Die Probenentnahme von Nasentupfer-, Staub- und Sockentupferproben und deren Verbleib bis zur Untersuchung im Labor sollen im Folgenden beschrieben werden.
3.6.1 Nasentupferprobe
Je nach Verhalten der zu beprobenden Schweine, sehr neugierig bis sehr ängstlich, war zunächst eine Fixation der Tiere notwendig. Diese erfolgte entweder durch Festhalten der Tiere oder durch Raumbegrenzung mittels eines bestandseigenen Treibbrettes. Bei sehr zutraulichen Tieren wurde keine Fixation angewandt.
Bei der Tupferprobenentnahme wurden Einmalhandschuhe (NOBA Verbandsmittel Danz GmbH & Co KG, Wetter) getragen. Die Beprobung der Schweine wurde mit trockenen Tupfern (Transporttupfer in Amies Agar Gel, Nr. TS 0001 A, steril, Oxoid, Wesel) durchgeführt. Dazu wurde der Tupfer ca. 2 cm tief in ein Nasenloch eingeführt und eine komplette Runde abgestrichen. Bei anderweitigem Kontakt des Tupfers zu z.B. Rüsselscheibe, Haut, Maul etc. wurde der Tupfer verworfen und eine neue Beprobung angeschlossen. Nach Entnahme eines Nasenabstriches wurde der Tupfer in das Transportmedium verbracht. Die Tupfer, die im Zuge der Longitudinalstudie entnommen wurden, wurden mit der jeweiligen Ohrmarkennummer des Tieres beschriftet.
Die nachfolgenden Abbildungen (Abbildung 6 und Abbildung 7) zeigen jeweils eine Nasentupferprobenentnahme ohne Fixation des Tieres.
Abbildung 6:
Nasentupferprobenentnahme ohne Fixation des Tieres
Abbildung 7:
Nasentupferprobenentnahme seitlich ohne Fixation des Tieres
3.6.2 Staubproben
Die Staubprobenentnahme erfolgte in Anlehnung an die Entscheidung der Europäischen Kommission 2008/55/EG. Bei der Entnahme wurden Einmalhandschuhe (NOBA Verbandsmittel Danz GmbH & Co KG, Wetter) getragen.
Es wurde auf einer Fläche von 500 cm² mit Hilfe eines autoklavierten Pinsels (GO/ON Lasurpinsel, 9682205, Handelsgesellschaft für Baustoffe GmbH & co. KG, Lohne) an fünf verschiedenen Lokalisationen im Stall Staub in ein steriles Kotröhrchen (Universalprobengefäß mit Löffel, PP 12ml,
braun, steril, Nr. 080026004, nerbe plus GmbH, Winsen-Luhe) gesammelt. Zudem wurde darauf geachtet, mindestens die Hälfte des Röhrchens mit Staub zu füllen.
Dabei galt es Staub aus der tiernahen Umgebung beispielsweise von den Buchtenwänden zu gewinnen. Wenn nicht genug Staub vorhanden war, welches vor allem vor der Einstallung der Tiere im gereinigten und desinfizierten Stall die Regel war, wurde auch Staub von Lüftungen, Leitungen und sonstigen Flächen gewonnen.
Bei diesen Ausnahmen konnte nicht immer die Anforderung an die zu sammelnde Staubmenge eingehalten werden.
3.6.3 Sockentupfer
Für die Sockentupferprobenentnahme wurden trockene Sockentupfer (PP - 16 - Schuhschutz, weiß, aus PP – Fließstoff, finnimport GmbH, Hamburg) benutzt, die zuvor im Labor einzeln in Plastiktüten verbracht und im Anschluss sterilisiert wurden. Während des gesamten Vorganges wurden Einmalhandschuhe (NOBA Verbandsmittel Danz GmbH & Co KG, Wetter) getragen. Die trockenen Sockentupfer wurden im Eingangsbereich des zu beprobenden Stallabteils über einen
zuvor angelegten Einwegstiefelüberzieher (PE Stiefelüberzug, HELE GmbH, Heilbronn) gezogen. So präpariert (Abbildung 9) wurde der gesamte Stallgang
Abbildung 8:
Staubproben-entnahme
Abbildung 9:
Sockentupferproben-entnahme
vollständig hin und zurück bis zum Ausgangspunkt abgeschritten. Am Endpunkt wurde der Sockentupfer über links ausgezogen und in einen Stomacherbeutel (Stomacher lab system, BA 6041/CLR closure bags, Seward Ltd., West Sussex) überführt. Dieser wurde mit dem Probenschlüssel (Bestandsnummer, Kürzel M für Mast, Beprobungsnummer und dem Kürzel ST für Sockentupfer) und dem Probenahmedatum beschriftet.
3.6.4 Transport
Die Aufbewahrung der Proben während des Transportes zum Labor erfolgte bei trockenen Proben wie Staubproben und Sockentupfer ungekühlt und bei feuchten Proben wie den Nasentupfern gekühlt. Die Aufbewahrungsdauer bis zur Untersuchung der Proben wurde wie folgt festgelegt:
• trockene Proben (Staub- und Sockentupferproben) maximal 10 Tage
• feuchte Proben (Nasentupferproben) maximal 72 Stunden bei +4°C
In Praxi wurde auch mit der Untersuchung der Staubproben innerhalb von 72 Stunden begonnen. Die Sockentupfer wurden ohne Verzug ungekühlt nach den Vorschriften für Gefahrgutversand UN 3373 zur Untersuchung zum Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt Ostwestfalen-Lippe – CVUA nach Detmold versendet.
3.7 Kultureller Nachweis
In Abstimmung mit dem Bundesinstitut für Risikobewertung in Berlin und präziser dem Nationalen Referenzlabor für Koagulase-positive Staphylokokken inklusive S.
aureus wurden die folgenden Nachweismethoden in Anlehnung an die EU-Grundlagenstudie (Entscheidung 2008/55/EG Anhang 1, Teil C Nr. 2.3) zur Untersuchung der Proben auf MRSA ausgewählt. Hierbei galt es ein Verfahren auszuwählen, dass die meist hochgradig vorhandene, vielfältige Keimflora in Staub und Nase berücksichtigt und gleichzeitig einen adäquaten Nachweis von MRSA ermöglicht. Dieses wurde mit einem selektiven Anreicherungsverfahren mit Anzucht, Isolierung und biochemischer Differenzierung von MRSA erzielt.
3.7.1 Selektives Anreicherungsverfahren
Das selektive Anreicherungsverfahren umfasst zwei Flüssiganreicherungskulturen und eine Nährbodenkultur.
Flüssiganreicherungskulturen:
• Müller-Hinton-Bouillon (Oxoid, Wesel) mit einer Kochsalzkonzentration von 6,5% NaCl (Merck, Darmstadt)
• Trypton-Soja-Bouillon (CASO-Bouillon, Merck, Darmstadt) mit Zusatz von 3,5 mg/l Cefoxitin (Sigma, Taufkirchen) und 75 mg/l Aztreonam (Sigma, Taufkirchen)
Nährbodenkultur:
• Selektivagarplatte mit Indikatorsystem, die CHROMagarTM MRSA Fertigplatte (Mast Diagnostika, Reinfeld)
3.7.1.1 Voranreicherung
In der ersten Stufe des selektiven Anreicherungsverfahrens wurden die Proben in eine Müller-Hinton-Bouillon mit einer Kochsalzkonzentration von 6,5% NaCl verbracht und über 24 Stunden bei 37°C aerob inkubiert. Die jeweiligen Probengefäße wurden mit der entsprechenden Probennummer versehen.
Nasentupfer
Dazu wurden die Nasentupfer jeweils in ein Reagenzröhrchen mit 10 ml Müller-Hinton-Bouillon (+ 6,5% NaCl) überführt. Der Tupfergriff wurde über die Kante des Reagenzglases gebogen und abgetrennt. Anschließend wurde das Reagenzglas mit einer Verschlusskappe versehen (Abbildung 10)
Staubproben
Staubproben wurden zunächst mittels einer Pufferlösung aufbereitet. Hierzu wurden 0,1 g Staub abgewogen, in ein Röhrchen (Universalprobengefäß, nerbe plus GmbH,
Abbildung 10: Probenansatz Müller-Hinton-Bouillon
Winsen-Luhe) mit 10 ml PBS-TWEEN 20® (eigene Herstellung, siehe Anhang) überführt. Das geschlossene Röhrchen wurde nun 30 Minuten bei Zimmertemperatur auf den Rollenmischer gelegt und anschließend 4 Minuten kräftig vorgetextet (Vortexter, VWR International, Darmstadt). Von einer so präparierten Probe wurde nun 1 ml in ein Reagenzglas mit 9 ml Müller-Hinton-Bouillon (+ 6,5% NaCl) mit einer Einkanalpipette (Eppendorf Research variabel, Hamburg) pipettiert. Das Reagenzglas wurde daraufhin mit einer Verschlusskappe verschlossen. Das Pipettieren erfolgte unter einer Lamina Flow Werkbank.
Sockentupfer
Die Untersuchung der Sockentupfer auf MRSA erfolgte im CVUA Detmold.
Für den ersten Schritt der Anreicherung der Sockentupferprobe wurden 25 ml Müller-Hinton-Bouillon (+ 6,5% NaCl) in den Stomacherbeutel, in dem sich der Sockentupfer seit Entnahme befand, gegossen und im Anschluss bei hoher Geschwindigkeit für zwei Minuten gestomachert.
3.7.1.2 Selektivanreicherung
In der zweiten Stufe des selektiven Anreicherungsverfahrens wird „ein Teil“ der Voranreicherung in eine Trypton-Soja-Bouillon, die mit 75mg/l Aztreonam und 3,5mg/l Cefoxitin supplementiert wurde, überführt und daraufhin 17 Stunden bei 37°C aerob inkubiert (Abbildung 11).
Staub- und Nasentupferproben
Von der Voranreicherung der Staub- und Nasentupferproben wurden je 1 ml des Probenansatzes zu 9 ml Trypton-Soja-Bouillon (+ Aztreonam, Cefoxitin) pipettiert.
Sockentupfer
Von der Voranreicherung der Sockentupfer wurden 2,5 ml des Probenansatzes zu 22,5 ml Trypton-Soja-Bouillon (+Aztreonam, Cefoxitin) pipettiert.
Abbildung 11: Probenansatz Trypton-Soja-Bouillon
Abbildung 12:
Malvenfarbene MRSA Kolonien auf
Selektivchromagar
3.7.1.3 Selektivagar
In der dritten Stufe des selektiven Anreicherungsverfahrens wurde jeweils eine Öse der Selektivanreicherung auf einem Selektivnährboden, einer CHROMagarTM MRSA Fertigplatte (Mast Diagnostika, Reinfeld), im Drei-Ösen-Ausstrich ausgestrichen. Dies erfolgte bei Staub-, Nasen- und Sockentupferprobe gleichermaßen.
Die Inkubation erfolgte unter aeroben Bedingungen für 24 Stunden bei 37 °C.
3.7.2 Anzucht und Isolierung
Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurde der Selektivchromagar abgelesen. MRSA-verdächtige Kolonien zeigen sich, wie in der nachfolgenden Abbildung 12 zu sehen, als malvenfarbene Kolonien.
Es wurden fünf MRSA-verdächtige, malvenfarbene Kolonien pro Selektivchromagar ausgewählt und jeweils auf einer Blutagarplatte (Heipha, Eppelheim) im Drei-Ösen-Ausstrich isoliert. Die Inkubation der Blutagarplatte erfolgte aerob im Brutschrank für 24 Stunden bei 37 °C.
Die Kulturmorphologie von S. aureus auf Blutagar ist durch weiß-gelbe, mittelgroße, feuchte Kolonien (Abbildung 13) mit einer Hämolyse, die in unterschiedlicher Intensivität auftreten kann, gekennzeichnet. Wurden bei der Auswertung einer Blutagarplatte dementsprechende verdächtige Kolonien identifiziert, so schloss sich eine weitere biochemische Differenzierung an.
Abbildung 13:
Weiß-gelbe MRSA Kolonien auf Blutagar
3.7.3 Biochemische Differenzierung
Zur weiteren Bestätigung der verdächtigen Kolonien wurde jedes Isolat mittels Katalase-, Oxidase- und Koagulase-Test biochemisch differenziert.
3.7.3.1 Katalase-Test
Der Katalase-Test ermöglicht eine Differenzierung zwischen Katalase-positiven Staphylokokken und Katalase-negativen Streptokokken.
Eine MRSA-verdächtige Kolonie wurde hierzu mittels einer Öse in einen Tropfen 3%iger Wasserstoffperoxidlösung (Merck, Darmstadt), der zuvor auf einen Objektträger gegeben wurde, kurz eingetaucht. Bei positiver Reaktion waren direktes Sprudeln und Blasenbildung zu beobachten. Setzte kein Sprudeln ein, war die Reaktion als negativ zu bewerten.
3.7.3.2 Oxidase-Test
Der Oxidase-Test ist ein schnelles biochemisches Verfahren zum Nachweis des Enzyms Cytochrom C Oxidase. S. aureus sind Oxidase-negativ.
Eine MRSA-verdächtige Kolonie wurde mittels Öse auf ein Oxidase-Reagenz (eigene Herstellung, siehe Anhang) getränktes Filterpapier, welches zuvor auf einen Objektträger gelegt wurde, gerieben. Bei positiver Reaktion färbte sich das zuvor farblose Reagenz im Filterpapier intensiv blau. Als negativ wurde die Reaktion angesehen, wenn kein Farbumschlag zu beobachten war.
3.7.3.3 Koagulase-Test
Die Reaktion erlaubt eine Differenzierung zwischen den Koagulase-positiven S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken wie beispielsweise Staphylococcus epidermidis.
Zwei bis drei MRSA-verdächtige Kolonien wurden in ein mit 300 µl Kaninchenplasma (BBL Coagulase Plasma, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) gefülltes Reaktionsgefäß (1,5 ml Eppendorf, Hamburg) mittels einer Öse überführt und vermischt. Anschließend folgte eine Inkubation im Brutschrank bei 37°C für vier Stunden. Bei positiver Reaktion koagulierte das Kaninchenplasma. Konnte nach
einer weiteren Inkubation von vier Stunden bei 37°C keine Koagulierung des Kaninchenplasmas festgestellt werden, galt die Probe als Koagulase-negativ zu bewerten. Bei zweifelhaften Fällen wurde der Test wiederholt.