Mit der Wilhelmy Plate Methode wurde die Insertion von GlpD zwischen die Kohlenwasser-stoffketten von Lipiden gemessen. Gereinigtes GlpD wurde bei einem Anfangsdruck von 27 mN/m unter einen Lipid-Monolayer injiziert, der aus einem Phospholipid-Extrakt von E. coli (TLE) bestand. Der zeitliche Verlauf der Druckänderung wurde bis zum Erreichen eines konstanten Endwertes protokolliert (Abb. 13). 40 Minuten nach der Injektion von GlpD wurde eine Druckänderung von 5 mN/m gemessen. Eine signifikante Druckänderung wird nur bei Substanzen beobachtet, die zwischen den polaren Kopfgruppen bis in die Kohlen-wasserstoffkettenregion der Lipide eindringen (Demel, 1994). Eine bloße Bindung an die polaren Kopfgruppen der Lipide bewirkt dagegen keine signifikante Druckänderung (Mayer et al., 1983). Dieses Ergebnis kann folglich als effiziente Insertion von GlpD in Lipid-schichten interpretiert werden. Ferner zeigt dieses Experiment, dass eine direkte
Ergebnisse
Lipid-Interaktion zwischen GlpD und E. coli Phospholipiden stattfindet.
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Abbildung 13: Interaktion zwischen GlpD und TLE-Monolayer. Nach Injektion von 3 µg GlpD unter einen TLE-Monolayer mit einem initialen Oberflächendruck von 27 mN/m wurde die Druckänderung über die Zeit verfolgt.
Lipidspezifität der Insertion von GlpD
Experimente mit reinen Phospholipid-Monolayern geben Aufschluss darüber, ob die Inser-tion von GlpD von bestimmten Lipidtypen abhängt. Um den Einfluss verschiedener Lipid-Kopfgruppen zu testen, wurden artifizielle Phospholipide mit derselben Fettsäurezusammen-setzung und unterschiedlichen Kopfgruppen eingesetzt.
Abbildung 14: Vergleich von Insertionsprofilen bei unterschiedlichen Monolayern. Es wurden Monolayer aus reinem DOPE, DOPG bzw. Rinderherz-Cardiolipin (CL) auf eine Pufferoberfläche mit einem
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Ergebnisse
Abbildung 14 zeigt, dass GlpD eine dreifach höhere Druckänderung in CL-Monolayern und eine 2.2-fach höhere Druckänderung in DOPG-Monolayern als in DOPE-Monolayern bewirkt. Folglich inserierten mehr GlpD-Moleküle in anionische Phospholipide als in zwitterionische.
Um die penetrative Kraft von GlpD zu untersuchen, wurde in Abhängigkeit des Anfangsdrucks die Insertion von GlpD in DOPE-, DOPC-, DOPG- und CL-Monolayern gemessen. Ein höherer Anfangsdruck korreliert mit einer dichteren Packung der Lipide und einer reduzierten Insertion von Proteinen (Demel, 1994).
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Abbildung 15: Penetrative Kraft von GlpD bei unterschiedlichen Monolayern. Die Druckänderung nach Injektion von GlpD wurde als Funktion des Anfangsdruckes gemessen. Monolayer aus DOPC (offene Raute), DOPE (offenes Dreieck), DOPG (gefüllter Kreis) und Cardiolipin aus Rinderherz (gefülltes Quadrat) wurden eingesetzt.
Abbildung 15 zeigt, dass bei allen vier Lipiden eine deutliche Druckänderung bewirkt wird. Unabhängig vom Anfangsdruck induzierte GlpD bei negativ geladenen Monolayern aus DOPG bzw. Cardiolipin eine deutlich höhere Druckänderung als bei den ungeladenen Monolayern aus DOPC bzw. DOPE (Abb. 15). Folglich inseriert GlpD in anionische Lipide stärker als in ungeladene. Ein Maß für die penetrative Kraft eines Proteins ist der maximale Initialdruck πmax, nämlich der höchstmögliche Anfangsdruck, bei dem das Protein eine Druckänderung bewirkt. Der maximale Anfangsdruck für CL wurde mit 38.5 mN/m, für DOPG mit 37 mN/m, für DOPE mit 33.5 mN/m und für DOPC mit 30 mN/m extrapoliert.
Obwohl sowohl DOPE als auch DOPC zwitterionische Lipide sind, ist die penetrative Kraft
Ergebnisse
von GlpD bei DOPE-Monolayern deutlich stärker als bei DOPC-Monolayern. Da PC in Bakterien nicht vorkommt, PE dagegen 70% der Phospholipide ausmacht, könnte die beobachtete Diskrepanz auf der Lipidspezifität von GlpD beruhen.
Monolayer-Experimente, die bei hohen Anfangsdrücken durchgeführt werden, sind ein verlässliches Modellsystem, um Proteininsertion zu untersuchen (Übersicht in Demel, 1994). Für biologische Membranen liegt der Druck zwischen 31-35 mN/m (Demel et al., 1975). Werden in vitro in diesem physiologisch relevanten Bereich Druckänderungen durch ein Protein induziert, so lässt dies darauf schließen, dass es auch in vivo die jeweiligen Lipid-schichten penetriert.
Insertion von GlpD in gemischte Phospholipid-Monolayer
Um zu testen, ob anionische Lipide die Membraninsertion von GlpD begünstigen, wurden Experimente mit gemischten Phospholipiden durchgeführt.
Bei einem konstanten Anfangsdruck von 30 mN/m wurde die induzierte Druck-änderung von GlpD in DOPE-Monolayern mit unterschiedlichem DOPG-Gehalt gemessen.
Abbildung 16 demonstriert eine lineare Abhängigkeit zwischen dem DOPG-Gehalt und der Druckdifferenz. Je größer der Anteil an anionischen DOPG war, desto stärkere Druck-änderungen wurden gemessen. Insertion von GlpD findet folglich verstärkt in Anwesenheit von anionischen Lipiden statt.
0 1 2 3 4 5 6
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 00
m ole % D OPG
surface pressure increase (mN/m)
Abbildung 16: Insertion von GlpD als Funktion des prozentualen DOPG-Anteils in einem DOPE-Monolayer. GlpD wurde unter gemischte Monolayer aus DOPE und DOPG bei einem Anfangsdruck von 30 mN/m injiziert.
Ergebnisse
Insertion von GlpD und Punktmutanten in TLE-Monolayer
Apolipoproteine binden Phospholipide, indem sie eine basisch amphiphile α-Helix exponieren (Segrest et al., 1992; Segrest et al., 1998). Die Helical-Wheel-Projektion der Aminosäuren 355-70 ähnelt den helicalen Strukturen von Apolipoprotein A Klasse I-Molekülen. Bei beiden Helices taucht an den Übergängen zwischen hydrophober und hydrophiler Hälfte jeweils eine negativ geladene Aminosäure auf (Abb. 11).
Um zu testen, ob die α-Helix, die an die CaM-Oberfläche bindet, an der Membran-insertion beteiligt ist, wurden die Punktmutanten unter TLE-Monolayer injiziert. Die jeweils induzierte Druckänderung wurde mit der des Wildtyps verglichen.
Abbildung 17A vergleicht den zeitlichen Verlauf der Druckänderung, nachdem Wildtyp- bzw. mutiertes GlpD injiziert wurde. Sowohl die Kinetik als auch die maximale Druckänderung unterscheiden sich deutlich. Betrachtet man die Druckänderung in Abhängigkeit des Anfangsdrucks (Abb. 17B) wird klar, dass unabhängig vom Anfangsdruck die Insertionskraft der Punktmutanten deutlich geringer ist als die des Wildtyps. Die geringste Penetrationskraft wurde bei den Punktmutanten R359E (πi= 31.3 mN/m) und K360E (πi=30.2) beobachtet. Die Doppelmutante AH362/4DE ist im Vergleich zum Wildtyp bezüglich ihrer Fähigkeit, Lipide zu penetrieren, dagegen nur geringfügig geschwächt (πi=33.0). Diese Experimente bestätigen die These, dass die basisch amphiphile α-Helix für die Protein-Lipid-Bindung entscheidend ist.
Abbildung 17: Insertion von Wildtyp- und mutiertem GlpD in TLE-Monolayer A: Zeitverlauf der Insertion von Wildtyp- und mutierten GlpD-Proteinen in TLE-Monolayer mit einem Oberflächendruck von 27 mN/m. B:
Insertion von Wildtyp und mutierten Proteinen in TLE-Monolayer als Funktion des initialen Oberflächendruck.
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Ergebnisse
Insertion von wt-GlpD und Punktmutanten in PG- bzw. PE-Monolayer
Aufgrund der bisherigen Datenlage wird vermutet, dass die basisch amphiphile α-Helix von GlpD anionische Phospholipide penetriert. Diese These wurde mit folgenden Experimenten geprüft.
DOPG- bzw. DOPE-Monolayer wurden mit unterschiedlichem Anfangsdruck auf die Pufferoberfläche gesprüht. Nach Injektion von Wildtyp-GlpD bzw. Punktmutanten-GlpD wurde die induzierte Druckänderung gemessen und verglichen. Abbildung 18 stellt die gemessenen Druckdifferenzen als Funktion des Anfangsdrucks dar. Im Vergleich zum Wildtyp ist die penetrative Kraft der Punktmutanten in DOPG-Monolayer deutlich geringer (Abb. 18A). Dagegen ergaben Messungen mit DOPE-Monolayern keine signifikanten Unter-schiede zwischen Wildtyp und den Mutanten (Abb. 18B). Dies beweist, dass die α-Helix an der Insertion in anionische Phospholipide beteiligt ist.
Vergleicht man die maximalen Initialdrucke πmax der einzelnen Mutanten, so zeigt die Doppelmutante AH362/4DE (πmax=35.5 mN/m) das größte Potential, in DOPG-Monolayer zu inserieren. Die beiden Mutanten R359E und K360E sind bei einem Anfangsdruck von 31.5 mN/m nicht mehr fähig, eine Druckänderung zu bewirken. Folglich ist bei der Insertion in Lipide weniger die Nettoladung der Helix als vielmehr die Ladungsverteilung in diesem Bereich ausschlaggebend.
A B
Abbildung 18: Lipidspezifische Insertion von wt-GlpD und Punktmutanten. Die Änderung des Oberflächendrucks nach Injektion von Wildtyp- (offene Raute), AH362/4DE (gefülltes Quadrat), R359E (gefülltes Dreieck) und K360E (gefüllter Kreis) unter A: DOPG-Monolayer bzw. B: DOPE-Monolayern ist als Funktion des initialen Oberflächendrucks dargestellt.
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