Als Telomeren werden die Enden linearer Chromosomen von Eukaryonten bezeichnet, die aus einer DNA-Komponente und verschiedenen Proteinen bestehen (ZAKIAN 1995). Die DNA der Telomeren besteht aus sich wiederholenden Basenhexameren. Beim Menschen handelt es sich um eine kurze G-reiche Sequenz –TTAGGG-, die zu mehreren Tausenden Wiederholungen am Ende der Chromosomen vorkommen kann (MOYZIS et al. 1988; MEYNE et al. 1989). Die Telomeren stabilisieren die Chromosomenenden und schützen sie vor enzymatischer Degradation, Rekombination sowie Fusion mit anderen Chromosomenenden, was für die korrekte Weitergabe der Erbinformation wichtig ist (BLACKBURN 1991; XU u.
15
YANG 2003). Neben der Schutzfunktion spielen die Telomeren auch bei der Paarung der homologen Chromosomen während der Meiose und bei der Interaktion zwischen Chromosomen und der Kernmatrix während der Zellteilung eine wichtige Rolle (DE LANGE 1992; MORIN 1997). An allen Chromosomenenden gehen geringe Mengen an DNA-Sequenz während der Zellteilung verloren (WATSON 1972).
Die Verkürzung der DNA führt nicht zum Verlust der gen-kodierenden Sequenzen, sondern lediglich zu einer Verkürzung der Telomer-DNA. Verantwortlich hierfür ist die semikonservative Replikation, die von der DNA-Polymerase durchgeführt wird.
Die DNA-Polymerase benötigt einen 8-12 bp umfassenden RNA-Primer um die Polymerisierung in 5’-3’ Richtung zu starten. Nach Beendigung der Polymerisierung werden die Primer entfernt und durch DNA aufgefüllt. Am 5’-Ende der neusynthetisierten Stränge können jedoch die RNA-Primer nicht ersetzt werden, was zu einer replikationsabhängigen Verkürzung der Chromosomen führt (WATSON 1972; XU u. YANG 2003; MEERDO et al. 2005). Es wird geschätzt, dass pro Zellteilung etwa 50-200 Basenpaare der Telomerensequenz verloren gehen (LEVY et al. 1992; HARLEY et al. 1990). Somit könnte die Länge der Telomeren als eine Art
„mitotische Uhr“ der Replikationsfähigkeit somatischer Zellen dienen, deren Teilungsfähigkeit mit dem Aufbrauchen telomerer Sequenzen erschöpft ist (HARLEY 1991). Eine Verkürzung der Telomeren reduziert die Teilungsfähigkeit der Zellen und wird mit dem Auftreten von Tumoren, Alterungsprozessen und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht (DE LANGE 2002).
Einzelne Zelltypen können durch die Reaktivierung des Enzyms Telomerase die Chromosomen wieder stabilisieren und einen Wachstumsstopp verhindern (SHAY u. WRIGHT 2001). Das Enzym Telomerase setzt sich aus RNA-Komponenten, die als Matrize für die Synthese von Telomeren-DNA-Sequenzen dienen, und einer reversen Transkriptase, welche die katalytische Untereinheit des Enzyms ist, zusammen. Das Enzym ermöglicht eine Neusynthese von DNA an den Telomerenden. Die Aktivität der Telomerase wird von mehreren Telomerase-bindenden Proteinen moduliert (CONG et al. 2002). Schwache Telomeraseaktivität wurde in frühen Teilungsstadien beim Rind nachgewiesen, während das Enzym in Blastozysten intensiv aktiv ist (XU u. YANG 2000; BETTS u. KING 1999).
16
Verschiedene Studien mit geklonten Embryonen haben ergeben, dass sich die Telomeren von denen der Kontrollembryonen nicht unterschieden haben (WAKAYAMA et al. 2000; XU u. YANG 2000; TIAN et al. 2000; BETTS u. KING 1999; LE et al. 2004). Im Morulastadium von Rinderembryonen verschiedener Herkunft (Kerntransfer, In-vivo- und In-vitro-Befruchtung) war die Telomerenlänge im Vergleich zu der von Blastozysten signifikant verkürzt. Telomeraseaktivität war im Morulastadium kaum nachweisbar, in Blastozysten aber intensiv festzustellen (SCHAETZLEIN et al. 2004). Das bedeutet, dass während der frühen Embryogenese, beim Übergang von der Morula zur Blastozyste, Telomere wieder auf normale Länge gebracht werden können.
17 2.2.5 Histonmodifizierungen
In eukaryontischen Zellen bildet die DNA des Zellkerns mit Proteinen einen Komplex, der als Chromatin bezeichnet wird. Das Chromatin hat eine hochdynamische Struktur, die verschiedensten Veränderungen, abhängig vom funktionellen Status der Zelle, unterliegt. Die sich wiederholende Grundeinheit des Chromatins ist das Nukleosom, das aus einem Histonoktamer, das um die DNA gewunden ist, besteht (LUGER et al. 1997; ROLOFF u. NUBER 2005). Das Histonoktamer setzt sich aus je zwei H2A/H2B-Dimeren und einem H3/H4-Tetramer zusammen, die die Kern-Histone bilden (Abb. 2; HAYES et al. 1991). Jeder Histon-Kern besteht aus einer globulären Domäne, die für die Histon-Histon- und Histon-DNA-Kontakte verantwortlich ist, und je einer Amino- (NH2) und Carboxy- (COOH) terminalen Domäne (HORN u.
PETERSON 2002).
Abb. 2: Strukturschema des Histons (SPOTSWOOD u. TURNER 2002).
Histone bestehen aus zentralen globulären Domänen und flexiblen Armen, die posttranslationell modifiziert werden können.
Histonmodifizierungen: acK (Lysin-Acetylierung), meR (Arginin-Methylierung),
meK (Lysin-Methylierung), PS (Serin-Phosphorylierung), uK (Lysin-Ubiquitinierung)
18
Die N- und C-terminalen, flexiblen Arme des Histons können durch bestimmte Enzyme kovalent modifiziert werden. Aufgrund der posttranslationellen Modifizierungen spielen die Histone eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression. Neben Acetylierung (Lysin) und Deacetylierung sind auch Methylierung (Lysin, Arginin), Phosphorylierung (Serin/Threonin), Ubiquitinierung (Lysin) und ADP-Ribosylierung möglich (CHEUNG et al. 2000; GRANT 2001; SPOTSWOOD u. TURNER 2002).
2.2.5.1 Histonacetylierung
Die Acetylierung ist die am besten untersuchte Modifikation, die vor allem an den Histonen H3 und H4 stattfindet und eine bedeutende Rolle bei Genregulation spielt.
Enzyme, welche die Acetylierung durchführen, werden als Histonacetyltransferasen
(HATs) bezeichnet. Sie übertragen Acetylreste von Acetyl-CoA auf die ε-Aminogruppen eines Lysins. Diese Übertragung neutralisiert die positive Ladung
der Aminogruppe (KUO u. ALLIS 1998). Es wird davon ausgegangen, dass die Neutralisierung der positiven Ladung die Bindungen zwischen Histonen und negativ geladener DNA schwächt, mit einer Auflockerung der Chromatinstruktur verbunden ist und die Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren an diesen Bereich erleichtert (GRANT u. BERGER 1999; ROTH et al. 2001). Histone in transkriptonsaktiven Bereichen des Chromatins (Euchromatin) sind hyperacetyliert, während sie in inaktiven Chromatinbereichen (Heterochromatin) hypoacetyliert sind (Abb. 3;
GRUNSTEIN 1997). Gegenspieler der Histonacetyltransferasen sind die Histondeacetylasen (HDACs), die Lysinreste deacetylieren und für die Bildung einer positiven Ladung verantwortlich sind (KUO u. ALLIS 1998; GRANT 2001;
MARMORSTEIN 2001). Viele Koaktivatoren der Transkription besitzen Histonacetyltransferase-Aktivität (BROWN et al. 2000). Aufgrund der Lokalisation werden Typ A (nukleäre) und Typ B (zytosolische) HATs unterschieden (BROWNELL u. ALLIS 1996; ROTH u. ALLIS 1996). Es sind drei Familien von nukleären HATs bekannt; die GNAT-, MYST- und die p300/CBP-Familie (ROTH et al. 2001).
Die GNAT-Familie (Gcn5-related N-acetyltransferases) umfasst Proteine, die sowohl bei der Transkriptionsaktivierung (GCN5 und PCAF) als auch bei der Transkriptionelongation (Elp3) beteiligt sind. Sie besitzen außer einer HAT-Domäne,
19
eine Bromodomäne, womit vermutlich acetylierte Lysinreste erkannt werden (DHALLUIN et al. 1999; OWEN et al. 2000). Proteine, die die MYST-Familie repräsentieren, besitzen eine cysteinreiche Region, die durch eine Chromodomäne, die sich am N-Teminus befindet, von methylierten Lysinresten erkannt werden (TAKECHI u. NAKAYAMA 1999). Die Proteine der p300/CBP Familie sind durch eine Bromodomäne sowie ein cysteinreiches Motiv gekennzeichnet und dienen als Koaktivatoren für mehrere Transkriptionsfaktoren (GRANT 2001). Viele bekannte HATs bilden zusammen mit weiteren HATs oder anderen Kofaktoren (z.B. TAFII250/PCFA/GCN5) multiple Histonacetyltransferase-Komplexe, die vermutlich weitere Proteinkomplexe rekrutieren oder bilden können (CARROZZA et al. 2003).
Der humane P/CAF-Komplex und der yGcn5-Komplex der Hefen gehören zu den bestcharakterisierten HAT-Komplexen (ROTH et al. 2001).
Abb. 3: Schematische Darstellung der Entstehung eines Eu- und Heterochromatins (modifiziert nach GRANT 2001).
Acetylierung (Ac) durch Histonacetyltransferasen (HATs) rekrutiert andere Transkriptionsregulatoren, die u.a. eine Bromodomäne besitzen, und führt zur Entstehung eines aktiven Euchromatins und somit zur Genexpression. Die Methylierung (Me) von Histonmethyltransferasen (HMT) rekrutiert HP1 (Heterochromatin-associated Protein 1) und führt zur Entstehung eines inaktiven Heterochromatins.
Ac
AktivesEuchromatinEuchromatin InaktivesInaktivesHeterochromatinHeterochromatin
Ac
Bromo BromoBromoBromoBromo HAT
Chromo ChromoChromoChromoChromo HMT
AktivesEuchromatinEuchromatin InaktivesInaktivesHeterochromatinHeterochromatin
20 2.2.5.2 Histonmethylierung
Die Histonmethylierung wurde 1964 von Murray nachgewiesen. Aber es war lange noch unklar, welche genaue Funktion diese Modifikation hat (MURRAY 1964).
Erst 35 Jahre später konnte ein Zusammenhang zwischen Transkription und Histonmethylierung nachgewiesen werden (CHEN et al. 1999). Die Histonmethylierung wird von Histonmethyltransferasen (HMTs) durchgeführt. Sie übertragen eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin auf Lysin oder Arginin in der NH2-terminalen Region der Histone H3 und H4. Die Methylierung von Lysinresten durch Histon-Lysin-Methyltransferasen findet am Histon H3 an den Positonen K4, 9, 27, 36 und 79 und am Histon H4 an K20 statt (VAN HOLDE 1988; STRAHL et al.
1999; SIMS et al. 2003). Als erste lysinspezifische Histonmethyltransferasen wurden Proteine der SU(VAR)3-9-Familie von Drosophila, Maus und Mensch entdeckt.
Sie methylieren Histon H3 am Lysin 9 und besitzen eine katalytische SET-Domäne, die für ihre Aktivität verantwortlich ist (REA et al. 2000). Diese Domäne wurde nach den drei Proteinen SU(VAR)3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax bezeichnet, wo sie vorhanden ist (TSCHIERSCH et al. 1994; JENUWEIN et al. 1998). Auβer SET-Domäne sind auch zwei weitere cysteinreiche, flankierende SET-Domänen für die enzymatische Aktivität des SUV39H1 Gen wichtig, die prä-SET-Domäne und die post-SET-Domäne (REA et al. 2000; ZHANG u. REINBERG 2001). Die Histonmethyltransferasen, die den cysteinreichen Domänen fehlen, haben ihre HMTs Aktivität in vitro verloren (REA et al. 2000). Es existieren weitere Proteine mit SET-Domänen, die eine H3-K9-Methyltransferaseaktivität aufweisen. Neben SUV39H1 und SUV39H2 sind bei der Maus ESET (YANG et al. 2002a) und G9A zu nennen (TACHIBANA et al. 2002). Methylierte Histone können je nach Position der methylierten Lysinreste aktivierende wie auch hemmende Effekte auf die Genexpression haben (HAKE et al. 2004). Lysin 9 in H3 kann sowohl methyliert als auch acetyliert sein. Abhängig davon, was für eine Gruppe am Lysin bindet, wird Euchromatin oder Heterochromatin gebildet. Dimethylierungen an H3-K9 und Trimethylierungen an H3-K27 stehen mit der X-Chromosom-Inaktivierung bei Säugern im Zusammenhang und mit der Repression der Genexpression (HEARD et al. 2001; BOGGS et al. 2002; PETERS et al. 2002). Die Methylierung von Argininen
21
ist weniger gut untersucht und erfolgt an den Aminogruppen des Guanidinorestes durch Enzyme, den Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs; GARY u. CLARKE 1998). Argininmethylierungen finden am Histon H3 an R2, R17 und R26 sowie am Histon H4 an R3 statt (LI et al. 2002). Die PRMTs besitzen keine SET-Domäne, sondern eine zentrale katalytische Domäne. Die Protein-Arginin-Methyltransferasen werden aufgrund ihrer Fähigkeit zur asymmetrischen oder symmetrischen Bindung der zweiten Methylgruppe an den Guanidinorest in zwei Enzymklassen unterteilt.
Die Typ I Klasse beinhaltet die Enzyme, die die asymmetrische Bildung von NG,NG-Dimethylargininresten katalysieren. Typ-II-Enzyme sind an der Entstehung symmetrischer NG,N’G- Dimethylargininreste beteiligt (ZHANG u. REINBERG 2001).
Die Methylierung von Argininen in Histon H3 und H4 führt zur transkriptionellen Aktivierung und erleichtert die nachfolgende Acetylierung (WANG et al. 2001;
ZHANG u. REINBERG 2001).
2.2.6 Zusammenhang zwischen Histonmodifikationen und DNA-Methylierung