PerfectBASH-Entkopplung:
4.3 Anwendung in homonuklearen 2D-Experimenten
EASY-ROESY-Experiment mit dem PEPSIE-Schema zur homonuklearen Entkopplung in der direkten Dimension F2 entworfen, da bereits Erfahrung mit derF2-Entkopplung unter Verwendung von Zangger-Sterk und perfectBIRD vorhanden war. Die F2-PEPSIE-Entkopplung wird in einer zusätzlichen Pure Shift Dimension ausgeführt, wodurch einpseudo-3D-Experiment entsteht (Abbildung 4.3.1A). Dieses hat durch die Codierung einer zusätzlichenPure ShiftDimension einen signifikant erhöhten Messzeitbedarf im Vergleich zu einem konventionellen 2D-Experiment.
Im F2-PEPSIE-EASY-ROESY-Spektrum zeigten sich nur eine mäßige homonukleare Entkopplung in F2 sowie zusätzliche Kreuzpeaks mit Phasenverzerrungen zwischen gekoppelten Protonen. Da diese zusätzlichen Kreuzpeaks nicht in zum Vergleich aufgenommenenF2-Zangger-Sterk- undF 2-PSYCHE-EASY-ROESY-Spektren auftraten, musste die Ursache im PEPSIE-Entkopplungsblock liegen. Der In-Phasen-Kohärenztransfer der zu Grunde liegendenPerfect-EchoSequenz wurde als Ursache vermutet. Weiterhin wurde angenommen, dass sich diese Phänomene in einem F1-PEPSIE-EASY-ROESY-Spektrum nicht beobachten lassen sollten.
Diese Befunde sind nun im Rahmen der Promotion genauer theoretisch untersucht worden. Es wurde eine Pulssequenz für einF1-PEPSIE-EASY-ROESY-Experiment entsprechend der allgemeinen Darstellung in Abbildung 4.3.1B entworfen. In dieser Variante ist die Abstimmung der Pulsphasen zu berücksichtigen, um phasensensitive EASY-ROESY-Spektren mit dem States-[468], TPPI-[469,470]oder States-TPPI-Protokoll[471]
aufzunehmen. Wird dieF1-PEPSIE-Entkopplung mit dem States-TPPI-Protokoll kombiniert, ist nicht nur die Phase des 90◦-Anregungspulses mit jedemt1-Inkrement zu inkrementieren, sondern auch die Phasen aller 90◦- und 180◦-Pulse des PEPSIE-Entkopplungsblocks. Erfolgt das nicht, wird das 2D Spektrum von einem inF1 gespiegelten 2D Spektrum (Anti-Spektrum) überlagert. Unter Berücksichtigung der korrekten Phasenabstimmung wird die homonukleare Entkopplung inF1 erhalten, zusätzliche Kreuzpeaks durch In-Phasen Kohärenztransfer werden hingegen nicht beobachtet.
Das unterschiedliche Verhalten des PEPSIE-Schemas zur Entkopplung der direkten DimensionF2 oder indirekten Dimension F1 lässt sich durch eine Produktoperatoranalyse für ein schwach gekoppeltes Zwei-Spin-12-System an einem vereinfachten PEPSIE-Entkopplungsblock theoretisch analysieren. Zur korrekten Beschreibung der Vorgänge sind sowohl die AnfangsmagnetisierungenM1 undM2 (und damit unterschiedliche Ausgangsbedingungen) als auch die Entwicklung der chemischen VerschiebungenΩI undΩSim zweiten Echo-Block zu berücksichtigen. Letzteres begründet sich durch die Implementierung des zweiten Echo-Blocks nach Nilsson und Morris[278]. Daher geht diese Betrachtung sowohl über die Analyse der Perfect-Echo-Sequenz in Kapitel 11.2 als auch über die Analyse in Kapitel 1.2 in der Supporting Information hinaus. Da die Analyse die Entkopplung inF2, inF1 und für 1D-1H-Spektren mit der interferogramm-basierten Akquisitionsmethode sowohl für PEPSIE als auchperfectBASH beschreibt, kann sie als allgemeingültig für diese beiden homonuklearen Entkopplungsschemata im Grenzfall zweier schwach gekoppelter Protonen angesehen werden.
Durch die genannten Bedingungen (M1 ̸= M2, chemische Verschiebungsentwicklung im zweiten Echo) wird der Rechenaufwand deutlich komplizierter und länger. Daher wurde die Analyse mit der
Unterstüt-zung des MathematikprogrammswxMaximazum Zusammenfassen und Vereinfachen der jeweiligen Ein-zelterme durchgeführt. In der Analyse werden perfekte Pulse angenommen sowie Relaxation, chemischer Austausch und dieslice-selectionvernachlässigt. Im Folgenden soll das Endergebnis nach Zusammenfassen gleicher Terme, Einsetzen der entsprechenden Zeitkonstantenδ1bisδ4und anschließender Vereinfachung diskutiert werden. Zunächst wird der Fall einer PEPSIE-Entkopplung in der direkten DimensionF2 ana-lysiert. Hierbei sindt2 die Entwicklungszeit für diePure ShiftDimension,t3die Länge einesdata-chunks undδ4 ist entsprechend Abbildung 4.3.1A definiert alsδ4 = p16 + 2d16. Ein analoges Ergebnis wird für ein 1D1H-PEPSIE-Experiment für ein schwach gekoppeltes Zwei-Spin-12-System erhalten, das mit der interferogramm-basierten Methode durchgeführt wird.
1 2Iy{︂
= 1. Summandˆ︁
⏟ ⏞⏞ ⏟
(M1 − M2) cos [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
cos [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)] +
= 2. Summandˆ︁
⏟ ⏞⏞ ⏟
(M1 + M2) cos [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃ }︂
−1 2Ix{︂
(M1 − M2) sin [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
cos [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)] + (M1 + M2) sin [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃ }︂
+IxSz
{︂
(M2 − M1) cos [︃
ΩI (︃
t2 + t3
2 )︃]︃
sin [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)]}︂
−IySz{︂
(M1 − M2) sin [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
sin [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)]}︂
1 2Sy{︂
(M2 − M1) cos [︃
ΩS (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
cos [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)] + (M2 + M1) cos [︃
ΩS (︃
t2 + t3 2
)︃]︃ }︂
−1 2Sx{︂
(M2 − M1) sin [︃
ΩS (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
cos [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)] + (M2 + M1) sin [︃
ΩS (︃
t2 + t3 2
)︃]︃ }︂
+SxIz
{︂
(M1 − M2) cos [︃
ΩS (︃
t2 + t3
2 )︃]︃
sin [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)]}︂
−SyIz{︂
(M2 − M1) sin [︃
ΩS (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
sin [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)]}︂
(4.3.1) An den Ausdrücken für die In-Phasen-Terme Iy, Sy,Ix, und Sx lässt sich erkennen, dass erstens die Modulation durch die skalareJ−Kopplung im ersten Summanden (siehe Bezeichnung im Ausdruck) nur verschwindet, wenn die AusgangsmagnetisierungenM1 undM2 gleich sind. Zweitens enthalten jeweils die zweiten Summanden der In-Phasen-Terme eine Summe der beiden AusgangsmagnetisierungenM1 und M2 von beiden Protonen I und S, was auf einen Magnetisierungstransfer zwischen den beiden ProtonenI undS durch das Entkopplungs-Element hinweist. Die Anti-Phasen-TermeIxSz,IySz,SxIz undSyIxverschwinden ebenfalls nur bei gleichen Ausgangsmagnetisierungen.
Exemplarisch sollen nun fürIy die Auswirkungen für den konkreten Fall unterschiedlicher Ausgangsbedin-gungen (M1 ̸= M2) am Beispiel einespseudo-3DF2-PEPSIE-NOESY-Experiments betrachtet werden. Der PEPSIE-Entkopplungsblock wird dafür nach dem NOESY-Mischelement platziert. Für andere
homonuklea-re 2D Experimente lassen sich analoge Diskussionen fühhomonuklea-ren. Da in dem 2D NOESY-Experiment die beiden ProtonenI und S sowohl unterschiedliche Modulationen während dert1-Entwicklungszeit als auch ein unterschiedliches Relaxationsverhalten während des NOESY-Mischelements aufweisen, kann davon ausgegangen werden, dassM1 ̸= M2 gilt. BeiIy im Ausdruck 4.3.1 werden folglichM1 = M0aIIeiΩIt1 und M2 = M0aSSeiΩSt1 gesetzt, wobei der komplexe Exponentialausdruck für die Entwicklung der chemischen VerschiebungenΩIundΩS währendt1 steht. Die FaktorenaII undaSS stehen für die Matri-xelemente der Diagonalpeaks vonI undSim 2D NOESY-Experiment, deren Definition beispielsweise in Ausdruck 2.3.13 in Kapitel 2.3.3 gefunden werden kann. FürIy ergibt sich dadurch:
1 2Iy{︂
M0aIIeiΩIt1 cos [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
+M0aSSeiΩSt1 cos [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
+M0aIIeiΩIt1 cos [︃
ΩI
(︃
t2 + t3
2 )︃]︃
cos [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)]
−M0aSSeiΩSt1 cos [︃
ΩI (︃
t2 + t3 2
)︃]︃
cos [2πJ(t2 + t3 + 2δ4)] }︂
(4.3.2)
Ähnliche Ausdrücke lassen sich auch für die anderen In-Phasen-TermeSy,Ix, undSx sowie die Anti-Phasen-TermeIxSz,IySz,SxIz undSyIxableiten.
Die Ausdrücke in den ersten beiden Zeilen in Gleichung 4.3.2 zeigen die gleiche chemische Verschie-bungsmodulation während der Entwicklungszeit derPure ShiftDimensiont2. Allerdings weisen sie eine unterschiedliche Entwicklung der chemischen Verschiebung währendt1 auf. Nach FID-Rekonstruktion und doppelter Fouriertransformation führt das zu einemI, I-Diagonalpeak und zu einemS, I-Kreuzpeak.
Auch wenn die beiden ProtonenI undS keinen NOE aufweisen, tritt dennoch ein Kreuzpeak auf, der allerdings nicht durch Kreuzrealaxation sondern durch den Magnetisierungstransfer zwischenI undS während des PEPSIE-Entkopplungsblocks hervorgerufen wird. Die Ausdrücke in der dritten und vierten Zeile in Gleichung 4.3.2 führen ebenfalls zu einemI, I-Diagonalpeak und zu einemS, I-Kreuzpeak. Zu-sätzlich weisen diese noch eine Modulation durch die skalareJ−Kopplung auf, was sich im resultierenden 2D-Spektrum durch Linienaufspaltung und Phasenverzerrungen in der direkten Dimension äußert. Die homonukleare Entkopplung ist folglich unvollständig.
Die theoretisch abgeleiteten Eigenschaften einer homonuklearenF2-PEPSIE-Entkopplung geben die experimentellen Befunde aus der Masterarbeit wieder und zeigen, dass eine PEPSIE-Entkopplung in der direkten DimensionF2 eines homonuklearen 2D-Experiments nicht ohne diese zusätzlichen Kreuzpeaks (COSY-Artefakte) möglich ist.
Es soll nun der Fall einerF1-PEPSIE-Entkopplung betrachtet werden. Auch hier wird das Endergebnis nach Einsetzen der entsprechenden Zeitkonstantenδ1 bisδ4und anschließender Vereinfachung gezeigt. Die einzelnen Zeitabschnitte sind so abgestimmt, dass zu Beginn des Mischelements die skalareJ−Kopplung refokussiert wird, die chemischen Verschiebungen sich jedoch mit der Evolutionszeitt1 entwickelt haben.
Die Zeitkonstanteδ1 ist ensprechend der Abbildung 4.3.1B definiert.
1 2Iy{︂
(M1 − M2) cos [ΩIt1] cos [2πJ(t1 + 2δ1)] + (M1 + M2) cos [ΩIt1]}︂
−1 2Ix{︂
(M1 − M2) sin [ΩIt1] cos [2πJ(t1 + 2δ1)] + (M1 + M2) sin [ΩIt1]}︂
+IxSz{︂
(M2 − M1) cos [ΩIt1] sin [2πJ(t1 + 2δ1)]}︂
−IySz{︂
(M1 − M2) sin [ΩIt1] sin [2πJ(t1 + 2δ1)]}︂
1 2Sy
{︂
(M2 − M1) cos [ΩSt1] cos [2πJ(t1 + 2δ1)] + (M2 + M1) cos [ΩSt1]}︂
−1 2Sx{︂
(M2 − M1) sin [ΩSt1] cos [2πJ(t1 + 2δ1)] + (M2 + M1) sin [ΩSt1]}︂
+SxIz{︂
(M1 − M2) cos [ΩSt1] sin [2πJ(t1 + 2δ1)]}︂
−SyIz{︂
(M2 − M1) sin [ΩSt1] sin [2πJ(t1 + 2δ1)]}︂
(4.3.3)
Wird nun angenommen, dassM1 = M2 = M0gilt, bleiben lediglich diejenigen Terme übrig, die während der Entwicklungszeitt1 mit den chemischen VerschiebungenΩI undΩS moduliert werden:
IyM0cos [ΩIt1]
−IxM0sin [ΩIt1] SyM0cos [ΩSt1]
−SxM0sin [ΩSt1]
(4.3.4)
Die theoretische Ableitung der Eigenschaften einer homonuklearenF1-PEPSIE-Entkopplung (indirekte Dimension) zeigen, dass diese im Gegensatz zu einer PEPSIE-Entkopplung in der direkten Dimension möglich ist und weder zu einer unvollständigen homonuklearen Entkopplung noch zu zusätzlichen Kreuzsignalen im resultierenden 2D Spektrum führt.
4.3.1 Anwendung derF1-PEPSIE-Entkopplung zur Analyse und Zuordnung eines Oligoharnstoffes
α2 γ2β
α1
H'N H N O
NH' N H
H'N H
N N
H' N H
H'N H
N N
H' O
O
O
O
O NH NH
NH Br O
H
H H H H
γ1
(pBr)Ph-cap res. 6 res. 5 res. 4 res. 3 res. 2 res. 1 Bn-cap
Abbildung 4.3.2: Struktur des Oligoharnstoffs, bestehend aus sechs gleichen Harnstoffbaueinheiten mit aromatischen Seitengruppen und Schutzgruppen an den jeweiligen Enden.
Das Potential der PEPSIE-Entkopplung ist im Vergleich zur Zangger-Sterk-Entkopplung anhand eines Oligoharnstoffs, bestehend aus sechs gleichen Harnstoffbaueinheiten mit aromatischen Seitengruppen und Schutzgruppen an den jeweiligen Enden (Abbildung 4.3.2), demonstriert worden. Solche Oligo-harnstoffe zeigen eine starke Selbstorganisation und sind strukturell und in ihrer Funktion den Peptiden nachempfunden, wobei sie resistenter gegenüber biochemischem Abbau sein sollen[472–476].
Zuvor ist dieses System im Rahmen der Bachelor-Thesis von Timo Imhof[477]unter der Betreuung von Lukas Kaltschnee und in dessen Dissertation[465]mit einemperfectBIRD-HSQC mit vollständiger homonu-klearer und heteronuhomonu-klearer Entkopplung betrachtet worden. Die Herausforderung des Oligoharnstoffs besteht trotz seines anscheinend einfachen Aufbaus mit stets gleichen Wiederholungseinheiten in einem stark geclusterten1H-Spektrum. Abgesehen vom Bereich der aromatischen und Amid-Protonen überla-gern sich in den anderen beiden Clustern mindestens zwei gekoppelte Gruppen von Protonen. Besonders der Bereich um 2,8 ppm stellt durch die Vielzahl an einzelnen Signalen und die starke Kopplung derγ1 -undγ2-Protonen eine Herausforderung dar. Für die PEPSIE-Entkopplung ist das jedoch vorteilhaft. Trotz der homonuklearen Entkopplung des Signalclusters um 2,8 ppm mittels PEPSIE ist eine Zuordnung von allen Singuletts ohne die Hilfe von 2D Experimenten nicht möglich. Daher ist das PEPSIE-Schema zur Analyse dieses Systems neben dem zuvor beschriebenen EASY-ROESY-Experiment in die 2D-Experimente TOCSY, NOESY, CLIP-COSY[52],relayed-CLIP-COSY[60] und DIAG[249] zur homonuklearen Entkopplung der indirekten DimensionF1 entsprechend der allgemeinen Darstellung in Abbildung 4.3.1B) eingebaut worden. Die 2D Experimente NOESY,relayed-CLIP-COSY und DIAG jeweils mitF1-PEPSIE-Entkopplung sind an dem Oligoharnstoffsystem nicht zur Anwendung gekommen, hier wurden lediglich Testspektren an Strychnin aufgenommen. Alle Pulssequenzen für 2D-Experimente mitF1-PEPSIE-Entkopplung sind bis aufF1-PEPSIE-DIAG im Rahmen derperfectBASH-Entkopplung publiziert worden.
A
5β 1β/2β 1β/2β5β 1β/2β1β/2β 5β
5β
B
C D
Abbildung 4.3.3: Ausschnitte aus (A) einemF1-PEPSIE-TOCSY-Spektrum, (B) einemF 1-Zangger-Sterk-TOCSY-Spektrum, (C) einem F1-PEPSIE-EASY-ROESY-Spektrum und (D) einem F 1-PEPSIE-CLIP-COSY-Spektrum aufgenommen von dem Oligoharnstoff. InF1 ist jeweils der spektrale Bereich derα2−,γ1−undγ2−Protonen gezeigt, inF2 umfasst der
Aus-α − β−Protonen.
In Abbildung 4.3.3 werden Ausschnitte aus einem 2D TOCSY (A), 2D EASY-ROESY (C) und einem 2D CLIP-COSY (D) jeweils mit PEPSIE-Entkopplung in F1 gezeigt, wobei sich die Diskussion auf den besonders herausfordernden Signalcluster im Bereich von 2,4 ppm bis 3,2 ppm in der indirekten Dimen-sionF1 fokussiert. Das in (A) gezeigteF1-PEPSIE-TOCSY ist zur Zuordnung der Protonensignale zu einer jeweiligen Harnstoffbaueinheit genutzt worden. Die exemplarisch herausgeschnittenen Spalten zeigen scharfe Singuletts anstelle der komplizierten Multiplettstrukturen. Die homonukleare Entkopplung ermöglicht eine ausreichende Separation der Kreuzpeaks in der indirekten Dimension und erlaubt die Zuordnung. In dem in (B) zum Vergleich gezeigtenF1-Zangger-Sterk-TOCSY wird wegen der stark gekoppeltenγ−Protonen in diesem spektralen Bereich keine vollständige homonukleare Entkopplung erreicht. Dadurch ist eine präzise Zuordnung der Protonensignale einer Harnstoffbaueinheit nur ein-geschränkt möglich. Eines der Protonensignale in der rechten herausgeschnittenen Spalte ähnelt in seiner Form einem Triplett. Durch dasF1-PEPSIE-TOCSY ließ sich jedoch feststellen, dass es sich hier um die zwei sehr stark gekoppeltenγ1- undγ2-Protonen (∆νJ ≈ 1) der ersten Baueinheit handelt. In solchen derart stark gekoppelten Fällen übernimmt das in Kapitel 4.2.4 diskutierte zentrale Artefakt die dominierende Rolle.
Das Spektrum in (C) zeigt den gleichen spektralen Ausschnitt eines 2DF1-PEPSIE-EASY-ROESY. In diesem sind zunächst die intensiven Kreuzpeaks der diastereotopenα1- undα2-Protonen untereinander zu sehen.
Die weniger intensiven Kreuzpeaks gehören zu NOE-Kontakten zwischen den Protonen nα1 →nγ1, nβ →nγ1/γ2sowie (n+2)β →nα2. Erstere ergeben eine qualitative Vorstellung, wie die Seitenkette innerhalb einer Baueinheit relativ zumbackboneorientiert ist. Die (n+2)β →nα2 NOE-Kontakte sind hingegen charakteristisch für die helikale Sekundärstruktur (2.5-Helix) des Oligoharnstoffs[473,474]. In (D) ist schließlich der Ausschnitt desF1-PEPSIE-CLIP-COSY-Spektrums gezeigt. Im Gegensatz zum TOCSY enthält dieses nur Kreuzpeaks zwischen Protonen, die über2J−und3J−Kopplungen verbunden sind, wodurch sich nun benachbarte Protonen zuordnen lassen. Die Präsenz einer geringeren Anzahl an Kreuzpeaks macht sich insbesondere im spektralen Bereich um 2,7 ppm bemerkbar, der jetzt nur noch die Kopplung derγ−Protonen untereinander anzeigt. Im CLIP-COSY lässt sich die relative Intensität der Kreuz- und Diagonalpeaks durch die Einstellung des Kopplungsfilters auf eine Kopplungskonstante skalieren. Je näher die tatsächliche Kopplungskonstante zwischen zwei Protonen dem eingestellten Wert kommt, desto schwächer werden die Diagonalpeaks in ihrer Intensität. Im vorliegenden Fall wurde der Kopplungsfilter auf 20 Hz optimiert, daher sind einige Diagonal-Peaks von diastereotopen Protonen nur wenig intensiv und dadurch im Spektrum in (D) nicht mehr erkennbar.
Nachfolgend sind die Publikationen sowie Ausschnitte der Supporting Information abgedruckt. Von den Zusatz-Informationen sind jeweils die Bruker Pulssequenz Codes nicht enthalten. Die vollständige Supporting Information kann unter den DOI: 10.1016/j.jmr.2017.11.001 beziehungsweise 10.1002/m-rc.4757 heruntergeladen werden. Parallel zu unseren Arbeiten hat sich die Gruppe um Ajay Verma ebenfalls mitPure ShiftAnwendungen derPerfect-EchoSequenz beschäftigt und während der Erstellung des Manuskripts und des Begutachtungsprozesses zuperfectBASH auch eine Publikation mit der gleichen Kombination beiRSC Advanceseingereicht[236].
A pure shift experiment with increased sensitivity and superior performance for strongly coupled systems
Julian Ilgen, Lukas Kaltschnee, Christina M. Thiele⇑
Clemens-Schöpf-Institut für Organische Chemie und Biochemie, Technische Universität Darmstadt, Alarich-Weiss-Straße 16, D-64287 Darmstadt, Germany
a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 22 September 2017 Revised 3 November 2017 Accepted 5 November 2017 Available online 6 November 2017
Keywords:
NMR spectroscopy Pure shift Zangger-Sterk Sensitivity Strong coupling
a b s t r a c t
Motivated by the persisting need for enhanced resolution in solution state NMR spectra, pure shift tech-niques such as Zangger-Sterk decoupling have recently attracted widespread interest. These techtech-niques for homonuclear decoupling offer enhanced resolution in one- and multidimensional proton detected experiments by simplifying multiplet structures.
In this work, a modification to the popular Zangger-Sterk technique PEPSIE (PerfectEchoPureShift ImprovedExperiment) is presented, which decouples pairs of spins even if they share the same volume element. This in turn can drastically improve the sensitivity, as compared to classical Zangger-Sterk decoupling, as larger volume elements can be used to collect the detected signal. Most interestingly, even in the presence of moderate strong coupling, the PEPSIE experiment produces clean and widely artifact free spectra. In order to better understand this – to us initially – surprising behaviour we performed analyses using numerical simulations and derived an (approximate) analytical solution from density matrix formalism. We show that this experiment is particularly suitable to study samples with strong signal clustering, a situation which can render classic Zangger-Sterk decoupling inefficient.
Ó2017 Elsevier Inc. All rights reserved.
1. Introduction
Proton-NMR spectroscopy has become an indispensable tool in structure elucidation of organic compounds with varying size, because protons are normally ubiquitous in these compounds and because of the high sensitivity of detection that can be obtained. The large number of signals normally observed, paired with comparably small signal dispersion due to the chemical shift, however, often leads to incomplete signal resolution in proton-dimensions of one- or multidimensional spectra. In the last decade, great progress was made in the development of practical and gen-erally applicable methods for homonuclear broadband decoupling with the aim to recover the extra resolution that can be gained by collapsing signal multiplet structure, a field now known as ‘‘pure shift NMR”[1–4].
The interest in ‘‘pure shift” techniques not only originates from the possibility to simplify spectra and in turn to gain resolution in 1D-1H[5–12]spectra and in 2D-experiments like DOSY[12–15], TOCSY[5,16,17], NOESY[18–20], ROESY[21,22], HSQC [23–28]
and HSQMBC[29,30]. It was also realized, that the homodecou-pling can facilitate the precise extraction of relaxation times
[31,32]and structural constraints such as J-coupling-constants [26,28,30,33–36], NOEs [20,37] and RDCs [20,25,26,28]. These applications have stimulated the development of very different techniques to generate homonuclear decoupling. Nevertheless, challenges remain to create more generally applicable and less time-consuming techniques as well as improvements in spectral quality and overall experimental sensitivity[38]. The latter is an inherent problem of most techniques delivering broadband homodecoupled spectra, as they are based on selectiveJ-refocusing elements using spin-subset selection. Manipulating the subset of spins detected at the end of an experiment (active spins) differ-ently from their surrounding coupling partners (passive spins) is a convenient way to achieve homonuclear decoupling, but nor-mally requires, that the signals of the passive spins are suppressed.
Known techniques to achieve spin subset selection are frequency selection (soft-pulse-techniques[39,40], HOBS[19,21,27]), a com-bined spatial and frequency selection (Zangger-Sterk[5]), isotopic filtering (BIRD[6,11]) or statistical selection (anti-z-COSY [41], PSYCHE[10]).
In the technique proposed by Zangger and Sterk, on which our method is based, detection of the individual signals (active spins) occurs in different thin volume fractions (z-slices). This is achieved by a combined application of a frequency selective 180°pulse with a weak magnetic field z-gradient. The sensitivity of Zangger-Sterk
https://doi.org/10.1016/j.jmr.2017.11.001 1090-7807/Ó2017 Elsevier Inc. All rights reserved.
⇑Corresponding author.
E-mail address:cthiele@thielelab.de(C.M. Thiele).
Journal of Magnetic Resonance 286 (2018) 18–29
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Journal of Magnetic Resonance
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / j m r
decoupling techniques as well as the spectral quality that can be achieved are critically dependent on how easy it is to fully separate the signals of coupled spins in the spatial dimension. This, in turn, is substantially governed by how close coupled signals are in the spectra. Subsequently the thickness of the individual slices deter-mines the accessible sensitivity. In the case of weak coupling, Zangger-Sterk decoupling can be very effective when large chemi-cal shift differences allow the use of short and less selective 180°-pulses, providing comparably thick slices. With decreasing chemi-cal shift differences of coupled proton pairs, long and highly selec-tive refocusing pulses are necessary and the technique becomes less efficient, ultimately failing for strong coupling because of low sensitivity.
To achieve sensitivity improvement per time unit, rapid repeti-tion techniques were used in Zangger-Sterk experiments using sequential slice selection [42] or ASAP [43]. Alternatively, multiple-slice-selection by the application of multiple frequency modulated refocusing pulses[36,44]provides an elegant solution.
This allows improvements of the overall sensitivity accumulating signal not from one, but rather from many thin z-slices. This approach counteracts the sensitivity loss normally inevitable in Zangger-Sterk when facing small minimal frequency separations between coupled spins, even when using excessively long selective pulses (>100 ms). For systems with slow transverse relaxation, high quality spectra are obtained even when dealing with consid-erable strong coupling.
Alternatively, for homonuclear decoupling of strongly coupled systems, techniques based on BIRD[6,7,11]can be used. In BIRD decoupling, the sensitivity is governed by the abundance of a heteronucleus, which should be less abundant and is usually the natural abundance of13C or15N. Further, BIRD itself is not able to decouple diastereotopic methylene protons, unless modified [25,26]. A promising recent approach is the PSYCHE[10]method and its further development TSE-PSYCHE[35], in particular when dealing with strongly coupled systems. Unfortunately, also with this technique compromises are needed between sensitivity and homodecoupling effectiveness.
The approach we are presenting herein, to achieve homonuclear decoupling even in strongly coupled systems, overcomes the inability of the Zangger-Sterk method to handle small frequency differences. In our proposed PEPSIE (Perfect Echo Pure Shift ImprovedExperiment), we reduce the inherent sensitivity penalty of Zangger-Sterk based homonuclear decoupling experiments by allowing pairs of coupled spins to occupy each particular sample slice. This is achieved by a combined use of the Zangger-Sterk selective inversion element and the perfect echo experiment, pro-posed by Takegoshi[45](Fig. 1(a)). By decoupling two coupled pro-tons in one slice via a perfect echo block, we redefine the condition for successful homonuclear decoupling using a Zangger-Sterk ele-ment. In the classic Zangger-Sterk experiment, the closest coupled spin pair defines the thickness of the z-slices and the overall acces-sible sensitivity. In contrast, our proposed PEPSIE modification does not require this spatial separation in different z-slices, thus allowing for the application of higher bandwidths. Nevertheless, the achievable sensitivity is defined by the closest three coupled protons. The choice for higher bandwidths results in size-increased volume fractions for signal detection and higher overall sensitivity without compromising spectral quality. In addition to the sensitivity gain that can be achieved, the novel pure shift experiment allows for the use of Zangger-Sterk decoupling in case of strongly coupled systems. The additional homonuclear decou-pling via the perfect echo providing these features, requires the use of longer pulse sequences, which lead to a doubling of the apparent linewidth in the homonuclear decoupled dimension. In practise, however, this line broadening is often hidden by the lim-ited digital resolution that is normally used in the indirect
dimen-sion of interferogram-based pseudo-nD (homonuclear decoupling in the direct dimension) or in the indirect spectral dimension of 2D data sets.
In this work, we demonstrate the superior behaviour concern-ing sensitivity and the ability of full decouplconcern-ing by usconcern-ing PEPSIE to obtain pure shift spectra of substances containing proton pairs with small frequency differences. In addition, we investigate the behaviour with increasing degree of strong coupling. The simplifi-cations for weakly coupled protons cannot be translated straight-forwardly to the strongly coupled case. Surprisingly, we obtained spectra of unexpected high quality and minor appearance of so-called strong coupling artifacts. For a deeper understanding towards the factors governing spectra of such strongly coupled regimes, we utilized simulations and theoretical calculations.
These confirm our experimental results.
2. Description of the experiment and working principle In a weakly coupled two spin-1/2 system with equal initial magnetization, the perfect echo building block (Fig. 1(a)) delivers a state without any chemical shift and homonuclear scalar cou-pling evolution at time point 4s, which is indeed indistinguishable from that after excitation, except for relaxation effects, pulse imperfections or chemical exchange[45,46]. This special charac-teristic led recently - after 20 years of neglect - to widespread applications in the measurements of transversal relaxation [47,48], solvent suppression[49–51], experiments for measuring diffusion [52,53], INEPT polarisation transfer [54,55], zero-quantum coherence suppression[56]and in-phase COSY transfer [57]. In addition, the removal of coupling effects makes the perfect echo attractive for pure shift applications. This is exploited here for the removal of terms arising from residualJ-coupling in one partic-ular z-slice. The key point to remove those antiphase terms is the 90°pulse separating the two spin-echoes.
This is shown below in a short product operator analysis for a weakly homonuclear coupled two spin system, consisting of spins I and S (a more detailed analysis can be found in theSupporting Information, chapter 1). Evolution during the first spin echo gener-ates anti-phase coherences via scalar coupling:
ðIyþSyÞ!2pJISsIzSz;pðIxþSxÞ;2pJISsIzSzcosð2
pJISsÞðIyþSyÞ 2 sinð2pJISsÞðIxSzþIzSxÞ Then, a 90°pulse with y-phase is applied, which exchanges the I and S antiphase terms:
!
p
2ðIyþSyÞ
cosð2pJISsÞðIyþSyÞ þ2 sinð2pJISsÞðIzSxþIxSzÞ The antiphase terms with reversed sense from the first spin-echo are then cancelled out by the antiphase terms arising in the following second echo:
!2pJISsIzSz;pðIxþSxÞ;2pJISsIzSz I
y½cos2ð2pJISsÞ þsin2ð2pJISsÞ þ2IxSz½cosð2pJISsÞsinð2pJISsÞ sinð2pJISsÞcosð2pJISsÞ þ2IzSx½cosð2pJISsÞsinð2pJISsÞ sinð2pJISsÞcosð2pJISsÞ Sy½cos2ð2pJISsÞ þsin2ð2pJISsÞ
¼ ðIyþSyÞ
This restores the initial state, lacking coupling terms.
When going to more complex spin systems this principle breaks down and only partial removal of scalar coupling is possible. How-ever, there are two possible workarounds. With repetitive applica-tion of the echo, using short evoluapplica-tion timesswith respect to1/J,
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removal of net coupling evolution is achievable, even in larger spin systems and in cases of strong coupling[47,58]. Alternatively, a J-refocusing element designed for partialJ-refocusing can be incor-porated into the basic perfect echo. Their combined application then allows for full coupling removal also for longersvalues, if theJ-refocusing element simplifies net coupling evolution to that of an apparent two-spin-1/2 system. This concept was first used in the perfect BIRD approach[25]to overcome the inability of BIRD to decouple diastereotopic methylene protons. A similar approach with an analogous incorporation of Zangger-Sterk elements is pro-posed in this work. The hard 180°pulses in both spin-echoes of the basic perfect echo experiment are replaced by Zangger-Sterk ele-ments as shown inFig. 1(b).
This combination of homodecoupling methods is chosen to complement Zangger-Sterk decoupling with an additional pling effect, acting in the exact case, where Zangger-Sterk decou-pling has its weakness: Namely, when homodecoudecou-pling of spins with small chemical shift separations is sought. The benefit is that the bandwidth of the Zangger-Sterk element can be chosen in such a way, that more than one coupled proton is inverted by the pulse’s bandwidth. Thus, ideally, the first spin echo in the proposed exper-iment breaks down the coherence evolution in multi-spin systems into that of many apparent one- or two-spin-1/2 systems with a maximum of one coupled spin pair within each particular z-slice.
Hence only antiphase terms arising from mutual couplings of any spin pairs in each selected z-slice are present before the central 90°pulse (time point II), while both the chemical shift and cou-pling evolution due to all other coucou-pling partners is refocused.
After exchange of the remaining antiphase terms by the 90°pulse, they are cancelled subsequently by the antiphase terms evolving during the second spin-echo. Thus, no terms of coupling evolution are left at time point IV. To avoid evolution of couplings to protons in other sample slices during the second spin echo, the second spin echo must contain a Zangger-Sterk element with the same band-width. The central placement of the Zangger-Sterk elements within the echo is recommended, to refocus all couplings to protons in
other slices. However, the principle described only works, if no more than two coupled spins-1/2 resonate within the bandwidth of the Zangger-Sterk elements, since the perfect echo achieves complete removal of coupling effects only in systems with two coupled spins.
Finally, to get a homonuclear decoupled proton spectrum, the above-described building block has to be inserted into the indirect dimension of a multi-dimensional experiment, or is has to be com-bined with the interferogram-based acquisition mode, in which the whole FID is consecutively sampled in short data-chunks with negligible coupling evolution. Here, the overall timing is aligned to get coupling refocusing at the middle of each data-chunk. This demands the same duration of both spin-echoes (time point I–II and II–IV, respectively). In the second spin echo an additional hard 180°pulse is inserted, to restore the chemical shift evolution sup-pressed by the selective 180°pulse. This timing is adapted from the modified Zangger-Sterk experiment by Nilsson and Morris[13].
Overall, we get a pure shift experiment, which allows for the parallel decoupling of two coupled protons within one particular sample slice. As a result, the PEPSIE experiment hence largely circumvents the problems that arise in experiments with classical Zangger-Sterk decoupling, when dealing with small frequency differences.
3. Experimental
3.1. Sample preparation
For obtaining the strychnine spectra, a 267 mM degassed and sealed sample of strychnine in CDCl3was used.
The 2,3-dibromothiophene sample was prepared by dissolving 155 mg 2,3-dibromothiophene in a mixture of 668 mg C6D6and 472 mg CDCl3. 0.003 mmol Cr(acac)3 were added to reduce T1-relaxation times. The sample was degassed by the freeze-pump-thaw method and sealed under vacuum.
The oligourea sample consisted of 1.6 mg of the oligourea dis-solved in 603 mg pyridine-d5and contains a trace of water. The Fig. 1.Pulse sequence schemes for (a) perfect echo proposed by Takegoshi and (b) 1D-PEPSIE (Perfect Echo Pure Shift Improved Experiment) via substitution of the hard 180° pulses by Zangger-Sterk elements. Narrow and wide rectangles represent hard 90°and 180°pulses, respectively. Selective pulses are indicated by grey shapes. The gradients G1and G3are used for coherence selection and a gradient amplitude ratio of 35: 90 can be used. The optimum choice for the slice-selection gradient G2varies amongst possible applications, but usually is in the range of 0–0.01 T m1. An interferogram-based acquisition is used and the duration of the data chunks is equal to twice thet1
increment (2SW1)1in the homodecoupling dimension. The delaysd1throughd4ared1=(2SW1)1+p16+ 2d16,d2=(4SW1)1,d3=(4SW1)1+p16+2d16andd4= p16+2d16, wherep16is the length of the gradient andd16is a recovery delay. Scalar coupling refocusing is achieved at time point IV, while chemical shifts are refocused at III of the firstt1
increment. Phase cycling:U1= xx,U2= y,U3= y yyy andUrec= x –x for the perfect echo in (a) andU1= x,U2= y yxxyy x x,U3= yy,U4=U5= x and Urec=xx x x for the PEPSIE experiment in (b).
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