Spin-Lock (SL)
2.4 Homonukleare Entkopplung - Pure Shift NMR Spektroskopie
2.4.3 Refokussierung der skalaren Kopplung
1H
Gz
90° 180°
δ2
t1
2+δ1 t1
2+δ3
G1 G1 G2 G2 Spin Selektive Inversion (SSI)
A
1H
180°sel 1H
90° 180°
τ
X
180°
90°
τ
1H180°sel
Gz
1H
PSYCHE Element
Gz
B C D E
Abbildung 2.4.3: Schematische Darstellung der Refokussierung der skalarenJ−Kopplung durch Kom-bination eines 180◦-Pulses mit einem Spin-selektiven Inversionselements zur spin-subset-Selektion mittig platziert in einer Evolutionszeit t1 (A). (B) - (E) Darstellung der heute verwendeten Spin-selektiven Inversionselemente BIRD[175], BASH[176,208], Zangger-Sterk[177]und PSYCHE[45].
Um homonuklear entkoppelte1H-Spektren zu erhalten, hat sich die Methode, die skalareJ−Kopplung zu refokussieren, weitestgehend durchgesetzt. Konzeptionell verwandt ist diese Technik mit der heteronuklea-ren Entkopplung, welche standardmäßig in eindimensionalen X-Kern-Experimenten (X =13C,19F,31P, ...) sowie mehrdimensionalen1H,X-Korrelations-Experimenten zur Entferung derJH,X-Kopplungsaufspaltung zum Einsatz kommt. Hierbei wird auf einen der beiden Kern eingestrahlt, während der andere gemessen wird. Die Übertragung auf den homonuklearen Fall ist jedoch nicht direkt möglich, da die gleichzeitige breitbandige Anregung und Detektion desselben Kernes technisch nicht möglich ist. Unter Ausnutzung eines sogenannten “Verdünnungseffektes“ kann die Konzeptübertragung erreicht werden, wobei das gesamte Spin-Ensemble in zwei Subsysteme geteilt wird (spin-subset-Selektion). Die erste Gruppe sind die aktiven Spins, die detektiert werden sollen, und sich dafür verdünnt in einer Umgebung von passiven Spins befinden. Diese Mehrheit der passiven Spins wird entsprechend manipuliert, beispielsweise durch Inversion ihres Spin-Zustandes, um die Kopplungsaufspaltung bei den aktiven Spins zu entfernen. Gleich-zeitig wird das Signal der passiven Spins durch einen geeigneten Phasenzyklus oder Gradientenfilterung unterdrückt. Die Zerlegung des Spin-Ensembles in aktive und passive Spins erfolgt mit Hilfe von sogenann-ten Spin-selektiven Inversionselemensogenann-ten. Diese werden in modernenPure ShiftExperimenten mit einem breitbandigen 180◦-Puls kombiniert. Dadurch wird der Spinzustand aller Kopplungspartner (passive Spins) invertiert, wohingegen der Zustand der aktiven Spins durch zweifache Inversion unbeeinflusst
bleibt. Wird diese Kombination mittig in einer Entwicklungszeit platziert (Abbildung 2.4.3A), kann die Entwicklung der skalarenJ−Kopplung refokussiert werden, wohingegen die chemische Verschiebung der aktiven Spins sich mit dieser Zeit entwickelt.
Zunächst werden die inPure ShiftExperimenten verwendeten Spin-selektiven Inversionselemente vorge-stellt, sowie deren Arbeitsprinzip zurspin-subset-Selektion, deren Eigenschaften und eventuelle Weiterent-wicklungen diskutiert. Die vier bekanntesten Spin-selektiven Inversionselemente BIRD[175], BASH[176,208], Zangger-Sterk[177]und PSYCHE[45]sind in Abbildung 2.4.3B bis E als Bauelemente in NMR-Pulssequenzen gezeigt. Die Techniken BASH, Zangger-Sterk und PSYCHE sind zentraler Bestandteil der Projekte A und B in den Kapiteln 4 und 5, weshalb diese hier ausführlicher diskutiert werden. Die Diskussion der Elemente erfolgt in der zeitlichen Reihenfolge ihrer Vorstellung in der Literatur. Anschließend wird gezeigt, wie die Refokussierung der skalaren Kopplung zur Erzeugung von ein- und mehrdimensionalenPure Shift
1H-Spektren verwendet wird.
Selektive Spin Inversion BIRD
Das BIRD-Element, auch BIRD-Filter genannt, eingeführt durch Garbowet al.[175], nutzt zur Subsystem-Selektion die geringe natürliche Häufigkeit eines an Protonen direkt gebundenen NMR-aktiven He-terokerns (13C, 15N) aus. Bei natürlichen Häufigkeiten von 1,1 % für 13C und 0,3 % für 15N ist die Wahrscheinlichkeit äußerst gering, dass zwei solche Kerne sich in direkter Nachbarschaft befinden. Die in Abbildung 2.4.3B gezeigte Pulsfolge, wobeiτ = 21J1HX sein muss, invertiert nur diejenigen Protonen, die direkt an 13C (15N) gebunden sind, während die12C- (14N-)gebundenen Protonen unbeinflusst bleiben (BIRDd). Abhängig von den Phasen der Pulse des BIRD-Elements kann auch der umgekehrte Fall realisiert werden und die12C-gebundenen (passiven) Protonen werden durch das BIRD-Element (BIRDr) invertiert. Die homonukleare Entkopplung mit BIRD ist tolerant gegenüber stark gekoppelten Protonen[178]. Die Entwicklungszeitτ im BIRD-Element wird üblicherweise auf einen Mittelwert von
1JHX optimiert, dennoch können stark variierende Werte der1JHX-Kopplungskonstanten zu Artefakten im Spektrum führen.
Sind zwei chemisch inäquivalente Protonen an einen 13C-Kern gebunden (diastereotope Protonen), werden beide Protonen durch das BIRD-Element invertiert. Die homonukleareJ−Kopplung zwischen den beiden Protonen wird nicht refokussiert. Folglich können diese beiden Protonen nicht entkoppelt werden.
Weiterentwicklungen von BIRD zu dem Constant-Time-BIRD[209] oder perfectBIRD[210] ermöglichen auch die Entkopplung von diastereotopen Protonen. In vollständig13C-markierten Substanzen ist BIRD nicht breitbandig anwendbar. Die Einführung von selektiven Inversionspulsen auf13C im BIRD-Element bei ausreichend separierten13C-Linien ermöglich allerdings eine Entkopplung[211]. Die Sensitivität des Experiments mit BIRD-Entkopplung wird insgesamt auf die natürliche Häufigkeit von13C beziehungsweise
15N reduziert. Die BIRD-Methode findet daher insbesondere Anwendung in Experimenten mit Detektion von13C (15N)[209,210,212–221]
, wodurch kein weiterer Sensitivitätsverlust in Kauf genommen werden muss.
Band-selektive homonukleare Entkopplung (BASH)
Die band-selektive homonukleare Entkopplung (BASH) nutzt Frequenzunterschiede durch unterschiedli-che unterschiedli-chemisunterschiedli-che Verschiebungen zwisunterschiedli-chen gekoppelten Protonen aus. Dabei kommen selektive Refokussie-rungspulse (soft pulses) mit definierter Bandbreite zum Einsatz (Abbildung 2.4.3C). Hier kann zwischen der selektiven Refokussierung von nur einem Proton, der Selektion mehrerer Protonen mit einem phasen-modulierten Puls mit mehreren Offsetfrequenzen oder der Selektion einer gesamten spektralen Region unterschieden werden. Bedingung für die homonukleare Entkopplung in allen drei Möglichkeiten ist, dass jeweils nur ein Proton aus einem kompletten Kopplungsnetzwerk von dem selektiven Refokussierungspuls erfasst wird. Streng genommen handelt es sich bei der BASH-Entkopplung daher nicht um einePure ShiftMethode, da eine homonukleare Breitbandentkopplung über den gesamten Bereich der chemischen Verschiebungen eines Analyten nicht möglich ist. Vorteilhaft an dieser Technik ist dennoch, dass durch die homonukleare Entkopplung theoretisch kein zusätzlicher Sensitivitätsverlust auftritt.
Breite Anwendung findet die BASH-Entkopplung in Systemen, die definierte spektrale Bereiche für Protonen charakteristischer Strukturelemente weitestgehend isoliert von den übrigen Protonensignalen aufweisen. Das ist beispielsweise für α−Peptide und Proteine der Fall, in denen sich die Amid- und α−Protonen jeweils in einem definierten spektralen Bereich isoliert vom Bereich der Seitenkettenprotonen befinden. Ausnahmen bilden hier Peptide mit Serinen und mit Aminosäurebausteinen mit aromatischen Seitengruppen. Deren Protonen in den Seitengruppen können in denα−beziehungsweise Amid-Protonen-Bereich fallen. Im Fall von Glycinen können sich beideα−Protonen im selektierten spektralen Bereich befinden.
Da dieα−und Amid-Protonen (backbone-Protonen) wertvoll für die dreidimensionale Strukturaufklärung von Peptiden und kleinen Proteinen sind, ist hier die BASH-Entkopplung sowohl in 1D und 2D Experi-menten die Methode der Wahl[176,222–227]
. Neben Peptiden und Proteinen werden auch Anwendungen der BASH-Entkopplung an DNA-Fragementen[228,229], Oligosacchariden[230,231] sowie zur Bestimmung von Enantiomeren- und Diastereomerenüberschüssen[232–235]beschrieben. Mit der in Kapitel 4.2.3 (Pro-jekt A-2) vorgestelltenperfectBASH Erweiterung konnte die vorherige Limitierung von einem auf zwei gekoppelte Protonen innerhalb der Bandbreite des selektiven Refokussierungspulses ausgedehnt werden, ohne auf die vorteilhaften Sensitivitätsverhältnisse verzichten zu müssen. Parallel zu unserer Arbeit in Projekt A-2 ist das gleiche Prinzip auch von Vermaet al.[236]publiziert worden.
Zangger-Sterk
Die 1997 von Zangger und Sterk[177]vorgestellte Zangger-Sterk-Methode ist eine Erweiterung der bandselektiven Entkopplung durch Kombination des selektiven Refokussierungspulses mit einem schwa-chen, linearenz-Gradienten, wodurch eine Breitbandentkopplung ermöglicht wird. Derz−Gradient führt zu einer linearen Verteilung der Larmor-Frequenzω0 entlang derz−Koordinate (Gleichung 2.4.3):
ω0(z) = −γ(B0 + Gzz) Ωj = −γB0(︁
1 − σjiso)︁
− ωrot (2.4.3)
In den Gleichungen 2.4.3 sind Gz die Gradientenstärke, z die Position entlang der z−Koordinate, σjiso der isotrope Anteil des Abschirmungstensors der chemischen Umgebung und ωrot die Frequenz des rotierenden Koordinatensystems. Wird der Ausdruck derz−abhängigen Larmor-Frequenz mit der Definition der chemischen VerschiebungΩj im rotierenden Koordinatensystem kombiniert, vereinfacht und nach Ωj aufgelöst, ergibt sich die Grundgleichung für die frequenz- und ortsaufgelöste NMR-Spektroskopie (spatial-encoding-Technik). Dabei wird zusätzlichω0durch eine definierte Einstrahlfrequenz ωrf beispielsweise eines selektiven Pulses ersetzt.
Ωj = ωrf + γGzz (2.4.4)
An Gleichung 2.4.4 lässt sich erkennen, dass jede chemische VerschiebungΩjdurch die Einstrahlfrequenz eines selektiven Pulses erfasst wird, jedoch an unterschiedlichen Positionen entlang derz−Koordinate.
Folglich kann die Kombination eines selektiven Refokussierungspulses mit einem schwachen, linearen z-Gradienten als eine Unterteilung des gesamten Probenvolumens in Teilvolumina (z-slices) betrachtet wer-den, in denen jeweils ein Protonensignal selektiv refokussiert und detektiert wird (Abbildung 2.4.4A). Das gleiche Prinzip wird auch angewendet, um kontinuierlich 1D1H-Spektren ohne Relaxationswartezeit[21], schneller 2D1H-COSY-Spektren[237]und 2D1H,13C-HMQC-Spektren[238]aufzunehmen, Diagonalpeaks in 2D TOCSY- und 2D NOESY-Spektren zu unterdrücken[239],T1-Relaxationszeitkonstanten in einem Scan[240]oder alleJHH-Kopplungskonstanten eines selektierten Protons (G-SERF)[241,242]zu bestimmen.
Ein umfassender Überblick über die Methoden und Anwendungen derspatial-encoding-Technik wird in dem Review von Dumez gegeben[243].
Als direkte Konsequenz der Detektion jedes Protonensignals in nur einem definierten kleinen Volumen-element wird die Sensitivität der Zangger-Sterk-Methode reduziert. Die effektiv detektierbare Intensität Intef f eines Protonensignals ist verknüpft mit der Breite∆z des zur Detektion genutzten Volumenel-ments, welche wiederum abhängig von der Bandbreite des selektiven Pulses∆ω, dem gyromagnetischen Verhältnis γ und der Stärke des Gradienten Gz ist. Die Bandbreite des selektiven Pulses kann nicht beliebig gewählt werden, sondern richtet sich nach dem geringsten Frequenzabstand zweier gekoppelter Protonen.
Intef f ∝ ∆z
Lmax = ∆ω
γGzLmax (2.4.5)
1H
Gz
PSYCHE element
t2
δ2 t1
2+δ1 t1
2+δ3
1 SW1
G1 G1
G2 G2
GP
B
RF Gz
z
A
ΩI ΩS ΩS ΩI
I.
τ
1τ
2τ
2'τ
1C
II.
Abbildung 2.4.4: (A) Schematische Darstellung des Arbeitsprinzips der Zangger-Sterk-Methode[177]
durch Kombination eines selektiven Refokussierungspulses mit einem schwachen, li-nearenz-Gradienten, wodurch jedes einzelne Protonensignal in einer anderen Schicht entlang derz−Koordinate (z-slice) detektiert wird.
In (B) und (C) ist schematisch das Arbeitsprinzip der PSYCHE-Methode dargestellt.
Hierbei werden mit dem Konzept der zeit- und örtlichen Ausmittelung ( spatio-temporal-averaging) unerwünschte Kohärenztransfers des zu Grunde liegendenanti−z −COSY-Experiments beseitigt.
Am Beispiel der Substanz Strychnin soll dies näher erläutert werden. Bei einer Protonenbasisfrequenz von 600 MHz beträgt der geringste Abstand von zwei gekoppelten Protonen etwa 41 Hz (abgeleitet aus der Protonenzuordnung von Strychnin nach Berger und Sicker[244]). Wird folglich ein selektiver Puls mit einer totalen Bandbreite von 40 Hz (≈60 ms Länge für ein RSnob-Pulsprofil[245]) mit einem Gradienten, der eine spektrale Breite von 4300 Hz abdeckt, kombiniert, so teilt sich die Länge des aktiven Volumens Lmax =2,3 cm in 107 einzelne Schichten der Breite 0,21 mm. Die Sensitivität wird dadurch auf etwa 0,93 % reduziert. In Systemen mit nur schwach gekoppelten Protonen ist die Zangger-Sterk-Entkopplung eine effektive Methode, allerdings versagt diese bei kleinen chemischen Verschiebungsunterschieden gekoppelter Protonen (starke Kopplung) durch den Sensitivitätverlust. Kapitel 4 befasst sich mit diesem Problem durch Weiterentwicklung der Zangger-Sterk Methode zum PEPSIE-Experiment.
Von Vorteil ist die Detektion einzelner Protonensignale in schmalen Schichten bei inhomogenen stati-schenB0-Feldern (ungenügendgeshimmtenProben) oder Inhomogenitäten, die sich auf die chemische Verschiebung auswirken. Durch die Detektion in einer schmalen Schicht mit verhältnismäßig geringer Inhomogenität können hier schmale Linien im resultierenden Spektrum erhalten werden.
Die Sensitivität lässt sich durch die sequentielle Zangger-Sterk-Entkopplung nach Sakhaiiet al.[246], durch ASAP (Accelaration bySharingAdjacentPolarization[19]) nach Suryaprakash[247]oder durch
multi-slice-Anregung nach Castanaret al.[248]oder Cotte[249]verbessern. Bei den ersten beiden Methoden ist auch der 90◦-Anregungspuls als Zangger-Sterk-Element implementiert. Bei der sequentiellen Methode wird mit jedem neuenPure ShiftInkrement (weitere Erklärung in Abschnitt 2.4.3) oder jedem neuen Scan die Anregungsfrequenz entsprechend einer Frequenzliste verschoben. Dadurch wird ein Protonensignal jeweils in einer anderen Schicht angeregt und detektiert. ASAP nutzt die nicht detektierten passiven Spins in einer jeweiligen Schicht als Reservoir für Kernspin-Polarisation. Vor der Aufnahme eines jeden neuen Pure Shift Inkrements oder neuen Scans wird die Kernspin-Polarisation mittels eines TOCSY-Mischelements (TOCSY-Spin-Lock) neu über das gesamte Kopplungsnetzwerk (Spin-System) verteilt.
Beide Methoden erlauben prinzipiell die kontinuierliche Messung ohne Relaxationswartezeit.
Diemulti-slice-Anregung verbessert die Sensitivität durch Anregung und Detektion der einzelnen Pro-tonensignale in mehreren Schichten, welche statistisch über die gesamte Länge des aktiven Volumens verteilt sind. Verwendet werden dafür phasen-modulierte selektive Refokussierungspulse mit mehreren Anregungsfrequenzen[250]. Es konnte gezeigt werden, dass dadurch auch für stark gekoppelte Spinsys-teme hochaufgelöstePure ShiftSpektren erhalten werden können. Limitiert wird die Methode durch die Wahrscheinlichkeit, dass zwei gekoppelte Protonen zufällig in einer Schicht angeregt werden. Je schmaler diese Schichten sind, desto mehr Schichten können gleichzeitig angeregt werden. Dennoch können bei der Verwendung von sehr vielen einzelnen Schichten zur Detektion Kopplungsartefakte an der Signalbasis auftreten.
PSYCHE
Die jüngste Technik zurspin-subsetSelektion ist 2014 von Foroozandehet al.[45] mit der PSYCHE-Methode (PureShiftYielded byChirpExcitation) vorgestellt worden. Diese nutzt eine rein statistische Selektion zwischen aktiven und passiven Spins aus und ist von dem 1986 publizierten anti-z −COSY-Experiment[44] abgeleitet, welches auch schon von Pellet al.[195] in einer Projektionsmethode genutzt wurde. Gleichung 2.4.1 wird dafür nochmal aufgegriffen, wobei nunt1 = t2 = t21 gesetzt und vereinfacht wird.
i 2I−Sα
HISt21−180◦−β−β−HISt21
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→
i
4sin2(β) cos2 (︃β
2 )︃
exp [it1ΩI]I−Sβ + i
16sin4(β) exp [it1(ΩI−πJIS)]I−Sα +i
8 (︃1
4sin4(β)−sin2(β) cos2 (︃β
2 )︃)︃
exp [︃
it1
(︃ΩI+ ΩS 2
)︃
−it1πJIS ]︃
IαS− +i
8 (︃
sin2(β) cos2 (︃β
2 )︃
− 1
4sin4(β) )︃
exp [︃
it1
(︃ΩI+ ΩS 2
)︃]︃
IβS−
(2.4.6)
Im ersten Term in der Analyse wird der Spin-Zustand des Kopplungspartners (passiver Spin) invertiert, wodurch sich effektiv nur die chemische Verschiebung entwickelt. Dies entspricht somit dem gewünschten Term zur homonuklearen Entkopplung. Im zweiten Term wird keiner der Spin-Zustände verändert, wodurch Kopplungsentwicklung auftritt. Aufgrund dessen sin4-Abhängigkeit ist dieser zweite Term bei kleinen Winkeln imβ-β-Pulselement (β ≤20◦) weniger relevant als der erste und folglich tritt die alleinige Inversion des passiven Spins (Term 1) statistisch häufiger auf im Vergleich zur Inversion keiner der beiden Spins. Diese statistische Selektion über den kleinen Anregungswinkel wird durch die PSYCHE-Methode ausgenutzt. Die Erläuterung des theoretischen Hintergrundes der PSYCHE-Methode begründet sich mit den Befunden in Projekt B (Kapitel 5), in dem die PSYCHE-Methode in 2D EASY-ROESY-Experimenten zur Quantifizierung von Kreuzrelaxation und chemischem Austausch angewendet wird.
Als Spin-selektives Inversionselement lässt sich dasβ-β-Pulselement jedoch nicht direkt nutzen, da es neben der gewünschten Operation auch unerwünschten Kohärenztransfer verursacht. Dieser COSY-Kohärenztransfer zeigt sich in den letzten beiden Termen der Analyse. Durch die von Foroozandeh vorgestellte Implementierung (Abbildung 2.4.4B) des β-β-Pulselements lassen sich die Effekte des unerwünschten COSY-Kohärenztransfers nahezu vollständig aus den resultierenden Spektren beseitigen.
Dieses besteht aus zwei adiabatischenSaltire-Chirp-Pulsen mit geringer Leistung (kleinesγB1) während eines schwachenz−Gradienten. Zusätzlich werden Null-Quanten-Kohärenzen unterdrückt und Effekte durch starke Kopplung abgeschwächt. In einemSaltire-Chirp-Puls werden die Frequenzen von beiden Seiten her gleichzeitig durchfahren.
Die Wirkungsweise des PSYCHE-Elements ist schematisch in Abbildung 2.4.4C dargestellt. Durch den Saltire-Chirp-Puls werden unterschiedliche Offsets (chemische Verschiebungen) zu unterschiedlichen Zeiten angeregt. Beim gewünschten ersten Term findet kein Kohärenztransfer vomI-Spin auf denS-Spin statt, folglich sind die effektiven Perioden, in denen durch den Gradient ein Phasenfaktor akkumuliert wird, gleich lang und symmetrisch angeordnet (in Abbildung 2.4.4C - I. grün markiert). Die akkumu-lierten Phasenfaktoren entlang derz−Koordinate heben sich gegenseitig auf beziehungsweise werden vollständig rephasiert. Wird hingegen Magnetisierung vomI-Spin auf denS-Spin übertragen - wie bei Term 3 und 4 - (Abbildung 2.4.4C - Fall II.), sind die effektiven Gradientenperioden ungleich (rot und grün) und die akkumulierten Phasenfaktoren entlang der z-Achse bleiben bestehen. Der unerwünschte Kohärenztransfer wird daher entlang derz−Koordinate dephasiert und somit unterdrückt. Die Effizienz der Unterdrückung hängt in erster Näherung von der Dauer des PSYCHE-Elements insgesamt und der Differenz der chemischen Verschiebungen ab, wobei üblicherweise eine Länge von mindestens 30 ms benötigt wird. Es sei hier darauf hingewiesen, dass die Abbildung 2.4.4C und die Erläuterungen die Eigenschaften des PSYCHE-Elements nur in erster Näherung darstellen, da auchSpin-Locking-Effekte eine Rolle spielen, die ein gekoppeltes Protonenpaar in den Bereich der starken Kopplung überführen können. Diese vereinfachte Betrachtungsweise ist dann entsprechend nicht mehr gültig.
Das PSYCHE-Experiment bietet gegenüber der Zangger-Sterk- oder BIRD-Methode den Vorteil, dass die erreichbare Sensitivität formal nur von der Wahl des Anregungswinkelsβ abhängt und nur noch indirekt
von der chemischen Verschiebungsdifferenz. Die Sensitivität beträgt für einen Anregungswinkel von β =20◦etwa 10%. Die vergleichsweise gute Sensitivität und Entkopplungsqualität der PSYCHE-Technik haben seit der ersten Vorstellung 2014 zu einem Einbau in einer Vielzahl an ein- und mehrdimensiona-len Methdoden und breiten Anwendungsmöglichkeiten geführt[109,181,191,194,201,251–277]
. Die Entkopp-lungsqualität lässt sich durch die Erweiterung zumTriple-Spin-Echo-PSYCHE (TSE-PSYCHE)[194]weiter verbessern, dessen Arbeitsprinzip auf den Konzepten von Thrippletonet al.[200]zur Unterdrückung starker Kopplungsartefakte in 2DJ-resolved-Experimenten beruht. Dies ist jedoch mit einem zusätzlichen Sensitivitätsverlust verbunden.
Konstruktion vonPure ShiftSpektren
Die im vorangegangenen Kapitel vorgestellten Elemente erlauben die Refokussierung der skalaren J−Kopplung unter Ausnutzung des Prinzips derspin-subset-Selektion. Die Entwicklung der chemischen Verschiebung bleibt unbeeinflusst, sofern die Elemente in Kombination mit einem 180◦-Puls mittig in einer Evolutionszeit platziert sind. Zur Erzeugung vonPure Shift1H-Spektren ist die alleinige Refokussie-rung der skalaren Kopplung noch nicht ausreichend, da dieJ−Kopplung sich während der Aufnahme des FID entwickelt. Um dennoch ein- und mehrdimensionale Pure Shift Spektren zu erhalten, sind verschiedene Implementierungen entwickelt worden. Die derzeit verwendeten Implementierungen sind in Abbildung 2.4.5 dargestellt.
Abbildung 2.4.5A zeigt die Verwendung zur homonuklearen Entkopplung in der indirekten DimensionF1 eines 2D-Experiments. Bis zur ersten Vorstellung leistungsfähiger Methoden für 1DPure Shift1H-Spektren oder der Entkopplung in der direkten DimensionF2 war dieF1-Entkopplung die übliche Anwendung der Refokussierung skalarer Kopplung. Beispiele hierfür sind HETCOR-Experimente mit BIRD-Entkopplung inF1[217–219],F1-BIRD-HETLOC[279](HETLOC:heteronuclearlong-rangecouplings),F1-BIRD- oder F1-BASH-HECADE[280](heteronuclearcouplings fromaSSCI-domain Experiments withe.COSY-type cross peaks) oder die BASH-Entkopplung in F1 von COSY-[176], TOCSY-[228], NOESY-[176,222] und ROESY-Experimenten[224]. Die in Abbildung 2.4.5 dargestellte Implementierung stellt die heute weitgehend verwendete Methode zurF1-Entkopplung dar. Das Spin-selektive Inversionselement folgt dabei nicht direkt auf den breitbandigen 180◦-Puls, um ein effektives Filtern durch magnetische Feldgradienten zu erreichen.
Komplizierter gestaltet sich die Konstruktion von eindimensionalenPure Shift1H-Spektren beziehungs-weisePure Shiftin der direkten Dimension von nD-Spektren. Dabei wird auf eine interferogramm-basierte, auchpseudo-2D oderchunking-Methode genannt, zurückgegriffen. Die Beschreibungen in den Origi-nalpublikationen des BIRD-Elements[175] sowie derConstant-Time-Methode[173]legen nahe, dass ein homonuklear entkoppeltes 1D-1H-Spektren erhalten wird, indem der FID Punkt für Punkt durch Inkre-mentierung der Evolutionszeit und anschließender Fouriertransformation entlang dieser Evolutionszeit aufgenommen wird. In der Publikation der Zangger-Sterk-Methode[177] ist eine deutlich effizientere Methode beschreiben worden, um ein 1DPure Shift1H-Spektrum zu erhalten. Der FID wird hierbei
1H Gz
90° 180°
δ2 t1
2+δ1 t21+δ3
G1 G1G2 G2
Misch-Element
t
2SSI - Element
t
21 SW1
1H Gz
90° 180°
δ2
t1
2+δ1 t21+δ3
G1 G1G2 G2
SSI - Element
t1 -Inkrementierung
t1 -Inkrementierung
...
FID Rekonstruktion
90° 180°
Δ ≤ 20ms
1H Gz
FID Rekonstruktion
SSI - Element
δ1
180°
SSI - Element
δ2 δ2
δ1
180°
SSI - Element
δ2 δ2
180°
SSI - Element
δ2 δ2
A
B
C
Abbildung 2.4.5: Implementierung der Kombination aus 180◦-Puls und Spin-selektivem Inversions-element zur homonuklearen Entkopplung der indirekten Dimension F1 eines 2D-Experiments (A). Erzeugung eines 1D Pure Shift 1H-Spektrums mit der durch NILS-SON und MORRIS verbesserten interferogramm-basierten, pseudo-2D oder chunking-Methode[278](B) und mit derreal-time-Entkopplung nach LUPULESCUet al.[179](C).
nicht punktweise aufgenommen, sondern in kurzen Stücken, sogenanntendata-chunks, deren Länge im Vergleich zur Inversen einer typischen KopplungskostantenJHH−1 klein ist. Üblich sinddata-chunk-Längen von bis zu 25 ms. In der ursprünglichen Methode nach Zangger und Sterk folgte das Spin-selektive Inversionselement (Zangger-Sterk-Element) direkt auf den 180◦-Puls. Die Evolutionszeitt1 wird schritt-weise um die Länge einesdata-chunksinkrementiert, um die Entwicklung der chemischen Verschiebung bei gleichzeitiger Refokussierung der skalarenJ−Kopplung int1 zu kodieren. Nach Rekonstruktion des FIDs durch Zusammenfügen der einzelnendata-chunkssowie Fouriertransformation entlangt1wird ein 1DPure Shift 1H-Spektrum erhalten.
Diese Technik ist später von Nilsson und Morris im Rahmen eines Zangger-Sterk-DOSY Experiments[278]
verbessert worden (Abbildung 2.4.5B). Eingeführt wurde die Kohärenzselektion mittels Gradienten sowie eine veränderte zeitliche Abstimmung des breitbandigen 180◦-Pulses und des Spin-selektiven Inversionselements. Diese Implementierung bewirkt die Refokussierung der skalarenJ−Kopplung jeweils in der Mitte eines jedendata-chunks, die chemische Verschiebung wird jedoch zu Beginn des ersten aufgenommenendata-chunksrefokussiert. Dadurch lässt sich die Länge einesdata-chunksverdoppeln und es müssen bei gleichbleibender Länge des rekonstruierten FID wenigerdata-chunksaufgenommen werden. Die verbleibende geringfügige Kopplungsentwicklung während eines data-chunks führt zu Seitenbanden (chunking-Artefakte) in periodischen Abständen, welche sich mit wenig intensiven Signalen von möglichen Nebenkomponenten überlagern können. In der SAPPHIRE-Methode (SidebandAveraging byPeriodicPHaseIncrementation ofResidual J-Evolution) werden diesechunking-Artefakte näherungsweise ausgemittelt[281].
Eine zeitlich effizientere Methode zur homonuklearen Entkopplung stellt die sogenannte real-time-Entkopplung dar. Diese ist in Abbildung 2.4.5C gezeigt. Die Akquisition (FID) wird von kurzen Entkopp-lungsblöcken zur Refokussierung der skalarenJ−Kopplung unterbrochen. Diereal-time-Entkopplung wurde von Lupulescuet al.[179] zunächst für die BIRD-Entkopplung vorgestellt, kurz darauf folgten Erweiterungen um diereal-time-BASH-Entkopplung[208],real-time-Zangger-Sterk-Entkopplung[282]sowie deren Anwendung in zweidimensionalen Experimenten[92,190,229,283–288]
.
Konzeptionell neu ist das Prinzip, die Signalakquisition zur homonuklearen Entkopplung zu unterbrechen, allerdings nicht. Bereits 1973 wurde von Jesson ein entsprechendes Konzept vorgestellt[289], welches die homonukleare Entkopplung oder die Sättigung einer intensiven Resonanz während der Akquisitions-zeit ermöglicht. Hierbei werden der Empfänger zur Datenaufnahme (receiver) und ein kontinuierliches Radiofrequenzfeld (decoupler) innerhalb derdwell-time(Zeitspanne zwischen zwei Datenpunkten) ab-wechselnd aktiviert. Dieses weitere Radiofrequenzfeld wird auf die Frequenz einer entsprechenden Linie im Spektrum gesetzt, um diese entweder zu sättigen oder die Kopplungsaufspaltung ihrer skalaren Kopplungspartner zu entfernen. Erweitert wurde dieses Konzept durch Hammarström[223], wobei ein selektiver Refokussierungspuls in mehrere Amplitudenelemente zerteilt und während derdwell-time eingeschoben wird. Dieses Konzept, genanntsemiselective shaped pulses as semiselective acquisition modu-lated(SESAM) Entkopplung, ermöglichte erstmalig, im Amidbereich eines kleinen Peptids vollständig die
Kopplungsaufspaltung zu entfernen, um ein in beiden DimensionenF1 undF2 band-selektiv homonu-klear entkoppeltes ROESY Spektrum aufzunehmen. Anwendungen dieser Methode waren jedoch auf die band-selektive homonukleare Entkopplung beschränkt[225,290].
Auch in derreal-time-Entkopplung können Seitenbanden oder Entkopplungs-Artefakte im resultierenden Pure ShiftSpektrum auftreten. Diese werden einerseits durch die Unterbrechung der Akquisition bei weiterlaufenderT2−Relaxation sowie andererseits durch die Entwicklung derJ−Kopplung während der kurzen Akquisitionsblöcke verursacht. Diesereal-time-Entkopplungs-Artefakte lassen sich durch die kontinuierliche Variation der Länge der FID-Blöcke ausmitteln[291]. Nicht jedes Spin-selektive Inversi-onselement ist mit derreal-time-Entkopplung kombinierbar. Beispielsweise kann die PSYCHE-Methode durch ihre statistische Selektion zwischen aktiven und passiven Spins hier nicht verwendet werden. Das gilt auch für die in Kapitel 4 diskutiertenPerfect-EchomodifiziertenPure ShiftExperimente. Im Gegensatz zurpseudo-2D-Methode ist die Anwendung von BASH und Zangger-Sterk wegen der Länge des selektiven Refokussierungspulses auf schwach gekoppelte Systeme begrenzt, da die FID-Unterbrechungen nicht beliebig lang werden können. Bei kleinen chemischen Verschiebungsunterschieden gekoppelter Protonen (starke Kopplung) kann BIRD verwendet werden, wobei allerdings diastereotope Protonen mit BIRD nicht entkoppelt werden. Diesemi-real-time-Entkopplung nach Kiraly[292]bietet eine Lösung für das Problem längerer FID-Unterbrechungen. Konzeptionell handelt es sich dabei um eine Kombination aus der interferogramm-basierten Aufnahmemethode und derreal-time-Entkopplung. Die FID-Lücken durch längere Entkopplungsblöcke aus einem ersten Scan werden in einem zweiten mit inkrementiertert1-Zeit gefüllt.
Das Konzept derreal-time-Entkopplung wird mittlerweile zusätzlich zur Hochskalierung von Kopplungs-konstanten während der Akquisition angewendet, um homonukleare und heteronukleareJ −Kopplungskon-stanten aus einem Spektrum präziser bestimmen zu können[264,293–296]
.
DiePerfect-EchoSequenz
DiePerfect-EchoSequenz wurde ungefähr zeitgleich von Takegoshi[43]und Van Zijl[297] beschrieben.
Die Sequenz ist die Grundlage für die in Projekt A diskutierte Entwicklung und Evaluation neuartiger Pure Shift Experimente. Das Perfect-Echo Experiment an sich stellt zwar keinPure Shift Experiment dar, wie sie im Kapitel bisher diskutiert wurden. Dennoch lässt sich die Sequenz durch ihre speziellen Eigenschaften in den Kontext von Experimenten einordnen, welche das Ziel verfolgen, die Effekte der skalarenJ−Kopplung zu beseitigen. Daher sollen in diesem Unterkapitel diePerfect-EchoSequenz an sich, ihre Eigenschaften und Anwendungen diskutiert werden.
Die Perfect-Echo Sequenz (Abbildung 2.4.6) besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Hahn-Echos[33], getrennt durch einen 90◦-Puls, der relativ zum Anregungspuls um 90◦phasenverschoben ist. In einem idealen Zwei-Spin-12-System lässt sich durch eine Produkt-Operator-Analyse zeigen, dass diePerfect-Echo Sequenz nicht nur die Entwicklung der chemischen VerschiebungΩrefokussiert, sondern zusätzlich
Φ
3=Φ
1±90°
Φ
1Abbildung 2.4.6: Pulssequenzschema für diePerfect-Echo Sequenz nach TAKEGOSHI[43]. Die Pulspha-sen sind wie folgt definiert: Φ1= x, -x undΦ3= y, -y. Alle anderen Pulse können eine beliebige Phase besitzen.
die Effekte durch die Entwicklung der skalaren KopplungJ beseitigt. Abgesehen von Relaxation und chemischem Austausch unterscheidet sich dadurch der Endzustand nach der Sequenz nicht von dem nach der Anregung. Jegliche Entwicklung vonJ−Kopplung und chemischer Verschiebung ist entfernt worden.
In diesem Zusammenhang wird bewusst nicht der Begriff “Refokussierung der Kopplung“ durch dasPerfect Echoverwendet, da es sich streng genommen um eine gegenseitige Aufhebung der Kopplungsterme und nicht um eine Refokussierung im klassischen Sinne handelt. Zusätzlich wird ein Kohärenztransfer von In-Phasen-Magnetisierung zwischen den beiden gekoppelten Spins induziert. Das klassische Hahn-Echo[33]
refokussiert im Vergleich dazu nur die Entwicklung der chemischen Verschiebung, die Entwicklung der skalarenJ-Kopplung bleibt hingegen bestehen. Eine vollständige Analyse mit Produkt-Operatoren für ein ideales Zwei-Spin-12-System befindet sich in Kapitel 11.2 im Anhang.
Die Entfernung derJ−Kopplungseffekte ist allerdings streng nur gültig für schwach gekoppelte
Zwei-Spin-1
2-Systeme (AX-System). In Spinsystemen mit mehr als zwei gekoppelten Spins verschwinden die Terme und die Modulation durch die skalareJ−Kopplung nicht mehr vollständig. Gekoppelte Spin-12-Systeme jenseits des AX-Systems werden bei Van Zijl[297] diskutiert. Handelt es sich bei dem Zwei-Spin-12 -System um ein stark gekoppeltes Zwei-Spin-12-System (AB-System), ist diese Eigenschaft auch nicht mehr uneingeschränkt gültig. Dieser Fall wird bei Mulkernet al.[298] und Howe[299]diskutiert.
Nach deren Wiederentdeckung hat diePerfect-EchoSequenz in den letzten zehn Jahren durch ihr Ver-halten bezüglich der skalaren J−Kopplung zu einer Vielzahl von Anwendungen als Bauelement in NMR-Experimenten geführt. In dem Review von Parella[300] wird über die Eigenschaften und Anwen-dungen ein Überblick gegeben. Dazu gehören Experimente zur Messung von Diffusion[301,302]und vonT2 -Zeitkonstanten[303,304](PROJECT), Experimente mit Unterdrückung von starken Lösungsmittelsignalen[305]
oder in einem DEPT-Experiment für13C-isotopenmarkierte Substanzen[306], in denen die Verzerrung von Signalen durchJCC-Modulation verhindert wird. Weiterhin wurde dasPerfect Echozur Unterdrückung derJHH-Modulation während des INEPT-Elements (Perfect echoINEPT[307],perfect-(CLIP-)HSQC[308]), während der t1-Zeit in einem HMQC[309] oder in einem 2D-NOESY zur verbesserten Unterdrückung von Null-Quanten-Kohärenzen verwendet[310]. Anwendungen in Experimenten für ortsaufgelöstein-vivo Spektroskopie[311]werden ebenfalls beschrieben. Schließlich lässt sich der Austausch von Magnetisierung zwischen den gekoppelten Spins in einem Mischelement für ein In-Phasen-COSY-Experiment (CLIP-COSY) nutzen[52,60].
Die Nutzung der Eigenschaften derPerfect-EchoSequenz inPure ShiftExperimenten ist erstmalig von Lukas Kaltschnee erkannt und in demperfectBIRD-Entkopplungsschema[210]umgesetzt worden. Das perfectBIRD-Schema ermöglicht im Vergleich zum klassischen BIRD-Element auch die homonukleare Entkopplung von diastereotopen Protonen, wobei ein dualer Entkopplungseffekt einerseits durch das BIRD-Element und andererseits durch dasPerfect-Echogenutzt wird. Dieses duale Entkopplungskonzept lässt sich auch allgemeiner fürPure ShiftAnwendungen nutzen und hat zur Entwicklung der in Projekt A diskutierten neuartigenPure ShiftExperimente PEPSIE undperfectBASH geführt.