Kleintiere

Eine Reihe von Untersuchungen belegt das weltweite Vorkommen von MRSA beim Kleintier. Eine Auswahl dieser soll verdeutlichen, bei welchen Tierarten und welche MRSA Typen vorkommen.

O´MAHONY et al. (2005) konnten bei Hund, Katze, Kaninchen und Seehund MRSA nachweisen. Des Weiteren schlossen die Autoren, dass eine direkte Übertragung zwischen tierbetreuenden Personen und ihren Tieren möglich ist, da bei beiden der gleiche MRSA Typ (ST22) gefunden wurde (O´MAHONY et al. 2005).

WALTER et al. (2008) untersuchten in einer Studie in der Kleintierklinik der Freien Universität Berlin 869 Proben, die größtenteils von Wunden von verschiedenen Tierarten stammten. Dabei konnten sie bei Hunden (8%), Katzen (10%), Ziervögel

(2%), Kaninchen, Meerschweinchen, einem Papagei, einer Schildkröte und einer Fledermaus MRSA isolieren. Es wurden vorrangig MRSA ST22 nachgewiesen (WALTER et al. 2008). LOEFFLER et al. (2010) sehen Haustiere eher als kontaminierte Vektoren und nicht als ein wirkliches Reservoir für MRSA. Sie untersuchten insgesamt 704 Hunde und 540 Katzen. Davon waren 15 Hunde und acht Katzen MRSA-positiv (überwiegend ST22). Die Risikofaktoren „Chronische Erkrankungen, Antibiotikatherapie, mehrmalige Hospitalisierung und das Vorhandensein von anderen Koagulase-positiven Staphylokokken“ konnten mit einem positiven MRSA-Status signifikant assoziiert werden, doch die Autoren gaben zu bedenken, dass aufgrund der geringen Anzahl MRSA-positiver Tiere die statistische Auswertung nur eine geringe Aussagekraft besitzt. Sie schlussfolgern, dass Tiere keinen besonderen nosokomialen Risikofaktoren unterliegen. Dennoch können sie bestätigen, dass Tiere, die in den veterinärmedizinischen Einrichtungen vorstellig wurden, tendenziell eine höhere MRSA Nachweisrate haben als gesunde Tiere in gewohnter Umgebung (LOEFFLER et al. 2010).

Zahlreiche Studien belegen, dass eine Übertragung zwischen Haustier und seinem Menschen gelingt. Ein weiterer Hinweis dafür ist die Tatsache, dass der MRSA ST22, der zu den healthcare-acquired MRSA gehört, ebenso bei Haustieren, die meist in engem Kontakt zu ihren Menschen stehen, gefunden werden (O´MAHONY et al. 2005; BOOST et al. 2007; SING et al. 2008; LOEFFLER et al. 2010).

3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Studienmodell

Das Verbundprojekt „MRSA-Problematik bei Nutztieren“ ist ein vom Bundesministerium für Landwirtschaft, Ernährung und Verbraucherschutz gefördertes Projekt. Eingebettet in dieses Projekt beschäftigen sich zwei Teilprojekte mit dem Vorkommen von MRSA in Schweinebeständen. Diese Arbeit wurde auf der Grundlage des Teilprojektes „MRSA Vorkommen bei Mastschweinen“ angefertigt.

Projekt-übergreifend wurde ein zweistufiges Studienmodell gewählt, das aus einer Querschnittsstudie und der sich anschließenden Longitudinalstudie besteht. Diese sind ebenfalls in zwei Unterstufen unterteilt. Nachfolgende Abbildung 2 zeigt das zweistufige Studienmodell dieser Arbeit.

Abbildung 2: Studienmodell des Teilprojektes „MRSA bei Mastschweinen“

3.2 Auswahl der Bestände für die Querschnittsstudie

Zur Ermittlung der Herdenprävalenz und einer groben Schätzung der Intraherdenprävalenz von MRSA in Schweinemastbeständen wurde eine Querschnittsstudie durchgeführt.

2. Longitudinalstudie

1.1. Umgebungsstaubprobenentnahme 1.2. Nasentupferprobenentnahme

2.1. Beprobungen Mastdurchgang I 2.2. Beprobungen Mastdurchgang II Gesamtstudie

1. Querschnittsstudie

Es wurden Mastbestände in den Regionen Niedersachsen, Nordrhein-Westfalen und Ostdeutschland gesucht. Die regionale Einteilung erfolgte aufgrund von landwirtschaftlich strukturellen Unterschieden. So unterscheidet sich Niedersachsen als schweinedichte Region im Raum Weser-Ems beispielsweise von den östlichen Bundesländern. Die östlichen Bundesländer hingegen wurden als ostdeutsche Region zusammengefasst, da die dortige Schweineproduktion eher durch einzeln und weit voneinander entfernt liegende Bestände mit größeren Tierzahlen gekennzeichnet ist. Der Norden Nordrhein-Westfalens weist ebenfalls schweinedichte Bezirke auf. Aber auch die schweinedichten Regionen Niedersachsens und Nordrhein-Westfalens unterscheiden sich in ihrer Struktur. So weisen die niedersächsischen schweinedichten Bezirke tendenziell eher Mastbestände auf, während in Nordrhein-Westfalen eher Zuchtbestände zu finden sind. Die folgenden Abbildungen (Abbildung 3 und Abbildung 4) zeigen jeweils eine Deutschlandkarte: die linke Abbildung (nach H. Bäurle 2006) stellt die deutschlandweite Schweinedichte dar. Demgegenüber soll die rechte Abbildung (modifiziert, www.landkarte - direkt.de), die geographische Lage von zwölf Studienbeständen, die für eine Intraherdenprävalenzschätzung in den Regionen ausgewählt wurden veranschaulichen.

Abbildung 3: Schweinedichte Deutschlands

nach Bäurle (2006) Abbildung 4: Ausgewählte Mastbestände

Untersuchungsschritte der Querschnittsstudie:

Im ersten Schritt wurden Mastbestände innerhalb der Regionen mit Hilfe der Außenstelle für Epidemiologie Bakum der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover ausfindig gemacht und jeweils mittels einer Umgebungsstaubprobe beprobt, welche im selektiven Anreicherungsverfahren auf MRSA untersucht wurde.

Dies erlaubte eine erste Einteilung der Bestände in die Gruppen MRSA-positiv und MRSA-negativ definiert bezogen auf die Staubprobe.

Im zweiten Schritt wurden aus diesem geschaffenen Bestandspool vier Bestände pro Region mit möglichst unterschiedlichen Organisationsformen ausgewählt und mittels Nasentupferproben von 60 Schweinen beprobt. Des Weiteren wurde angestrebt pro Region ein Bestand mit Ferkeln aus eigener Aufzucht, ein Bestand mit Ferkeln aus nur einer Herkunft, ein Bestand mit Ferkeln mehrerer Herkünfte aber getrennter Haltung und ein Bestand mit völliger Durchmischung von Ferkeln aus vielen Herkünften in einem Abteil auszuwählen.

Die 60 Nasenabstriche wurden nach dem Zufallsprinzip von eingestallten Tieren eines unbestimmten, laufenden Mastdurchganges entnommen und auf MRSA in einem zweistufigen Verfahren wie folgt untersucht:

1. Untersuchung von zwölf Nasenabstrichen auf MRSA im Einzelansatz im Anreicherungsverfahren

2. Untersuchungen der restlichen 48 Nasenabstriche in insgesamt zwölf Pools à vier Tupfer auf MRSA im Anreicherungsverfahren

Dieses zweistufige Verfahren wurde ausgewählt, da es zum einen die Schätzung der Intraherdenprävalenz eines Bestandes durch die im Einzelansatz untersuchten zwölf Nasenabstriche zulässt und zum anderen die Einordnung eines Bestandes in einen MRSA-negativ definierten Status durch das Untersuchen der übrigen 48 Tupfer in zwölf Poolproben ermöglicht.

Ein Bestand wurde als MRSA-negativ definiert, wenn die Staubprobe und die insgesamt 60 untersuchten Nasenabstriche ein MRSA-negatives Ergebnis aufwiesen.

Alle zwölf im zweiten Schritt der Querschnittsstudie untersuchten Bestände wurden für eine weitere Untersuchung in der sich anschließenden Longitudinalstudie ausgewählt.

3.3 Auswahl der Bestände für die Longitudinalstudie

Für die Longitudinalstudie wurden zwölf Mastbestände (Abbildung 4), je vier Bestände pro Region, ausgewählt, die im Folgenden näher beschrieben werden.

3.3.1 Niedersachsen Bestand 1:

Der Mastbestand 1 liegt im süd-westlichen Niedersachsen im Landkreis Emsland.

Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus einer Herkunft. Auf dem Hof sind zwei Mastställe vorhanden. Der größere Maststall stand für die Longitudinalstudie zur Verfügung. Die Gesamtkapazität liegt bei 856 Mastplätzen. Des Weiteren betreibt der Landwirt in etwa 500 m Luftlinie zu den Schweineställen entfernt drei Masthähnchenställe.

Bestand 2:

Der Mastbestand 2 liegt im oldenburgischen Münsterland im Landkreis Vechta. Es handelt sich hierbei um ein geschlossenes System. Die Mastläufer stammen aus der eigenen Sauenanlage, die jedoch außerhalb der Hofanlage liegt. Der Bestand ist im Laufe der Jahre gewachsen und weist daher unterschiedliche Stallungen auf. Die Gesamtkapazität aller Mastställe auf der Hofanlage liegt bei 680 Mastplätzen.

Bestand 3:

Der Mastbestand 3 liegt im süd-westlichen Niedersachsen im Landkreis Emsland an der Grenze zur Grafschaft Bentheim. Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus zwei Herkünften. Die Läufer werden durchmischt eingestallt. Die Gesamtkapazität liegt bei 650 Mastplätzen. Zudem werden auf der Hofanlage Mastbullen gehalten. Ebenfalls zum Hof gehörig sind die zwei in ca. 600 m Luftlinie liegenden Masthähnchenställe.

Bestand 4:

Der Mastbestand 4 liegt im nord-westlichen Niedersachsen in der Gemeinde Saterland. Der Mäster bezieht seine Mastläufer von verschiedenen Herkünften. Die Läufer werden getrennt eingestallt. Die Gesamtkapazität des Stalles liegt bei 1033 Mastplätzen. Auf dem Hof werden auch Rinder gehalten.

3.3.2 Nordrhein-Westfalen Bestand 5:

Der Mastbestand 5 liegt im mittleren-östlichen Nordrhein-Westfalen im Kreis Soest in der Gemeinde Anröchte. Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus drei Herkünften.

Die Gesamtkapazität liegt bei 1900 Mastplätzen. Die Hofanlage befindet sich in Alleinlage und ist von Feldern umringt. Das Trinkwassersystem der Mastschweine beinhaltet ein Bioresonanzsystem, welches nach dem Prinzip der Vertreibung von Bakterien mittels Schwingungserzeugung arbeitet.

Bestand 6:

Der Mastbestand 6 liegt im östlichen Teil von Nordrhein-Westfalen im Kreis Höxter.

Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus einer Herkunft mit spf-System und nimmt am Westfalen-Pass einem Gesundheitszertifikatssystem teil. Der freistehende (r= 500 m) alte Gutshof umfasst ältere Schweineställe sowie einen 2010 neugebauten Stall. Insgesamt umfasst der Hof eine Gesamtkapazität von 840 Mastplätzen. Die Erstbelegung des neuen Stalles wurde in die Longitudinalstudie miteinbezogen.

Bestand 7:

Der Mastbestand 7 liegt im westlichen Teil von Nordrhein-Westfalen am Rande des Ruhrgebiets im Kreis Wesel. Der Landwirt bezieht die Mastläufer aus eigener Herkunft. Der Abferkelstall liegt auf dem ursprünglichen Hofgelände. Maststall, Wartestall, Deckzentrum und Ferkelaufzucht des geschlossenen Systems liegen zusammen auf einem anderen Areal. Die Gesamtkapazität umfasst 450 Mastplätze.

Bestand 8:

Der Mastbestand 8 liegt im mittleren-östlichen Nordrhein-Westfalen im Kreis Soest nahe der Stadt Werl. Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus einem Ferkelaufzuchtstall, der von drei verschiedenen Landwirten zeitgleich beliefert wird.

Eine Besonderheit stellt die Vormast der Läufer für vier Wochen in einem 20 bis 30 Jahre alten Stall mit Holzbalkendecke dar. Anschließend erfolgt die Umstallung der Tiere in den „eigentlichen“ Maststall. Während der gesamten Mastphase werden nur Einzeltierbehandlungen vorgenommen. Ein Medikamenteneinsatz, der die gesamte Tiergruppe umfasst, findet in der Regel nicht statt. Insgesamt umfasst die Hofanlage 1300 Schweinemastplätze. Des Weiteren wird auf dem Familienbetrieb eine Bullenmast betrieben.

3.3.3 Ostdeutschland Bestand 9:

Der Mastbestand 9 liegt im nördlichen Mecklenburg-Vorpommern im Landkreis Güstrow. Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus einer Herkunft. Die Gesamtkapazität liegt bei 4000 Mastplätzen. Neben den zwei Schweineställen, die 2007 und 2010 neugebaut wurden sind, umfasst die Hofanlage ebenso eine Biogasanlage, die in direkter Nachbarschaft zu den Schweineställen liegt, sowie zwei Hähnchenmastställe und zwei Putenmastställe.

Im Umkreis von 10 km befinden sich keine weiteren Stallanlagen, so dass man von einer Alleinlage sprechen kann.

Bestand 10:

Der Mastbestand 10 liegt im nördlichen Brandenburg im Kreis Ost-Prignitz-Ruppin.

Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus eigener Herkunft. Die Sauenanlage liegt jedoch an einem anderen Standort. Die Gesamtkapazität liegt bei 4300 Mastplätzen.

Der Hof liegt in Alleinlage von Feldern umringt. Im Umkreis von ca. 1 km gibt es eine Kläranlage.

Bestand 11:

Der Mastbestand 11 liegt im südlichen Mecklenburg-Vorpommern im Landkreis Müritz. Die Landwirtin bezieht ihre Mastläufer aus der eigenen Sauenanlage, die jedoch an einem anderen Standort 3 km entfernt gelegen ist. Die Gesamtkapazität liegt bei 1800 Mastplätzen. Im Umkreis von 1 km werden Rinder, Schweine und Pferde gehalten.

Bestand 12:

Der Mastbestand 12 liegt im nördlichen Brandenburg im Landkreis Prignitz. Der Landwirt bezieht seine Mastläufer aus eigener Herkunft. Es handelt sich um ein geschlossenes System, in dem Zuchteber und Jungsauen vermehrt und aufgezogen werden. Schweine, die für die Aufzucht nicht geeignet sind, werden in den hofeigenen Mastställen gemästet. Die Gesamtkapazität liegt bei 2500 Mastplätzen.

Auf dem Hofgelände wird ebenfalls eine Biogasanlage betrieben. Der Hof befindet sich in Ortsrandlage und ist von Wald umgeben.

3.4 Fragebogen

Es wurde ein umfangreicher Fragebogen (modifiziert nach Vonnahme 2005) erstellt, der alle wichtigen bestandspezifischen Charakteristika wie z.B. Stalleinrichtungen, Reinigung, Fütterung sowie die sich wiederholenden, routinemäßig durchgeführten Behandlungen wie z.B. Impfungen abfragt.

Ein Musterfragebogen ist im Anhang zu finden. Dieser wurde Projekt-übergreifend genutzt und enthält daher auch die Fragenoptionen für Zuchtbetriebe.

3.5 Untersuchungsschema – Longitudinalstudie

Das Untersuchungsschema der Longitudinalstudie ist zweistufig aufgebaut.

Innerhalb eines Mastdurchganges wurden zwölf Schweine an vier Beprobungsterminen (Tabelle 5) nasal beprobt. Dazu wurden in den ausgewählten Beständen bei der Anlieferung der Mastläufer eines neuen Mastdurchganges zwölf Läufer nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und mit fortlaufend nummerierten Ohrmarken (Primaflex Ohrmarken (Größe 0), 006-002, Caisley International GmbH, Bocholt) markiert. Im Anschluss daran wurden die Tiere jeweils mittels eines Nasentupfer (Transporttupfer in Amies Agar Gel, Nr. TS 0001 A, steril, Fa. Oxoid, Wesel) beprobt. Diese nasale Beprobung wurde nach zwei Wochen, nach sechs Wochen und am Ende der Mast wiederholt. Des Weiteren wurden ein Sockentupfer an allen vier Beprobungsterminen und eine Umgebungsstaubprobe vor der Einstallung im gereinigten und desinfizierten Stall und am Ende der Mast im belegten Stall entnommen und auf MRSA untersucht.

Gegen Ende des ersten beprobten Mastdurchganges wurde in Anlehnung an die Bestands- und Managementspezifika und der zuvor gewonnen Ergebnisse im ersten Mastdurchgang ein bestandsspezifischer Maßnahmenkatalog erarbeitet. Dieser für jeden Bestand individuelle Maßnahmenkatalog wurde mit den Landwirten und dem tierbetreuenden Personal besprochen und die tatsächliche Erfüllung der Maßnahmen soweit möglich kontrolliert. Es folgte die Untersuchung des zweiten Mastdurchganges nach gleichem Beprobungsprinzip (Tabelle 5).

Tabelle 5: Beprobungstermine innerhalb beider Mastdurchgänge

Nasentupfer Umgebungsstaub Sockentupfer

Bei der Einstallung X X X

Nach 2 Wochen X - X

Nach 6 Wochen X - X

Ende der Mast X X X

Erster Mastdurchgang Maßnahmen Zweiter Mastdurchgang

Abbildung 5: Untersuchungsmodell

3.6 Probenentnahme und Transport

Die Probenentnahme von Nasentupfer-, Staub- und Sockentupferproben und deren Verbleib bis zur Untersuchung im Labor sollen im Folgenden beschrieben werden.

3.6.1 Nasentupferprobe

Je nach Verhalten der zu beprobenden Schweine, sehr neugierig bis sehr ängstlich, war zunächst eine Fixation der Tiere notwendig. Diese erfolgte entweder durch Festhalten der Tiere oder durch Raumbegrenzung mittels eines bestandseigenen Treibbrettes. Bei sehr zutraulichen Tieren wurde keine Fixation angewandt.

Bei der Tupferprobenentnahme wurden Einmalhandschuhe (NOBA Verbandsmittel Danz GmbH & Co KG, Wetter) getragen. Die Beprobung der Schweine wurde mit trockenen Tupfern (Transporttupfer in Amies Agar Gel, Nr. TS 0001 A, steril, Oxoid, Wesel) durchgeführt. Dazu wurde der Tupfer ca. 2 cm tief in ein Nasenloch eingeführt und eine komplette Runde abgestrichen. Bei anderweitigem Kontakt des Tupfers zu z.B. Rüsselscheibe, Haut, Maul etc. wurde der Tupfer verworfen und eine neue Beprobung angeschlossen. Nach Entnahme eines Nasenabstriches wurde der Tupfer in das Transportmedium verbracht. Die Tupfer, die im Zuge der Longitudinalstudie entnommen wurden, wurden mit der jeweiligen Ohrmarkennummer des Tieres beschriftet.

Die nachfolgenden Abbildungen (Abbildung 6 und Abbildung 7) zeigen jeweils eine Nasentupferprobenentnahme ohne Fixation des Tieres.

Abbildung 6:

Nasentupferprobenentnahme ohne Fixation des Tieres

Abbildung 7:

Nasentupferprobenentnahme seitlich ohne Fixation des Tieres

3.6.2 Staubproben

Die Staubprobenentnahme erfolgte in Anlehnung an die Entscheidung der Europäischen Kommission 2008/55/EG. Bei der Entnahme wurden Einmalhandschuhe (NOBA Verbandsmittel Danz GmbH & Co KG, Wetter) getragen.

Es wurde auf einer Fläche von 500 cm² mit Hilfe eines autoklavierten Pinsels (GO/ON Lasurpinsel, 9682205, Handelsgesellschaft für Baustoffe GmbH & co. KG, Lohne) an fünf verschiedenen Lokalisationen im Stall Staub in ein steriles Kotröhrchen (Universalprobengefäß mit Löffel, PP 12ml,

braun, steril, Nr. 080026004, nerbe plus GmbH, Winsen-Luhe) gesammelt. Zudem wurde darauf geachtet, mindestens die Hälfte des Röhrchens mit Staub zu füllen.

Dabei galt es Staub aus der tiernahen Umgebung beispielsweise von den Buchtenwänden zu gewinnen. Wenn nicht genug Staub vorhanden war, welches vor allem vor der Einstallung der Tiere im gereinigten und desinfizierten Stall die Regel war, wurde auch Staub von Lüftungen, Leitungen und sonstigen Flächen gewonnen.

Bei diesen Ausnahmen konnte nicht immer die Anforderung an die zu sammelnde Staubmenge eingehalten werden.

3.6.3 Sockentupfer

Für die Sockentupferprobenentnahme wurden trockene Sockentupfer (PP - 16 - Schuhschutz, weiß, aus PP – Fließstoff, finnimport GmbH, Hamburg) benutzt, die zuvor im Labor einzeln in Plastiktüten verbracht und im Anschluss sterilisiert wurden. Während des gesamten Vorganges wurden Einmalhandschuhe (NOBA Verbandsmittel Danz GmbH & Co KG, Wetter) getragen. Die trockenen Sockentupfer wurden im Eingangsbereich des zu beprobenden Stallabteils über einen

zuvor angelegten Einwegstiefelüberzieher (PE Stiefelüberzug, HELE GmbH, Heilbronn) gezogen. So präpariert (Abbildung 9) wurde der gesamte Stallgang

Abbildung 8:

Staubproben-entnahme

Abbildung 9:

Sockentupferproben-entnahme

vollständig hin und zurück bis zum Ausgangspunkt abgeschritten. Am Endpunkt wurde der Sockentupfer über links ausgezogen und in einen Stomacherbeutel (Stomacher lab system, BA 6041/CLR closure bags, Seward Ltd., West Sussex) überführt. Dieser wurde mit dem Probenschlüssel (Bestandsnummer, Kürzel M für Mast, Beprobungsnummer und dem Kürzel ST für Sockentupfer) und dem Probenahmedatum beschriftet.

3.6.4 Transport

Die Aufbewahrung der Proben während des Transportes zum Labor erfolgte bei trockenen Proben wie Staubproben und Sockentupfer ungekühlt und bei feuchten Proben wie den Nasentupfern gekühlt. Die Aufbewahrungsdauer bis zur Untersuchung der Proben wurde wie folgt festgelegt:

• trockene Proben (Staub- und Sockentupferproben) maximal 10 Tage

• feuchte Proben (Nasentupferproben) maximal 72 Stunden bei +4°C

In Praxi wurde auch mit der Untersuchung der Staubproben innerhalb von 72 Stunden begonnen. Die Sockentupfer wurden ohne Verzug ungekühlt nach den Vorschriften für Gefahrgutversand UN 3373 zur Untersuchung zum Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt Ostwestfalen-Lippe – CVUA nach Detmold versendet.

3.7 Kultureller Nachweis

In Abstimmung mit dem Bundesinstitut für Risikobewertung in Berlin und präziser dem Nationalen Referenzlabor für Koagulase-positive Staphylokokken inklusive S.

aureus wurden die folgenden Nachweismethoden in Anlehnung an die EU-Grundlagenstudie (Entscheidung 2008/55/EG Anhang 1, Teil C Nr. 2.3) zur Untersuchung der Proben auf MRSA ausgewählt. Hierbei galt es ein Verfahren auszuwählen, dass die meist hochgradig vorhandene, vielfältige Keimflora in Staub und Nase berücksichtigt und gleichzeitig einen adäquaten Nachweis von MRSA ermöglicht. Dieses wurde mit einem selektiven Anreicherungsverfahren mit Anzucht, Isolierung und biochemischer Differenzierung von MRSA erzielt.

3.7.1 Selektives Anreicherungsverfahren

Das selektive Anreicherungsverfahren umfasst zwei Flüssiganreicherungskulturen und eine Nährbodenkultur.

Flüssiganreicherungskulturen:

• Müller-Hinton-Bouillon (Oxoid, Wesel) mit einer Kochsalzkonzentration von 6,5% NaCl (Merck, Darmstadt)

• Trypton-Soja-Bouillon (CASO-Bouillon, Merck, Darmstadt) mit Zusatz von 3,5 mg/l Cefoxitin (Sigma, Taufkirchen) und 75 mg/l Aztreonam (Sigma, Taufkirchen)

Nährbodenkultur:

• Selektivagarplatte mit Indikatorsystem, die CHROMagar^TM MRSA Fertigplatte (Mast Diagnostika, Reinfeld)

3.7.1.1 Voranreicherung

In der ersten Stufe des selektiven Anreicherungsverfahrens wurden die Proben in eine Müller-Hinton-Bouillon mit einer Kochsalzkonzentration von 6,5% NaCl verbracht und über 24 Stunden bei 37°C aerob inkubiert. Die jeweiligen Probengefäße wurden mit der entsprechenden Probennummer versehen.

Nasentupfer

Dazu wurden die Nasentupfer jeweils in ein Reagenzröhrchen mit 10 ml Müller-Hinton-Bouillon (+ 6,5% NaCl) überführt. Der Tupfergriff wurde über die Kante des Reagenzglases gebogen und abgetrennt. Anschließend wurde das Reagenzglas mit einer Verschlusskappe versehen (Abbildung 10)

Staubproben

Staubproben wurden zunächst mittels einer Pufferlösung aufbereitet. Hierzu wurden 0,1 g Staub abgewogen, in ein Röhrchen (Universalprobengefäß, nerbe plus GmbH,

Abbildung 10: Probenansatz Müller-Hinton-Bouillon

Winsen-Luhe) mit 10 ml PBS-TWEEN 20® (eigene Herstellung, siehe Anhang) überführt. Das geschlossene Röhrchen wurde nun 30 Minuten bei Zimmertemperatur auf den Rollenmischer gelegt und anschließend 4 Minuten kräftig vorgetextet (Vortexter, VWR International, Darmstadt). Von einer so präparierten Probe wurde nun 1 ml in ein Reagenzglas mit 9 ml Müller-Hinton-Bouillon (+ 6,5% NaCl) mit einer Einkanalpipette (Eppendorf Research variabel, Hamburg) pipettiert. Das Reagenzglas wurde daraufhin mit einer Verschlusskappe verschlossen. Das Pipettieren erfolgte unter einer Lamina Flow Werkbank.

Sockentupfer

Die Untersuchung der Sockentupfer auf MRSA erfolgte im CVUA Detmold.

Für den ersten Schritt der Anreicherung der Sockentupferprobe wurden 25 ml Müller-Hinton-Bouillon (+ 6,5% NaCl) in den Stomacherbeutel, in dem sich der Sockentupfer seit Entnahme befand, gegossen und im Anschluss bei hoher Geschwindigkeit für zwei Minuten gestomachert.

3.7.1.2 Selektivanreicherung

In der zweiten Stufe des selektiven Anreicherungsverfahrens wird „ein Teil“ der Voranreicherung in eine Trypton-Soja-Bouillon, die mit 75mg/l Aztreonam und 3,5mg/l Cefoxitin supplementiert wurde, überführt und daraufhin 17 Stunden bei 37°C aerob inkubiert (Abbildung 11).

Staub- und Nasentupferproben

Von der Voranreicherung der Staub- und Nasentupferproben wurden je 1 ml des Probenansatzes zu 9 ml Trypton-Soja-Bouillon (+ Aztreonam, Cefoxitin) pipettiert.

Sockentupfer

Von der Voranreicherung der Sockentupfer wurden 2,5 ml des Probenansatzes zu 22,5 ml Trypton-Soja-Bouillon (+Aztreonam, Cefoxitin) pipettiert.

Abbildung 11: Probenansatz Trypton-Soja-Bouillon

Abbildung 12:

Malvenfarbene MRSA Kolonien auf

Selektivchromagar

3.7.1.3 Selektivagar

In der dritten Stufe des selektiven Anreicherungsverfahrens wurde jeweils eine Öse der Selektivanreicherung auf einem Selektivnährboden, einer CHROMagar^TM MRSA Fertigplatte (Mast Diagnostika, Reinfeld), im Drei-Ösen-Ausstrich ausgestrichen. Dies erfolgte bei Staub-, Nasen- und Sockentupferprobe gleichermaßen.

Die Inkubation erfolgte unter aeroben Bedingungen für 24 Stunden bei 37 °C.

3.7.2 Anzucht und Isolierung

Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurde der Selektivchromagar abgelesen. MRSA-verdächtige Kolonien zeigen sich, wie in der nachfolgenden Abbildung 12 zu sehen, als malvenfarbene Kolonien.

Es wurden fünf MRSA-verdächtige, malvenfarbene Kolonien pro Selektivchromagar ausgewählt und jeweils auf einer Blutagarplatte (Heipha, Eppelheim) im Drei-Ösen-Ausstrich isoliert. Die Inkubation der Blutagarplatte erfolgte aerob im Brutschrank für 24 Stunden bei 37 °C.

Die Kulturmorphologie von S. aureus auf Blutagar ist durch weiß-gelbe, mittelgroße, feuchte Kolonien (Abbildung 13) mit einer Hämolyse, die in unterschiedlicher Intensivität auftreten kann, gekennzeichnet. Wurden bei der Auswertung einer

Die Kulturmorphologie von S. aureus auf Blutagar ist durch weiß-gelbe, mittelgroße, feuchte Kolonien (Abbildung 13) mit einer Hämolyse, die in unterschiedlicher Intensivität auftreten kann, gekennzeichnet. Wurden bei der Auswertung einer

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