Microarray-Technologie

Seitdem im Jahr 1995 an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana der Microarray entwickelt wurde, hat die cDNA-Array-Technologie eine schnelle Entwicklung erfahren und wird in vielen Laboren zur Untersuchung globaler Expressionsmuster eingesetzt (SCHENA et al. 1995). Bei der PCR oder dem Northern Blot können nur

42

einzelne Gene analysiert werden, während es mit der DNA-Array-Technologie möglich ist, die Expression potentiell aller Gene des Genoms gleichzeitig in einem einzigen Experiment zu untersuchen (LOCKHART u. WINZELER 2000).

2.4.2.1 Grundlagen und Anwendung der cDNA-Array-Technologie

DNA-Arrays basieren auf der Hybridisierung der untersuchten Transkripte mit einer komplementären cDNA-Sequenz, die an festes Trägermaterial gebunden ist (SCHENA et al. 1995, 1996; BURGESS 2001). Es sind diverse Arrays von kommerziellen Anbietern zu erhalten, die tausende Sonden pro Array enthalten.

Die Zahl der Sonden pro Array ist unbegrenzt (NAKANISHI et al. 2001).

Man unterscheidet je nach verwendetem Trägermaterial, Nukleinsäureart und Art der Immobilisierung drei Klassen: Microarrays, Macroarrays und Oligo-Arrays (GRANJEAUD et al. 1999). Als Trägermaterialen wurden zu Beginn flexible Membranen wie Nitrocellulose-, Propylen- oder Nylonmembranen benutzt, auf die PCR-Produkte, Plasmid-Klone sowie auch lange Oligonukleotide als Sonden mechanisch oder manuell aufgebracht wurden (TODD u. WONG 2002).

Die Proben wurden radioaktiv markiert (Biotin oder Digoxigenin) und autoradiographisch auf Röntgenfilmen detektiert. Ein Nachteil war, das die Membran-Arrays „Macroarrays“ meist mit einem großen Volumen von 5-50 ml Hybridisierungspuffer hybridisiert werden mussten, wodurch die Probe stark verdünnt wurde. Bei Glas-Arrays wird mit nur 5-200 µl erfolgreich hybridisiert (SCHENA et al.

1996). Aufgrund des porösen Trägermaterials wird auch eine große Menge an Sondenmaterial für den Auftrag benötigt. Die Sonden werden aus einer spezifischen Pufferlösung mittels Mikrokapillare oder Spotter-Nadel direkt auf das jeweilige Substrat übertragen (OKAMOTO et al. 2000). Ein starker Trend zur Miniaturisierung der Arrays resultierte in der Microarray-Technologie mit solideren, nicht-porösen Trägermaterialien wie Glas oder Plastik (DOLAN et al. 2001).

Die Glasobjektträger wurden mit Poly-Lysin oder Aminosilan beschichtet, um Hydrophobie sowie Adhärenz der angelagerten DNA zu erhöhen.

Die DNA-Sonden werden meist mit Hilfe vollautomatischer Roboter (sogenannter Arrayer) auf die Glasoberfläche aufgebracht. Wie bei Macroarrays werden hier auch

43

PCR-Produkte, lange Oligonukleotide und Plasmid-Klone als DNA-Sonden verwendet. Oligo-Arrays besitzen Oligonukleotide, die in situ auf der Glasoberfläche unter Verwendung photolithographischer Techniken synthetisiert werden.

Die Array-Technologie ermöglicht es, Expressionsdaten zweier biologischer Proben zu vergleichen und die Unterschiede in ihrer Genexpression nachzuweisen (SCHENA 1999). DNA-Chips haben auch eine wichtige Bedeutung in der pharmazeutischen Industrie, wo der Effekt eines Pharmazeutikums auf die Genexpression von Zellen untersucht werden kann (DEBOUCK u. GOODFELLOW 1999). Weitere Anwendungsfelder ergaben sich vor allem in der molekulargenetischen Diagnostik zum Nachweis der Genexpression in Tumor- und Normalgewebe sowie bei genetisch bedingten Krankheiten (KHAN et al. 1999).

2.4.2.2 Herstellungsprozess und Ablauf einer cDNA-Array-Analyse

Als Sonden werden sowohl cDNAs, Oligonukleotide oder ESTs (expressed sequence tag) eingesetzt. Meistens basieren die Microarrays auf cDNA-Bibliotheken, bei denen die klonierten cDNA-Fragmente mittels PCR amplifiziert, aufgereinigt und anschließend auf den präparierten Glasobjektträger aufgebracht werden. Mehrere Zehntausend einzelne cDNA-Sonde werden an unterschiedlichen Stellen des Arrays unter Verwendung von Robotern (Arrayer) aufgetragen (HEGDE et al. 2000). Zur Untersuchung einer Zelle oder Gewebes wird die mRNA aus einer Probe qualitativ aufgereinigt. Dieser Schritt ist besonders kritisch bei Arrayexperimenten, denn Verunreinigungen können zur einen unspezifischen Bindung führen.

Die aus Gewebe oder Zellen isolierte mRNA wird für die Hybridisierung markiert (Abb. 8). Am häufigsten werden für die Markierung die Farbstoffe Cye3-dUTP und Cye5-Cye3-dUTP verwendet (YE et al. 2001). Dies erfolgt während der reversen Transkription. Eine Markierung mit zwei Farbstoffen, die ein unterschiedliches Emissions- und Exitationsspektrum aufweisen, ermöglicht die gleichzeitige Analyse zweier Proben (z.B. krankes und gesundes Gewebe, verschiedene Embryonalstadien). Die markierten Proben hybridisieren ausschließlich mit den komplementären Strängen der cDNA-Sonde, sofern sie sich auf der Glasoberfläche befinden. Nach der Hybridisierung schließen sich Detektierung, Quantifizierung der

44

erhaltenen Signalstärke und Datenanalyse an (HEDGE et al. 2000). Für die Detektion des Arrays werden Array-Scanner benutzt, die auf dem Prinzip der konfokalen Laserscanningmikroskopie basieren (YE et al. 2001).

Als erstes erfolgt die Normalisierung der gewonnenen Rohdaten, um die Hybridisierungen miteinander vergleichbar zu machen. Zur Normalisierung werden meistens die absolute Signalintensitäten aller auf dem Array befindlicher Gene, ebenso externe als auch die interne Kontroll-cDNA-Sonden (Housekeeping genes) verwendet (YANG et al. 2002b). Die DNA-Analysen liefern extrem große Datenmengen. Auswertung und Datenanalyse großer Arrays, die mehrere tausend cDNA-Sonden haben, erfolgen über zahlreiche Softwaretools und benötigen erhebliche Expertise aus der Bioinformatik (BRAZMA u. VILO 2001).

Abb. 8: Schematischer Ablaufs einer cDNA-Array-Analyse.

REVERSE TRANSKRIPTION/

45

2.4.2.3 Grenzen und Probleme der cDNA-Array-Analyse bei präimplantato-rischen Embryonen

Nachdem vor einigen Jahren erste cDNA-Arrays entwickelt wurden, hat die Technologie in der jüngsten Vergangenheit enorme Fortschritte gemacht und die Anzahl der Anwender dieser Methode hat stark zugenommen. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass man unter Umständen auf firmenspezifische und sehr teure Reagenzien zurückgreifen muss, was mit hohen Kosten verbunden ist. Ein weiteres bedeutendes Problem ist, dass die Array-Technologie relativ wenig sensitiv ist.

Die meisten konventionellen Protokolle benötigen für den Hybridisierungschritt 1-5 µg markierte mRNA für eine ausreichende Signalintensität (HEDGE et al. 2000).

Deshalb sind Zelllinien besonders gut für Microarrayexperimente geeignet, weil sie ausreichende Mengen an RNA liefern können (BOWTELL 1999).

Ein großes Problem sind Versuche, bei denen nur eine limitierte, geringe Menge an RNA zur Verfügung steht. Dies trifft insbesondere auf Versuche zu, die mit präimplantatorischen Embryonen oder bestimmten menschlichen Geweben durchgeführt werden. Aus einer einzelnen murinen Blastozyste sind nur etwa 1,5 ng Gesamt-RNA zu extrahieren und aus einer einzelnen bovinen Blastozyste etwa 4-5 ng Gesamt-RNA (PIKO u. CLEGG 1982; BILODEAU-GOESEELS u. SCHULTZ 1997). Es wurden verschiedene Materialvermehrungs-Techniken entwickelt, um sehr kleine mRNA-Mengen - ohne das Verhältnis der einzelnen RNAs zueinander zu verändern - für eine cDNA-Array-Analyse zu amplifizieren. Wenn nicht ausreichend Material zur Verfügung steht kann eine Prä-Amplifizierung mit Hilfe der T7-RNA-Polymerase durchgeführt werden (EBERWINE 1996). BRAMBRINK et al. (2002b) haben erstmalig Genexpressionsprofile aus einzelnen präimplantatorischen Embryonen von Maus und Rind über einen cDNA-Array nachgewiesen.

Zur Amplifikation der embryonalen RNA wurde eine Kombination von zwei Verfahren angewendet. Nach Konvertierung den extrahierten mRNA in cDNA mittels einer globalen PCR wurde voramplifiziert und dann die voramplifizierte cDNA als Template in einer T7-IVT-Reaktion eingesetzt. Durch dieses Amplifikationsprotokoll konnten aus einzelnen murinen oder bovinen Blastozysten etwa 10-15 µg amplifizierte RNA (aRNA) erzielt werden (BRAMBRINK et al. 2002b).

46

Ein weiteres großes Problem bei Expressionanalysen biologischer Proben anderer Säuger als Mensch, Maus und Ratte, für die bereits zahlreiche cDNA-Arrays von kommerziellen Anbietern zur Verfügung stehen, stellt die lückenhaft aufgeklärte genomische DNA-Sequenz anderer Spezies dar. Bislang war nur ein kleiner Teil des bovinen Genoms sequenziert und somit die Erstellung von cDNA-Arrays mit bovinen Sonden stark eingeschränkt war. Deswegen wurden bei diesen Spezies Cross-species-Hybridisierungen mit cDNA-Arrays von anderen Spezies zur Analyse angewendet. Beim Schwein und Rind wurden die Genexpressionsanlaysen erfolgreich über ein heterologes Microarraysystem mit einem humanen cDNA-Array durchgeführt (ADJAYE et al. 2004; SHAH et al. 2004). In einer weiteren erfolgreichen Cross-species-Hybridisierung wurde mittels eines Affymetrix-humanen-high-density- oligonucleotide-Arrays der Nachweis von Leber- und Herz-RNA von Hund, Rind und Schwein geführt (JI et al. 2004). DALBIES-TRAN u. MERMILLOD (2003) haben mit einem Atlas-human-cDNA-Array beim Rind eine Expressionanalyse in Oozyten durchgeführt. Nachdem im Herbst 2004 erstmals ein vollständiger Entwurf der bovinen Genkarte vorlag, wurde ein boviner cDNA-Array erstellt und die Genexpression von ungereiften Oozyten bis zu Blastozysten untersucht (SIRARD et al. 2005). Des Weiteren entwickelte Affymetrix den Gene Chip Bovine-Genome-Array, der kommerziell erhältlich ist.

47 3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Erstellung von Rinderembryonen verschiedener Herkunft