Die Ergebnisse der Monolayer-Experimente zeigen, dass GlpD Domänen ausbildet, die sich zwischen die Phospholipide einlagern. Monolayer, die bei hohen Initialdrücken eingesetzt werden, sind ein verlässliches Instrument, die partielle Insertion von Proteinen zu analysieren, da die Packungsdichte der Phospholipide, wie sie in der Erythrozyten-Membran ermittelt wurden, einem Initialdruck von 31 bis 35 mN/m im Monolayer-System entspricht (Demel et al., 1975).
Der maximale Initialdruck πmax bei dem eine Insertion des Proteins stattfindet, ist ein Maß für die Penetrationskraft eines Proteins. Der Befund, dass GlpD selbst bei Initialdrücken im physiologisch interessanten Bereich in TLE-Monolayer (πmax = 34,2 mN/m) inseriert, deutet an, dass GlpD in vivo die cytoplasmatische Membran penetriert.
Um zu untersuchen, welche Phospholipide das Eintauchen von GlpD in Lipid-Monolayern begünstigen, wurden Experimente mit Monolayern durchgeführt, die aus artifiziellen Phospholipiden bestanden (DOPE, DOPC, DOPG). Da sich diese Lipide lediglich bezüglich ihrer Kopfgruppe und nicht bezüglich ihrer Fettsäurezusammensetzung unterscheiden, wurde somit der Einfluss der polaren Kopfgruppe auf die Insertion untersucht. Es zeigte sich, dass GlpD bevorzugt in negativ geladene Phospholipide inseriert. Die Maximaldrücke für
Diskussion
geladenen Phospholipiden bei gemischten Monolayern positiv korreliert (Abbildung 16), unterstreicht den fördernden Einfluss negativ geladener Lipide auf die Penetrationskraft von GlpD.
Die beobachtete Diskrepanz zwischen Insertion in DOPE und in DOPC lässt auf die Spezifität der GlpD-PE-Interaktion schließen. Möglicherweise sind nicht nur elektrostatische Wechselwirkungen, sondern auch eine spezifische Interaktion aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen den PE-Kopfgruppen und GlpD für die Penetration in Monolayer entscheidend. Denn erstens kann PE, das im Gegensatz zu PC ein ionisierbares Amin aufweist, Wasserstoffbrücken ausbilden (Dowhan, 1997). Der zweite wichtige Unter-schied zwischen PE und PC besteht darin, dass PE zu der Gruppe der Nicht-Bilayer-Lipide gehört und dies entscheidend für die Beschaffenheit der Membranstruktur ist. PE-enthaltende Membranen weisen aufgrund der kleinen PE-Kopfgruppe im Membran-Cytoplasma-Grenz-bereich eine geringere Packungsdichte auf als im Inneren der Membran (vgl. Abb. 3). Nicht-Bilayer-Lipide tendieren folglich dazu, Aggregate mit einer konkaven Oberflächenstruktur zu bilden (Abb. 27A). Werden diese Lipide in eine Bilayerstruktur „gezwängt“, dann werden die hydrophoben Lipidschwänze zusammengedrückt, so dass die Kopfgruppen voneinander getrennt werden (Abb. 27B). Dieser Zustand wird als „frustrated bilayer“ bezeichnet (De Kruijff, 1997a; Gruner, 1985). Die dadurch entstehenden Lücken zwischen den Kopfgruppen ermöglichen eine partielle Penetration von Proteinen (Van Den Brink-Van Der Laan et al., 2001).
Abbildung 27: A: PE-Monolayer; B: PE in „frustrated bilayer“-Struktur (Van Voorst und De Kruijff, 2000)
Insertion erfolgt durch basisch amphiphile αααα-Helix
Mit welchen Domänen dringt GlpD in die Lipid-Monolayer ein? Im Gegensatz zu integralen Membranproteinen bilden periphere Membranproteine keine transmembranen Domänen aus.
Diskussion
Einige sind dennoch in der Lage, entweder durch α-helicale Domänen oder durch Schleifen die cytoplasmatische Seite der Doppelmembran zu penetrieren. In jüngster Zeit wurden einige Proteine beschrieben, die über α-helicale Domänen an die cytoplasmatische Membran binden, darunter das bei der Chromosomen-Replikation in E. coli beteiligte Enzym DnaA (Garner und Crooke, 1996), das in der Katabolitrepression beteiligte E. coli Enzym IIAGlc (Wang et al., 2000), sowie RGS4 (Regulator of G protein signaling), ein die G-Proteinaktivität regulierendes Säugerenzym (Bernstein et al., 2000).
Mit Hilfe von Sekundärstrukturvorhersagen konnte eine basisch amphiphile α-Helix im Bereich der Aminosäuren 355-370 ermittelt werden. Biophysikalische Studien zeigen, dass von allen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin die höchste Affinität für die sogenannte Interface-Region haben, also den Übergangsbereich zwischen polarer und unpolarer Umgebung (Wimley und White, 1996). Da ein Tyrosinrest in der vorhergesagten Struktur liegt, gilt eine Orientierung der helicalen Struktur im Membran-Cytoplasma-Grenzbereich als wahrscheinlich.
Mutationen in GlpD, welche die ursprünglich positive Nettoladung der Helix in eine negative Ladung umwandelten, führten zu einer verminderten Penetrationsfähigkeit von GlpD in TLE-Monolayer. Elektrostatische Wechselwirkungen sind also für die Membraninsertion essentiell.
Obwohl die Nettoladung der Helix bei allen Mutanten unter physiologischen Bedingungen –1 betrug, wurden deutliche Unterschiede in ihrer Penetrationskraft festgestellt.
Während die Mutanten R359E und K360E unter physiologisch relevanten Drücken nicht mehr in der Lage waren, TLE-Monolayer zu penetrieren, inserierte die AH362/4DE-Mutante unter physiologischen Druckbedingungen und verhielt sich damit eher wie Wildtyp-GlpD.
Vergleicht man das Insertionspotential der Mutanten in anionische Lipidmonolayer, so wird der Unterschied noch deutlicher. Die Insertionskraft der Doppelmutante ist im Gegensatz zur penetrativen Kraft des Wildtyp-GlpD deutlich reduziert, liegt aber im Gegensatz zu den R359E- bzw. K360E-Mutanten immer noch deutlich im physiologisch relevanten Bereich.
Keine Unterschiede zwischen Wildtyp-GlpD und den Mutanten wurden dagegen bei der Insertion in zwitterionische Lipidmonolayer beobachtet. Folglich ist die α-helicale Struktur in ihrer basisch-amphiphilen Ausprägung für die Insertion in anionische Lipidschichten essentiell.
Diskussion
1 kcal/mol Energie für die Membranassoziation zur Verfügung steht. Folglich ist die Anzahl der basischen Reste für eine energetisch günstige Insertion entscheidend. Damit kann aller-dings nur erklärt werden, dass eliminierte basische Reste im helicalen Bereich dazu führen, dass die Penetrationskraft der Mutanten geringer ist als die des Wildtyps.
Was ist jedoch die Ursache für die unterschiedliche Penetrationseffizienz der einzelnen Mutanten? Zwar ist die Nettoladung im α-helicalen Bereich unter physiologischen Bedingungen bei allen Mutanten gleich, allerdings unterscheiden sich die Mutanten in der Anordnung elektronegativer Reste. Während die hydrophile Seite der α-Helix bei der Doppelmutante statt des ursprünglich positiven Ladungsüberschusses neutral ist, präsentieren die R359E- bzw. K360E-Mutanten eine elektronegativ geladene hydrophile Seite.
Dies führt zu folgendem Modell: Gelangt Wildtyp-GlpD in die Nähe von anionischen Phospholipiden, so wird die elektropositiv geladene Helix exponiert. Positive Ladungen im hydrophilien Bereich interagieren dabei mit den elektronegativen Lipid-Kopfgruppen. Bei der AH362/4DE-Mutante begünstigt vermutlich das Dipol-Moment der Membran die Präsen-tation der amphiphilen Helix. Die elektrostatische Anziehung ist zwar deutlich geringer, jedoch offensichtlich immer noch ausreichend, um eine Adsorption zu ermöglichen. Da die negativen Reste im hydrophoben Bereich lokalisiert sind, kommen sie möglicherweise nicht mit den polaren Kopfgruppen direkt in Kontakt. Lediglich hydrophobe Wechselwirkungen begünstigen das Eintauchen der Helix in die Membran.
Dagegen überwiegt bei den R359E- und K360E Mutanten die elektrostatische Abstoßung zwischen den negativen Resten auf der hydrophilen Seite und den anionischen Lipid-Kopfgruppen, so dass keine Adsorption im Grenzbereich stattfinden kann. Folglich kann die amphiphile Helix nicht in den hydrophoben Bereich der Membran eindringen.