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Membran ist für diese stabile Verankerung nicht ausreichend, das Eintauchen von Protein-domänen in die cytoplasmatische Membran bewirkt dagegen eine stabile GlpD-Membran-Anheftung. Aufgrund der enormen Penetrationskraft von GlpD in anionische Monolayer wird vermutet, dass in vivo die Membraninsertion für die Lokalisation an der cytoplasmatischen Membran eine zentrale Rolle spielt. Einige Befunde sprechen dafür, dass GlpD in vivo über Insertion in PG oder CL an die Membran verankert ist: Es wurde gezeigt, dass es nur eine begrenzte Zahl an GlpD-Bindestellen an der Membran gibt (Kung und Henning, 1972). Aus der Beobachtung, dass GlpD mit der an anionische Lipide bindenden D-Lactat-Dehydrogenase um dieselben Bindungsstellen kompetiert (Dym et al., 2000; Kung und Henning, 1972), wird gefolgert, dass die Membrananheftung von GlpD in vivo an Membran-domänen mit anionischen Lipiden erfolgt.
Auf Grundlage der hier präsentierten Daten wird postuliert, dass lösliches GlpD zufällig an die Membran bindet und in Anwesenheit von anionischen Phospholipiden eine basisch amphiphile α-Helix ausbildet. Diese α-Helix ist in der Lage, mit den polaren Kopfgruppen anionischer Lipide zu interagieren und zwischen die Kohlenwasserstoffketten der Phospholipide zu inserieren. Das tiefe Eintauchen der helicalen Domäne von GlpD sorgt für eine stabile Verankerung des Proteins an Membranbereiche, die einen hohen Anteil negativ geladener Phospholipide aufweisen.
Norris und Fishov postulieren, dass in E. coli Mikrodomänen ausgebildet werden, die zentrale Vorgänge, wie die bakterielle Zellteilung, regulieren (Norris und Fishov, 2001).
Mikrodomänen, die mit anionischen Lipiden angereichert sind und Proteincluster enthalten, wurden in E. coli beobachtet (Fishov und Woldringh, 1999; Mileykovskaya und Dowhan, 2000). Um in vivo Lipide in der Zellmembran sichtbar machen zu können, markierten Fishov und Woldringh E. coli-Zellen mit einem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff. Sie beobachteten eine inhomogene Fluoreszenzmarkierung der cytoplasmatischen Membran: Zu Beginn der Zellteilung fluoreszieren die beiden Zellpole stark, während die Teilungsregion im Zellmittelpunkt nicht fluoresziert (1999). Vermutlich ist das Anfärbung der Phospholipide in dieser Region aufgrund von Protein-Clusterbildung nicht möglich. Mileykovskaya und Dowhan markierten E. coli-Zellen mit eine Cardiolipin-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff. Sie beobachteten Cardiolipin-angereicherte Domänen in der Teilungsregion und an den Zellpolen (2000). Die zentrale Bedeutung der Membraninhomogenität wird zudem durch die Ergebnisse von Experimenten mit der pss-Mutante, die keine Phosphatidylethanolamin mehr bilden kann, gestützt. Diese Mutation ist lethal, in Anwesenheit von Kationen sind die Zellen jedoch überlebensfähig. Mileykovskaya und Mitarbeiter beobachteten, dass die Zellen nicht mehr
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teilungsfähig sind (1998). Zwar bindet FtsZ noch an die Zellteilungregion, allerdings ist keine korrekte Assemblierung von FtsZ, dem Schlüsselprotein der Zellteilung, möglich, so dass kein Septum gebildet werden kann (Mileykovskaya et al., 1998).
Einige physiologische Prozesse in Bakterien wie z.B. Proteintranslokation und Chromosomenreplikation werden durch Membran-assoziierte Enzyme gesteuert, die bevorzugt mit anionischen Phospholipiden interagieren, wie SecA (Breukink et al., 1992;
Miller et al., 1998), FtsY (De Leeuw et al., 2000) und DnaA (Garner et al., 1998).
Möglicherweise finden diese energieverbrauchenden Prozesse ebenfalls an Mikrodomänen, die mit anionischen Lipiden angereichert sind, statt. Eine gezielte Lokalisation von GlpD an diese Mikrodomänen könnte dem Zweck dienen, die dort assoziierten Enzyme mit Energie zu versorgen.
αααα -Helix: generelles Membranbindemotiv bei Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenasen?
Die anaerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpABC) aus E. coli bindet über den Membrananker GlpC auf bislang unbekannte Weise an die Membran. Mittels Sekundär-strukturvorhersagen können keine transmembranen Strukturen identifiziert werden, jedoch werden im Bereich der Aminosäuren 261-279 amphiphile α-Helices vorhergesagt (Cole et al., 1988; Eisenberg, 1984). Abbildung 28 zeigt, dass die Aminosäuresequenz von GlpC im Bereich von Aminosäuren 274-288 zu 42.9% identisch mit der Membraninsertionsdomäne von GlpD ist. Da die für die Insertion essentiellen Aminosäuren R359 und K360 in GlpC konserviert sind, kann die Voraussage gemacht werden, dass sie bei der Membrananheftung von GlpC ebenfalls eine Rolle spielen.
GlpD(357-69)
YRKLAEHALEKLTP
GlpC(275-288)
WRKLDEGKTLPLKP
:*** * * *
Abb. 28: Homologievergleich der Aminosäuresequenzen vonGlpC mit der GlpD-Membran-Insertions-domäne. Als Kriterien für die Ähnlichkeit wurden folgende Eigenschaften der Aminosäuren zugrunde gelegt:
negativ geladen, positiv geladen, unpolar oder polar ungeladen (* = identische Aminosäure; : =homologer Austausch, unterstrichen = α-helicale Membranbindestelle).
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Zwischen GlpD und der FAD-abhängigen Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GUT2) aus Saccharomyces cerevisiae besteht eine 31%ige Identität der Aminosäuresequenzen. GUT2 katalysiert die Oxidation von Glycerin (Larsson et al., 1993; Sprague und Cronan, 1977) und ist zwischen der inneren und der äußeren Mitochondrien-Membran lokalisiert, wobei der Mechanismus der Membranverankerung noch nicht geklärt ist. GUT2 ist eine Komponente des Glycerin-3-Phosphat-Shuttle und überträgt die Reduktionsequivalente von cytosolischem NADH über die Membran zur mitochondrialen Atmungskette (Larsson et al., 1998;
Overkamp et al., 2000). Aufgrund der Beobachtung, dass GUT2 durch Carbonat (Na2CO3 )-Extraktion, nicht jedoch durch 1 M NaCl von der inneren mitochondrialen Membran isoliert werden kann, wird vermutet, dass GUT2 ein peripheres Membranprotein ist, das hauptsäch-lich durch hydrophobe und weniger durch elektrostatische Wechselwirkungen mit der Membran interagiert (unveröffentliche Daten, Marjolein Janssen). Zudem wurde eine spezifische Interaktion zwischen GUT2 und PC beobachtet, wobei PC möglicherweise die Aktivität stimuliert (persönliche Mitteilung, Marjolein Janssen). Da eine hohe Überein-stimmung von GUT2 mit der α-helicalen Membraninsertionsdomäne von GlpD besteht, kann spekuliert werden, dass GUT2 ebenfalls über eine α-helicale Domäne in Membranen inseriert (Abb. 29). Sekundärstrukturvorhersageprogramme wie PHD (Rost et al., 1994) und Predator (Frishman und Argos, 1996) ermittelten für GUT2 im Bereich von Aminosäure 463-479 eine amphiphile (Eisenberg et al., 1984) α-Helix. Somit stimmen GlpD und GUT2 in dem Membran-Bindemotiv überein. Während die GlpD-Helix elektropositiv ist und damit bevor-zugt in anionische Phospholipide inseriert, ist die GUT2-Helix neutral. Dies stützt die experimentelle Beobachtung, dass GUT2 über hydrophobe Wechselwirkungen mit der Membran und insbesondere mit PC interagiert.
GlpD(353-379)
GGKLTTYRKLAEHALEKL
Gut2(461-477)
GGKWTTYRQMAEETVDKV
*** **** :** ::*:
Abb. 29: Homologievergleich der Aminosäuresequenzen vonGut2 mit der GlpD-Membran-Insertions-domäne. Als Kriterien für die Ähnlichkeit wurden folgende Eigenschaften der Aminosäuren zugrunde gelegt:
negativ geladen, positiv geladen, unpolar oder polar ungeladen (* = identische Aminosäure; : =homologer Austausch, unterstrichen = α-helicale Membranbindestelle).
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