Alle ermittelten MRSA-Stämme wurden kryokonserviert. Hierzu wurden die Reinkulturen mittels Öse in die Cryobank-Röhrchen (Mast Diagnostika, Reinfeld) überführt und bei -70°C aufbewahrt.
3.9 Molekularbiologischer Nachweis
Der genotypische Nachweis von Stämmen bietet nicht nur eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung und Bestätigung von Bakterienspezies, sondern fungiert speziell auch im Falle von MRSA als ein weiteres Werkzeug der epidemiologischen Forschung.
3.9.1 Bestätigung mittels PCR
Die molekularbiologische Bestätigung der isolierten MRSA-Stämme erfolgte in der Außenstelle für Epidemiologie Bakum der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mittels Multiplex-PCR.
Die Methode nach POULSEN et al. (2003) diente als Grundlage der MRSA-Bestätigungs-PCR. Zielgene sind das nuc Gen (spezifisch für S. aureus) sowie das mecA Gen (spezifisch für Methicillin-Resistenz).
3.9.1.1 Manuelle Extraktion genomischer DNA aus Bakterienkultur Drei Kolonien eines zu bestätigenden MRSA-Isolates wurden zunächst in ein Reaktionsgefäß (1,5 ml; Eppendorf, Hamburg) mit 1 ml Tris-EDTA-Puffer (eigene Herstellung, siehe Anhang) überführt, kurz gevortext und für 10 Minuten bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Resuspendierung des Pellets erfolgte durch Zugabe von 500 µl Lysispuffer Tris-HCL pH 8,5 (eigene Herstellung,
Pipettierschema der Lösungsmengen pro Probe 12,50 µl Ready MixTMTaq PCR (Sigma,Taufkirchen) 7,50 µl Primer-Mix
2,50 µl H2O 22,50 µl Master-Mix 2,50 µl Template DNA 25,00 µl Reaktionsvolumen
siehe Anhang). Die jeweils so vorbereiteten Proben wurden mit dem Vortexter (VWR International, Darmstadt) geschüttelt und anschließend auf dem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) eine Stunde bei 60°C und 15 min bei 95°C inkubiert.
Der auf diese Weise gewonnene DNA-Extrakt (Template-DNA) wurde sofort weiterverarbeitet.
Eine Positiv- und eine Negativkontrolle wurden ebenfalls mitgeführt
3.9.1.2 Herstellung des Master-Mixes
Zur Amplifikation der spezifischen DNA Teilstücke wurden folgende Primer (metabion International AG, Planneg-Martinsried) ausgewählt:
Primer mecA Zielgen (Amplikongröße 527 bp)
mec up1 5`-GGG ATC ATA GCG TCA TTA TTC-3`
mec up2 5`-AAC GAT TGT GAC ACG ATA GCC-3`
Primer nuc Zielgen (Amplikongröße 255 bp)
nuc PCR1 5`-TCA GCA AAT GCA TCA CAA ACA G-3`
nuc PCR2 5`-CGT AAA TGC ACT TGC TTC AGG-3`
Die Primer wurden laut Synthesereport auf je 100 pmol/µl Stammlösung gelöst und auf folgende Arbeitslösungskonzentrationen verdünnt:
mec up 1 und mec up 2 je 25 pmol/µl nuc PCR 1 und nuc PCR 2 je 20 pmol/µl.
Der Primer-Mix wurde zu gleichen Teilen der Arbeitslösungen eines jeden Primers und zwei Teilen LiChrosolv-Wasser (Merck, Darmstadt) hergestellt.
Nach folgendem Pipettierschema (Abbildung 14) wurde der Mastermix errechnet und zusammenpipettiert:
Abbildung 14: Pipettierschema des Reaktionsvolumens
Dabei wurde die Anzahl der zu untersuchenden Proben (inklusive der Positiv- und Negativkontrolle) n + 1 als Grundlage zur Berechnung gewählt. Der Mastermix wurde jeweils mit einer Menge von 22,5 µl in Eppendorf Cups, Safelock 0,2 ml pipettiert. Im nächsten Schritt wurden 2,5 µl Template-DNA in die entsprechend beschrifteten Cups mit Master-Mix hinzupipettiert und der somit fertiggestellte Reaktionsansatz für 15 Sekunden bei 5000 g zentrifugiert.
3.9.1.3 PCR
Die Proben wurden nun in den Thermocycler (Mastercycler ep Gradient S, Eppendorf AG, Hamburg) eingesetzt und die PCR wurde unter folgendem Amplifikationsprotokoll (Tabelle 6) gestartet.
Tabelle 6: Amplifikationsprotokoll
Temperatur (°C) Zeit (Minuten)
First denaturation 94 05:00
denaturation 94 00:30
30 Zyklen
annealing 55 00:30
extension 72 00:45
Final extension 72 05:00
3.9.1.4 Gelelektrophorese
Nach Ablauf der Amplifikation erfolgte die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte.
Eine Elektrophoresekammer (Sub Cell Modell 96, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) wurde mit 500 ml Laufpuffer befüllt und mit einem vorbereiteten 1,5%
Agarosegel (eigene Herstellung, siehe Anhang) bestückt. Als Laufpuffer wurde 1:10 verdünnter TAE-Puffer (Merck, Darmstadt) benutzt.
In einer Mikrotiterplatte (Immulon 1b; VWR International, Darmstadt) wurden nun die Amplifikate und der DNA-Ladder vorbereitet. Pro Probe wurden 10 µl Amplifikat und 4 µl Gel loading Puffer (eigene Herstellung) in ein well pipettiert und durch mehrmaliges vorsichtiges Aufziehen in die Pipettenspitze vermischt. Als DNA-Marker wurde ein 100-bp DNA-Ladder (Roche Diagnostika, Mannheim) verwandt. Die
Menge von 1,5 µl des DNA-Ladder und 8,5 µl LiChrosolv (Merck, Darmstadt) wurden in ein well pipettiert und ebenso vermischt.
Anschließend wurden aus jedem well 10 µl nach Schema (Abbildung 15) in eine Geltasche pipettiert.
Proben 1-20
NC2 PC2 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 M2 NC1 PC1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M1
links rechts
M1 und M2 = DNA-Ladder PC1 und PC2 = Positivkontrollen NC1 und NC2 = Negativkontrollen Abbildung 15: Pipettierschema des Agarose-Gel
An die Elektrophoresekammer wurde für eine Stunde eine Spannung von 170 V gelegt. Nach Ablauf der Elektrophorese wurde das Gel zur Färbung der DNA in eine Aluminiumschale mit einer Lösung aus 50 ml TAE-Puffer, 450 ml destilliertem Wasser und 100 µl Ethidiumbromid 1%ige Lösung in Wasser (Merck, Darmstadt) überführt. Zum Schutz vor UV-Strahlen wurde die Aluminiumschale mit einem Aluminiumdeckel abgedeckt. Nach einer Färbezeit von 30 Minuten schloss sich ein fünfminütiges Bad des Gels in destilliertem Wasser in einer weiteren Schale an.
Das gewaschene Gel wurde auf einer Kunststofffolie liegend in der Mitte der Fotokammer (Biotec-Fischer GmbH, Reiskirchen) platziert und nach Verschluss der Kammer mit UV-Licht bestrahlt und digital fotografiert (Software: Alpha-Imager, Biotec-Fischer GmbH, Reiskirchen) (Abbildung 16).
DNA-Ladder
Positivkontrolle Negativkontrolle Proben
mec-A nuc
Geltaschen
Abbildung 16: Digitale Darstellung des Agarose-Gels
3.9.1.5 Beurteilung
Eine Beurteilung der Proben war nur zulässig, wenn die Positivkontrolle zwei spezifische Banden, die für das mec A gen spezifische Bande im Bereich von 527 bp und die für das nuc gen spezifische Bande im Bereich von 255 bp, aufwies und die Negativkontrolle keine Banden besaß.
Eine Probe wurde als MRSA-positiv bewertet, wenn beide spezifischen Banden im Vergleich zur Positivkontrolle präsent waren.
3.9.2 Typisierung
Die molekularbiologische Typisierung von MRSA ermöglicht Untersuchungen zu epidemiologischen Zusammenhängen. Aus diesem Grunde wurde eine Auswahl von MRSA-Isolaten pro Bestand zur Typisierung an das BfR nach Berlin versendet.
Es wurde eine spa-Typisierung und eine SCCmec-Typisierung durchgeführt. Die spa-Typisierung erfolgte anhand einer Single PCR nach SHOPSIN et al. (1999) und die SCCmec-Typisierung erfolgte mittels Multiplex PCR nach ZHANG et al. (2005).
Die Zuordnung zu den unterschiedlichen MLST-Typen erfolgte anhand der mit ihnen assoziierten spa-Typen. Eine MLST-Typisierung wurde nur durchgeführt, wenn seitens des zuvor ermittelten spa-Typen keine Assoziation zu einem MLST-Typ möglich war. Die MLST-Typisierung erfolgte dann nach der Methode von ENRIGHT et al. (2000).
3.10 Statistische Auswertung und Formeln