lagen bis vor kurzem nur wenige Daten über das Rindergenom vor. Bislang waren Arrays nur für die Spezies Mensch, Maus und Ratte erhältlich. Ein kommerzielles Rinder-cDNA-Array-System war nicht verfügbar.

Deswegen wurde in dieser Arbeit die Brauchbarkeit eines humanen cDNA-Microarrays für den Nachweis einer mRNA-Expression beim Rind geprüft. Bei Anwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen führte die Hybridisierung des humanen Arrays mit boviner oder humaner cDNA zu ähnlichen Ergebnissen und ermöglichte damit wiederholbar eine Identifizierung ko-exprimierter Genen in Geweben unterschiedlicher Spezies. Mit den Ergebnissen dieser Studie wurde eine wichtige Grundlage für weitergehende Versuche mit Rinderembryonen erhalten. In Zusammenarbeit mit dem Max Planck Institut in Berlin wurden anschließend ein größerer humaner ENSEMBL-Array, der aus 15500 Genen besteht, mit cDNA aus bovinen unreifen Eizellen oder Blastozysten hybridisiert und zahlreiche neue Gene für diese beiden Stadien identifiziert (ADJAYE et al. 2005, Publikation in Vorbereitung).

Die Ergebnisse zeigen, dass bei Einhaltung geeigneter Konditionen auch zwischen zwei Spezies aussagekräftige Expressionsdaten erhalten werden können. Der Korrelationskoeffizient für die Cross-species-Hybridisierung der orthologen Gene lag

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bei 0,94. Die Variabilität in der Genexpression zwischen humanem und bovinem fetalem Gehirn war niedrig. Die genspezifische Endpunkt-RT-PCR-Analyse mit bekannten Primersequenzen erlaubte eine Ko-Amplifikation sowohl humaner als auch boviner orthologer Transkripte. Dadurch konnten viele Gene namentlich bisher nicht charakterisierten bovinen ESTs zugeordnet werden. Humane und porcine orthologe Gene sind durch Cross-species-Hybridisierung mit einen humanen Gehirn Affymetrix Gene Chip mit 22283 Genen untersucht worden (SHAH et al. 2004).

Weiterhin haben DALBIES-TRAN u. MERMILLOD (2003) beim Rind eine Genexpressionanalyse in Oozyten mit einem Atlas human cDNA-Array durchgeführt und etwa 300 Gene, die in Oozyten exprimiert wurden, identifiziert.

5.3 Schlussfolderungen

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Expressionsananalysen bei Genen, die an Histonmodifikationen beteiligt sind, ergaben Unterschiede zwischen Rinderembryonen verschiedener Herkunft. Die Aufdeckung von Unterschieden im mRNA-Expressionsprofil zwischen in vivo und in vitro produzierten oder geklonten Embryonen ist wesentlicher Schlüssel in der Optimierung der In-vitro-Produktion-Systeme und zu Minimierung des Auftretens von Entwicklungsstörungen. Die Kerntransfertechnik ist immer noch durch niedrige Erfolgsraten und Anomalien gekennzeichnet, die häufig bei geklonten Nachkommen beobachtet werden können und als Large Offspring-Syndrome (LOS) bekannt sind (WRENZYCKI et al. 2005a).

Es wird davon ausgegangen, dass diese Störungen durch fehlerhafte Reprogrammierung des somatischen Spenderkerns, durch Abberationen beim Imprinting oder abweichende Genexpressionsmuster aufgrund von mangelhaften Kultivierungsbedingungen für Embryonen verursacht werden. Genomweite epigenetische Veränderungen, insbesondere DNA-Methylierungen und Chromatinveränderungen sind bei geklonten Embryonen beobachtet und mit Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht worden (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003; SANTOS et al. 2003). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie können als ein wichtiges Hilfsmittel für die Optimierung von In-vitro-Produktionssystemen und darüber hinaus für das vertiefte Verständnis über die Expression von Genen, die an

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der Histonmodifikation beteiligt sind, dienen. Die Resultate können auch als wertvolles Modell für assistierte Reproduktionstechnologien (ART) beim Menschen dienen, wo auch ein erhöhtes Risiko in Bezug auf abnormale Entwicklung nach Anwendung von ARTs nachgewiesen wurde (WRIGHT et al. 2005).

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen über eine Cross-species-Hybridisierung zeigen, dass auch mit einem heterologen Microarraysystem aussagekräftige Expressionsdaten erhalten werden können. Eine heterologe cDNA-Array-Hybridisierung kann erfolgreich und reproduzierbar durchgeführt werden, so dass Genexpressionsprofile auch von anderen Spezies mit humaner cDNA-Array erstellt werden können. Eine heterologe Genexpressionsanalyse kann in Zukunft als wichtiges Hilfsmittel für die Aufklärung evolutionär konservierter Mechanismen sowie von Signalwegen in der Kontrolle der Genexpression dienen. Während solcher Analysen können breite, homologe Anteile miteinander verglichen werden, denn die Hybridisierungssonden sind ausreichend lang und kleine Unterschiede in den Nukleotidseqenzen zwischen beiden verschiedenen Spezies beeinträchtigten die Ergebnisse nicht.

Die Entwicklung eines embryospezifischen cDNA-Arrays wäre ein wichtiger Schritt zu einem besseren Verständnis komplexer Regulationsabläufe während der frühen Embryonalentwicklung. Mit dieser Technologie kann eine unbegrenzte Zahl an Transkripten in individuellen Embryonen semiquantitativ nachgewiesen werden.

Dadurch könnte die Entwicklungskompetenz in vitro produzierter Embryonen besser beurteilt werden, was zur Verbesserung der In-vitro-Produktionssysteme für Embryonen sowohl bei Tieren als auch beim Menschen dienen kann. Damit wird auch das Auftreten embryonaler und fetaler Fehlentwicklungen, z.B. das LOS, erniedrigt und die Anzahl gesunder Nachkommen erhöht.

122 6 ZUSAMMENFASSUNG

Monika Anna Nowak-Imiałek

Messenger RNA-Expressionsprofile histon-assoziierter Gene in präimplantatorischen Rinderembryonen und Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene in einem High-density-cDNA-Microarray

Die Epigenetik beinhaltet die Modulation der Genexpression, ohne dass die Nukleotidsequenz betroffen ist. Als Mechanismen, die dafür verantwortlich sind, werden hauptsächlich DNA-Methylierungen und Histonmodifikationen gesehen.

Gene, die Histone modifizieren, spielen eine große Rolle bei der Aufklärung der epigenetischen Steuerung der Genexpression. Beim Rind gibt es wenig Informationen über die Genexpressionmuster histonmodifizierender Gene.

Ein Ziel dieser Arbeit war, das Expressionsmuster von Genen, die an den Histonmodifikationen beteiligt sind, in bovinen präimplantatorischen Embryonen unterschiedlicher Herkunft zu analysieren und dadurch Aufklärung über mögliche frühe Abberationen durch IVP und NT zu erhalten. Durch die RT-PCR ist es möglich, die Expression verschiedener Gene in einzelnen präimplantatorischen Embryonen qualitativ und quantitativ nachzuweisen. Die Erstellung komplexer Expressionsprofile aus biologischen Proben unterschiedlicher Herkunft kann mittels cDNA-Array-Technologie durchgeführt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Eignung von Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene in einem High-density-cDNA-Microarray zu untersuchen.

Mit Hilfe eines semi-quantitativen Endpunkt-RT-PCR-Assays wurde der relative Gehalt folgender Gentranskripte, die in der Histondeacetylierung [Histone deacetylase2 (HDAC2)], Histonacetylierung [Histone acetyltransferase1 (HAT1)], Histonmethylierung [Histonmethyltransferasen (SUV39H1, G9A)],

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Heterochromatin-Entstehung [Heterochromatin Protein 1 (HP1)] und chromatinvermittelten Transkriptionsregulation [Zygote arrest 1 (ZAR1)], eine wichtige Rolle spielen, in Oozyten, Zygoten, 8-16-Zellern sowie Blastozysten untersucht. In die Analysen wurden in vitro fertilisierte [aus zwei verschiedenen Kultursystemen (TCM- und SOF-System)], in vivo gewonnene, geklonte mit adulten weiblichen und männlichen Fibroblasten als Spenderzellen, sowie parthenogenetisch aktivierte (diploides mütterliches Genom) Embryonen untersucht. Ausserdem wurden androgenetische Embryonen (diploides väterliches Genom) in die Analysen mit einbezogen.

Für die semi-quantitative Endpunkt-RT-PCR-Analyse wurde Poly(A)⁺-RNA aus jeweils zwei Embryonen mit Hilfe eines Extraktionssystems (DYNABEADS mRNA DIRECT KIT^®) isoliert. Die isolierte Poly(A)⁺-RNA wurde durch reverse Transkription unter Verwendung von Random Hexamer-Primern und MuLV-Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Der optimierte Reaktionsablauf erfolgte durch den Einsatz von 0,5 Embryonenäquivalenten für ZAR1 und HP1, 0,6 für SUV39H1, 1,0 für HDAC2, 0,4 für HAT1 und 0,3 für G9A durch PCR-Amplifizierung der erhaltenen cDNA während der reverse Transkription. Als exogen hinzugegebender Standard diente Kaninchen-Globin-mRNA. Für jedes Embryonalstadium wurden 5-10 Wiederholungen durchgeführt, nachdem die Amplifikationsbedingungen für jedes genspezifisches Primerpaar zunächst optimiert worden waren. Für die quantitative Auswertung von PCR-Produkten war die Zyklenzahl zu definieren, in der die Amplifikationsphase exponentiell erfolgte. Für die untersuchten Gene wurde eine lineare Amplifikation zwischen 31-34 PCR-Zyklen ermittelt.

Mit Hilfe eines humanen cDNA-Microarrays, der im Max Planck Institut in Berlin erstellt wurde, wurde eine Cross-species-Hybridisierung mit boviner RNA durchgeführt. Zum Nachweis der prinzipiellen Eignung dieses methodischen Ansatzes wurde Gesamt-RNA aus fetalem Gehirn von Mensch und Rind verwendet.

Der humane cDNA-Microarray bestand aus 394 vollständig sequenzierten Genen aus einer humanen cDNA-Kollektion (Human Ensembl set RZPD1.1), die jeweils 20 Mal aufgetragen waren. Es wurden vier Hybridisierungen durchgeführt. Als endogener Standard dienten Haushaltsgene (Housekeeping gene) HPRT und

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actin. Die Arrayergebnisse wurden für ausgewählte Gene, die unterschiedlich exprimiert waren mittels eines semi-quantitativen Endpunkt-RT-PCR-Assays verifiziert. Dazu gehörten Gene, die in der Zellzyklus-Kontrolle sowie in der eukaryontischen Genomreplikation beteiligt sind. Es wurden 3 Wiederholungen durchgeführt.

Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

1. Für die Gene MATER, NANOG, PEG3 und GCN5 konnte trotz vieler Optimierungsversuche kein optimales PCR-Protokoll erstellt wurden und es wurden keine weiteren Versuche zur Darstellung dieser Gene durchgeführt.

2. Für die Gene ZAR1, HDAC2, SUV39H1, G9A, HP1 und HAT1 wurde ein optimiertes PCR-Protokoll ermittelt und unter Anwendung der zuvor optimierten PCR-Bedingungen konnte die mRNA-Expression dieser Gene in präimplantatorischen Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen werden:

A. ZAR1-mRNA fiel während der Eizellreifung und ebenso nach der Befruchtung signifikant ab. In Morulae und Blastozysten konnte das Transkript nicht nachgewiesen werden. Dies deutet auf ein auschliesslich maternales Expressionsmuster hin.

B. Ein signifikanter Abfall der HDAC2-mRNA konnte in Zygoten nach artifizieller Aktivierung, Befruchtung und nach somatischem Kerntransfer im Vergleich zu unreifen und gereiften Eizellen beobachtet werden.

Unterschiede im Transkriptgehalt bestanden zwischen androgenetischen

Unterschiede im Transkriptgehalt bestanden zwischen androgenetischen