Proben der Pansenflüssigkeit

Abb. 8 zeigt eine Übersicht zur Bearbeitung und Analytik der Pansensaftproben.

2.7.4.1. Bestimmung von pH und Redox-Potential

Direkt nach jeder Entnahme wurden in der Pansenflüssigkeit nach einer Messdauer von 30 Sekunden der pH-Wert und nach 60 Sekunden das Redoxpotential mit einem pH-Meter (Digital-pH-Meter 646, Knick GmbH & Co.KG D-14163 Berlin) und einer

pH-Elektrode (InLab^® Routine, Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen) bzw. einer Redox-Elektrode (InLab^® 501, Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen) gemessen und protokolliert. Das pH-Meter wurde einmal täglich nach der Morgenfütterung auf die pH-Werte 4,01 und 7,00 geeicht (pH-Pufferlösungen, Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen).

Abbildung 8: Präparation der Pansensaftproben

2.7.4.2. Bestimmung der Konzentration der SCFA

Die Bestimmung der Konzentrationen von Acetat, Propionat und Butyrat erfolgte gaschromatographisch nach dem von ENGELHARDT und SALLMANN (1972) beschriebenen Verfahren. Die Pansenflüssigkeit wurde im Kühlschrank bei +4°C langsam aufgetaut. Anschließend erfolgte über 20 Min. bei +4°C und 40.000 g (Rotor SM24, Sorvall^® RC-5C, Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington, USA) eine Trennung der Pansenpartikel von der flüssigen Phase. 1 ml des Überstandes wurde mit 100 µl 98 %-iger Ameisensäure versetzt, vermischt und nach zehnminütiger Inkubationszeit über 10 Min. bei +4°C und 4.000 g zentrifugiert. Von diesem Überstand wurde 1 ml in Rollrand-Ampullen (Agilent Technologies GmbH &

Co. KG, D-76337 Waldbronn) pipettiert (Research Plus^®, Eppendorf AG, D-22339 Hamburg) und luftdicht verschlossen.

Die gaschromatographische Analyse (Gaschromatograph 5890 Series II, Hewlett Packard, D-71034 Böblingen) erfolgte für die SCFA Acetat, Propionat und Butyrat.

Chromosorb (WAW 80/100 mesh) mit 20 % Neopentyl-Glycol-Succinat (NPGS) und 2 %-iger ortho-Phosphorsäure (Analyt-MTC Messtechnik, D-79379 Müllheim) dienten in einer handgestopften Glassäule (180 cm Länge, Innen-ø 2 mm) als Trennmaterial.

Durch Messung eines Standards (Merck KGaA, D-64271 Darmstadt) nach jeder zehnten Probe ergab sich die Berechnungsgrundlage für die Konzentration der SCFA [mmol/l]. Die Konfiguration des Gaschromatographen ist Tabelle 5 zu entnehmen.

Tabelle 5: Konfiguration des

Gaschromatographen für die Analyse

2.7.4.3. Bestimmung von Gesamt-Ammoniak

Die Ammoniak-Konzentration im partikelfreien Pansensaft wurde photometrisch mit einer Harnstoff/Ammoniak-Test-Kombination (Roche Diagnostics, D-68305 Mannheim) ohne vorher erfolgten Ureaseaufschluss bestimmt. Grundlage für die Bestimmung ist die Berthelot-Reaktion. Dabei reagiert in der Probe enthaltenes Ammoniak im basischen Milieu zusammen mit Hypochlorit und Phenol zu dem blauen Farbstoff Indophenol. Bei 546 nm wird die Absorption der Lösung im Photometer (DU 640, Beckman-Coulter GmbH, D-47807 Krefeld) gemessen. Durch Messung der Absorption einer definierten Standard-Lösung (NH4Cl, [5 mmol/l]), war es möglich, die Konzentrationen in den Proben zu berechnen.

2.7.4.4. Bestimmung der mikrobiellen N-Assimilation

2.7.4.4.1. CrEDTA als Flüssigkeitsmarker

Bestimmung der Chrom-Konzentrationen

Für die Konzentrationsbestimmung des Chroms im Pansensaft wurden die Proben aufgetaut und bei 40.000 g (Rotor SM24, Sorvall^® RC-5C, Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington, USA) abzentrifugiert. Der partikelfreie Überstand wurde in Plastikszintillationsgefäße überführt und bis zur weiteren Untersuchung bei -20°C eingefroren. Mithilfe eines Atomabsorptionsspektrometers (Unicam 969 AAS Solaar, Thermo Fisher Scientific, D-28199 Bremen) wurde die Konzentration von Chrom am Institut für Tierernährung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, gemessen¹. Eine Eichreihe diente als Basis für die Konzentrationsbestimmung.

1 Frau Dr. Wolf vom Institut für Tierernährung sei hier herzlich für die Durchführung der Analysen gedankt.

Berechnung des Flüssigkeitsumsatzes

Unter Nutzung des Programmes GraphPad Prism^® 4.0 für Windows (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA 92037, USA) wurden die in der partikelfreien Flüssigkeit bestimmten Cr-Konzentrationen an die Monoexponentialfunktion

" _# = ^$ × (1 − ^{&' × #} )

Yt = Cr-Konzentration (µg/ml) zum Zeitpunkt t (h)

A⁰ = Cr-Konzentration nach Erreichen des Infusionsgleichgewichtes bei t_∞ k = Ratenkostante ( x h^-1)

t = Zeitpunkt nach Beginn der Infusion (h)

angenähert (BREVES et al. 1985). Anhand der Annäherung wurden die Schätzwerte für die Ratenkonstante der partikelfreien Pansenflüssigkeit (k) und die Gleichgewichtskonzentration (A⁰) des Volumenmarkers bestimmt und auf diesen Werten basierend (I.) das Volumen der partikelfreien Flüssigkeit im Pansen (V), (II.) die Umschlagsrate der partikelfreien Flüssigkeit (U) und (III.) die mittlere Retentionszeit der partikelfreien Flüssigkeit im Pansen (R) berechnet.

(I.)

=

_,^)*_-×'^{+ (ml) (II.)}

. = ×

^{(ml/h) (III.)}

/ =

₁^{0 (h)}

Cri = Infusionsrate (µg Cr/h)

2.7.4.4.2. ¹⁵N als Marker für die mikrobielle N-Assimilation

15N wurde als Marker für die Bestimmung der mikrobiellen N-Assimilation genutzt.

Dabei wurden der intraruminal infundierten Infusionslösung 0,6 g ¹⁵NH4Cl/l (Anreicherung 98 %; Campro Scientific GmbH, D-14133 Berlin) hinzugesetzt.

Isolierung von Referenzmikroben

Gemäß der von BRANDT und ROHR (1981) beschriebenen Differentialzentrifugationsmethode wurden die Referenzmikroben aus dem Panseninhalt für die Bestimmung der ¹⁵N-Anreicherung isoliert. Die gefrorenen Proben wurden langsam bei +4°C im Kühlschrank aufgetaut und 5 Min. bei 4°C und 600 g (Rotor SS34, Sorvall^® RC-5C, Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington, USA) zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Zentrifugen-Röhrchen (Thermo Scientific, Asheville, USA) überführt, das Pellet verworfen. Über 15 Min. bei +4°C und 27.500 g wurde der Überstand erneut zentrifugiert. Der erneut entstandene Überstand wurde für die spätere ¹⁵N-Bestimmung in der partikelfreien Flüssigkeit bei -20°C eingefroren. Das Pellet wurde mit 10 ml 0,9 %iger NaCl-Lösung resuspendiert.

Es folgten zwei weitere, identische Zentrifugationsschritte mit Verwerfen des Überstands und anschließender Resuspension des Pellets. Auf diese Weise erfolgte eine weitere Aufreinigung der mikrobiellen Zellmasse. Es folgte eine letzte Zentrifugation gleicher Weise, der Überstand wurde verworfen und das verbleibende, von Futterpartikeln freie und nur mikrobielle Zellmasse enthaltende Pellet in Plexiglas-Vials überführt und gefriergetrocknet (Alpha 2-4; Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, D-37520 Osterode).

Bestimmung der ¹⁵N-Anreicherung in den Referenzmikroben

Nach der Gefriertrocknung wurde die mikrobielle Trockenmasse mit einem Glasstab fein zerkleinert und mit einer Feinwaage (Mettler ME30; Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen) 500 µg in Strontium-Kapseln (Lüdi Swiss AG, CH-9230 Flawil) eingewogen, verschlossen, in Kügelchen geformt, in Well-Platten einsortiert und mit einem Papierdeckel verschlossen. Derartig präpariert erfolgte die massenspektrometische Analyse nach der von WERNER et al. (1999) beschriebenen Weise (Isotopenmassenspektrometer: Delta C, Finnegan MAT, D-28197 Bremen; Interface: Conflo III, Thermo Fisher Scientific, D-28199 Bremen;

Elementaranlysator: NA1108, Fisons-Instruments, Rodano, Milano, Italien) an der

Fakultät für Agrarwissenschaften, Georg-August-Universität Göttingen², um den Gehalt von Gesamt-N und die Anreicherung von ¹⁵N an Gesamt-N zu bestimmen.

Die Messwerte wurden für die weitere Berechnung um die natürliche Normalanreicherung von 0,366 % ¹⁵N korrigiert.

Bestimmung der ¹⁵N-Anreicherung in der Ammoniumfraktion der partikelfreien Pansenflüssigkeit

Zunächst wurde die Ammoniakkonzentration per Dampfdestillation nach Kjeldahl bestimmt. Dieser vorbereitende Schritt war notwendig für die Messung der ¹⁵ N-Anreicherung in der Ammoniumfraktion. Dazu wurde partikelfreie Pansenflüssigkeit (Überstand nach dem ersten Zentrifugationschritt der Differentialzentrifugation zur Gewinnung der Referenzmikroben) unter Zusatz von 32 %-iger Natronlauge (Merck KgaA, D-64271 Darmstadt) dampfdestilliert. Ammoniaksalze wurden durch die Lauge in Lösung gebracht und gasförmiges NH3 freigesetzt:

(NH4)2A^-(solv) + 2 NaOH (aq) Na2A^-(aq) + 2 NH3(g) + 2 H2O (l)

Als Auffangvorlage für das Destillat diente 0,5 %-ige Borsäure. Anschließend wurde mit 0,01 N Schwefelsäure (H2SO4; Titrisol^®; Merck, D-64271 Darmstadt) auf den Ausgangs-pH-Wert der Borsäure zurücktitriert. Anhand des bei der Titration verbrauchten Volumens an H2SO4 wurde mithilfe der Standard-Lösung (NH4Cl, [5 mmol/l]) die Stickstoffkonzentration der Probe berechnet.

=( 2 ℎ 3²56^{4 Probe}− 2 ℎ 3²56^{4 Leerwert}) × [5 ]

( 2 ℎ 32564 Standard− 2 ℎ 32564 Leerwert) × ^Standard

Probe

Im Anschluss an das Kjeldahl-Verfahren wurden die Destillate bei 60°C bis zur endgültigen Trocknung (72 h) in einen Trockenschrank verbracht. Die Trockenrückstände wurden mit Aqua dest. auf eine Zielkonzentration von 400 µg

2 Herrn Langel, Fakultät für Agrarwissenschaften, Georg-August-Universität Göttingen, sei hier herzlich für die Durchführung der Analysen gedankt

N/ml verdünnt. Das dafür nötige Volumen wurde mithilfe des zuvor bestimmten N-Gehaltes berechnet. Unter Zusatz von Natriumhypobromid (NaOBr) wurde die so erstellte Lösung nach vorheriger Eichung des Emissionsspektrometers (NOI 7, Fischer Analysen Instrumente GmbH, D-04347 Leipzig. Eichproben 0,366 % bis 10,01 % ¹⁵N) zur Bestimmung der ¹⁵N-Anreicherung genutzt. Die Messwerte wurden für die weitere Berechnung um die natürliche Normalanreicherung von 0,366 % ¹⁵N korrigiert.

Berechnung der mikrobiellen Synthese

Gemäß der Methode nach NOLAN und LENG (1983) wurde die mikrobielle N-Assimilation nach folgender Formel berechnet:

N-Assimilation =

¹⁵

^N

ⁱ

^−(NH

³

^-

¹⁵15

^N N

^abs. RM

^{+ NH}

³

^-

¹⁵

^N

^abRl.

⁾

(mg/Tag)

15Ni = Infusionsrate (µg/Tag)

NH3-¹⁵Nres. = Nettoresorption von ¹⁵NH3

aus dem Pansen durch die Pansenwand (µg/Tag)

NH3-¹⁵Nabfl. = Abfluß von ¹⁵NH3 aus dem Pansen (µg/Tag)

15NRM = ¹⁵N-Anreicherung in

Referenzmikroben nach Erreichen des Infusionsgleichgewichtes

Dabei wird angenommen, dass infundiertes ¹⁵NH4Cl vollständig zu ¹⁵NH4+ und Cl -dissoziiert undgleichmäßig auf den gesamten NH3-Pool der Pansenflüssigkeit verteilt wird und nur über mikrobielle Assimilation, Resorption über die Pansenwand und Abfluß in den Blättermagen aus dem NH3-Pool entfernt wird.

Die Infusionsrate ¹⁵N_i wird aus der Konzentration von ¹⁵N (µg/l) in der Infusionsflüssigkeit und des täglich infundierten Volumens (l/Tag) berechnet. Gemäß NOLAN und LENG (1983) wurde die Nettoabsorption NH3-¹⁵Nabs. anhand der NH3 -Konzentration in der Pansenflüssigkeit in Abhängigkeit des pH-Wertes berechnet.

Aufgrund des hohen pK-Wertes von 9,21 liegt Ammoniak zum größten Teil im Pansensaft in geladener Form (NH4+) vor (BROMBERG et al. 1960).

Mittels

[NH

^{3 ungel.}

] = 1 − W

_{XY X$(Z[\],_`)}^X

a × [NH

³

]

^(mmol/l)

konnte berechnet werden, wie viel NH3 pro Liter Pansenflüssigkeit ungeladen vorlag und resorbiert wurde.

NH

³

-

¹⁵

N

^abs.

= ^[NH

^{3 ungel.}

^{] × V × m} ₁₀₀₀

^N

^{× NH}

³

^-

¹⁵

^N

(µg/Tag) V = Volumen partikelfreie

Pansenflüssigkeit

mN = Masse Stickstoff (14 g/mol)

NH3-¹⁵N. = ¹⁵N-Anreicherung im Ammoniak der partikelfreien Flüssigkeit nach

Erreichen des Infusionsgleichgewichtes

NH3-¹⁵Nabfl. wurde aus der mittleren Ammoniakkonzentration und dem Flüssigkeitsumschlage berechnet.

NH

³

-

¹⁵

N

^abRl.

⁼

^{[NH3]× U ×}₁₀₀₀ ^{mN ×}

^NH

³

^-

¹⁵

^N

^(µg/Tag)

U = Umschlagsrate partikelfreie Pansenflüssigkeit

mN = Masse Stickstoff (14 g/mol)

15NAmmon. = ¹⁵N-Anreicherung im Ammoniak der partikelfreien Flüssigkeit nach

Erreichen des Infusionsgleichgewichtes

1

Als Berechnungsgrundlage dienten die mittleren NH3-Konzentrationen und ¹⁵ N-Anreicherungen von Proben aus dem Infusionsgleichgewicht (Tag 10 + 12). Um fütterungsbedingte Tagesschwankungen in der NH3-Konzentration auszugleichen, wurden die vierstündlich entnommenen Proben der partikelfreien Flüssigkeit zu Tagespoolproben (6 Proben je Pool) zusammengeführt. ¹⁵NRM stammt aus der folgend geschilderten Approximierung der ¹⁵N-Meßergebnisse (A⁰).

Multipliziert man die N-Assimilation mit 6,25 erhält man die geschätzte mikrobielle Proteinsynthese.

Bestimmung der Kinetik des N-Umsatzes

Nach dem gleichen Prinzip wie die Berechnung der Flüssigkeitskinetik wurden die Messwerte der ¹⁵N-Anreicherungen in Abhängigkeit der Zeit an eine monoexponentielle Gleichung angenähert.

" _# = ^$ × (1 − ^{&' × #} )

Yt = ¹⁵N-Anreicherung (Atom-%) zum Zeitpunkt t (h)

A⁰ = ¹⁵N-Anreicherung nach Erreichen des Infusionsgleichgewichtes bei t_∞ k = Ratenkostante ( x h^-1)

Dann wurden wie unter 2.7.4.4.1. geschildert die Größe (V), die Umschlagsrate (U) und die mittlere Retentionszeit (R) des mikrobiellen N-Pools berechnet. Dafür wurde die Infusionsrate ¹⁵Ni um den Abfluss und die Resorption von NH3-¹⁵N korrigiert.

Auch hier diente das Bestimmtheitsmaß R² zur Beurteilung der Güte der Anpassung.

2.7.4.5. Single-strand-conformation-polymorphism-(SSCP)-Analyse

Isolierung der Mikroorganismen

Die Gewinnung der Bakterienfraktion erfolgte wie unter 2.7.4.4.2 beschrieben. Das verbleibende Bakterienpellet wurde mit autoklavierter 0,9%-iger NaCl-Lösung resuspendiert und mithilfe einer Glaspipette in flüssigen Stickstoff getropft. Die erhaltenen Probenkügelchen wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C tiefgefroren.

Isolierung der genomischen DNA

150 – 500 µl (30 – 80 mg) der mikrobiellen Zellmasse wurden langsam auf Eis aufgetaut und 5 Min. bei +4°C und 13.000 g zentrifugiert (Megafuge 1.0 R, Heraeus Instruments GmbH, D-63450 Hanau). Das Zentrifugat wurde abgenommen, das verbleibende Pellet mit 600 µl 1x Tris-EDTA-NaCl (TEN) ( Anhang) resuspendiert und in Schraub-Tubes überführt, die vorher mit Zirkonia/Silica-Kügelchen befüllt wurden (Silica-Kügelchen: ø 0,1 mm, Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe).

Anschließend erfolgte die mechanische Zelllyse in zwei Durchläufen in einem Homogenisator (RiboLyser Cell Disruptor, Hybaid GmbH, D-69111 Heidelberg): 45 s bei 6,0 m/s, gefolgt von nach 1 Min. Kühlung auf Eis nochmals 45 s bei 4,5 m/s. Bei +4°C und 13.000 g wurden die Silica-Kügelchen für 15 Min. abzentrifugiert, das Zentrifugat abgenommen und 50 µl Lysozym-Lösung (100 mg/ml) und 10 µl RNase A (10 mg/ml) hinzugegeben und bei 37°C für 30 Min. im Wasserbad inkubiert.

Anschließend wurden 15 µl 50°C warme Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Lösung (20%) und 10 µl Proteinkinase K (20 mg/ml) zugegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurden 125 µl autoklavierte NaCl-Lösung (4 N) und 80 µl auf 50°C erwärmte Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung (CTAB) zugegeben, die Proben gemischt und 10 Min. bei 65°C im Wasserbad denaturiert. Zur Proteinfällung dienten 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Die Proben wurden vorsichtig gemischt und 5 Min. bei +4°C und 13.000 g zentrifugiert. Von den gebildeten zwei Phasen wurde die obere abgenommen und in ein neues Tube überführt. Nach der Zugabe von 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) wurde 10 Min. bei +4°C und 13.000 g zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein neues Tube überführt, der Rest verworfen. Im Anschluss wurden 500 µl Isopropanol (100 %) zugegeben, die Proben bei 5 Min. RT inkubiert und dann 30 Min. bei +4°C und 13.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das verbleibende DNA-Pellet mit 950 µl 80%-igem Ethanol gewaschen. Der letzte Zentrifugationsschritt erfolgte 5 Min. bei +4°C und 13.000 g. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet für ca. 15 Min. bei Raumtemperatur getrocknet und abschließend in 20 µl tris-EDTA-(TE)-Puffer resuspendiert. Danach wurden die Proben bis zur weiteren Bearbeitung bei -20°C eingefroren.

Photometrische Quantifizierung der genomischen DNA

Die genomische DNA (gDNA) wurde in Quarzküvetten (Hellma GmbH & Co. KG; D-79371) photometrisch quantifiziert (BioPhotometer, Eppendorf AG, D-22339 Hamburg). Dazu wurde die genomische DNA in zweimal autoklaviertem H2O verdünnt (1:72). Die DNA wurde dann auf eine Konzentration von 25 ng/µl mit zweifach autoklaviertem H2O verdünnt.

Qualitätsprüfung mittels Agarose-Gelelektrophorese

Für die Prüfung der gDNA wurde ein 0,8 %-iges Agarose-Gel ( Anhang) mit 5 µl Probe-Ladepuffergemisch (2 µl Ladepuffer + 3 µl Probe) je Geltasche befüllt. Genutzt wurden als Marker 3 µl Mass Ruler^® DNA Ladder Mix bzw. 3 µl λ-Hind III (Fermentas, Fisher Scientific – Germany GmbH, D-58239 Schwerte) inklusive der dazu gehörigen Ladepuffer. Die Elektrophorese fand bei 100 V über 30 Min. statt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einer Ethidiumbromid-Lösung ( Anhang) 10 Min.

zum Anfärben der DNA-Banden auf einem Schwenker (Belly Dancer^®, Stovall Life Science Inc., Greensboro, NC, USA) gefärbt und anschließend 10 Min. mit Aqua dest. zum Entfernen der Färbelösung gewaschen. Unter einer UV-Lichtquelle (Biometra Ti 1, Biometra GmbH, D-37079 Göttingen) wurde die Färbung sichtbar gemacht und mit Hilfe des BiodocII^® (Biometra GmbH, D-37079 Göttingen) fotographisch erfasst.

Die PCR-Produkte aus späteren Präparationsschritten wurden ebenfalls mittels eines Agarose-Gels (1%) und den Markern GeneRuler^® 50bp DNA Ladder und 100bp DNA ladder (New England Biolabs GmbH, D-65926 Frankfurt a. M.) überprüft.

Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Mit sequenzspezifischen Primern für die Domäne Bacteria wurden die zur Untersuchung erwünschten Genabschnitte von 16S rRNA vervielfältigt. Die verwendeten Primer (Biomers.net GmbH; D-89077 Ulm) sind der Tabelle 6 zu

Tabelle 7: Reaktionsansatz spez.

entnehmen. Zunächst wurde eine bakterienspezifische PCR unter Verwendung des Primer-Paares F27/R1492 durchgeführt (Reaktionsansatz siehe Tabelle 7). Für jede Probe wurde ein doppelter Ansatz zuzüglich einer Negativkontrolle gewählt. Die DNA wurde als Template vorgelegt. Für die PCR wurde ein Thermocycler genutzt (Eppendorf AG, D-22339 Hamburg, Tab. 8).

Tabelle 6: Primer für 16S rRNA-Genabschnitte (AT=Annealingtemperatur). Amplifizierte variable Regionen (V-Region) des 16S Gens angegeben. ^aLANE, 1991; ^bSCHWIEGER &

TEBBE, 1998.

Die PCR-Produkte wurden in einem 1 %-igem Agarose-Gel auf die korrekte Länge geprüft, anschließend photometrisch quantifiziert und die Proben erneut auf eine Zielkonzentration von 25 ng/µl für die folgende nested PCR eingestellt (für PCR-Cycler-Konfiguration siehe Tab. 10). Hier wurde je Probe ein dreifacher Reaktions-Ansatz (Tab. 9), sowie phosphorylierte Primer genutzt. Anschließend wurde das Produkt der nested PCR auf die Länge in einem 1 %-igem Agarose-Gel überprüft.

Aufreinigung der PCR-Produkte aus der nested PCR

Die Aufreinigung erfolgte mit dem QIA Quick Purification Kit (Qiagen GmbH, D-40724 Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers. Mit dem letzten Schritt wurden 50 µl EB-Puffer zur Elution direkt auf die Filtereinheit gegeben, 1 Min. bei RT inkubiert und anschließend 1 Min. bei 16.060 g zentrifugiert. Anschließend wurden das gesamte Probenvolumen photometrisch in Einmal-Küvetten (UVette^®, Eppendorf AG, D-22339 Hamburg) quantifziert und das Volumen an 2x autoklaviertem H2O bestimmt, um die Proben auf eine Zielkonzentration von 1.000 ng/26 µl Zielvolumen zu verdünnen.

Tabelle 9: Reaktionsansatz nested

Einzelstrangverdau der aufgereinigten DNA

Es wurden 26 µl der verdünnten Probe mit 14 µl Reaktionsgemisch (Tab. 11) versetzt.

Aufreinigung der Produkte des Einzelstrang-verdaus (ssDNA)

Die Aufreinigung erfolgte mit dem miniElute PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, D-40724 Hilden). Die Prozedur gleicht weitestgehend

der zuvor beschriebenen Aufreinigung der dsDNA. Abschließend wurden 10 µl EB-Puffer direkt auf die Filtereinheit der Säule gegeben, die Probe 1 Min. bei RT inkubiert und 1 Min. bei 16.060 g eluiert.

Polyacrylamid-(PAA)-Gelelektrophorese

Genutzt wurde das DCode^® Universal Mutation Detection System (Biorad Gmbh, D-80939 München). Die Glasplatten wurden zur Vorbereitung der Gelherstellung mit einem Haft- (Trägerplatte: 20 x 20 cm, Bind Silane-Lsg. Anhang) bzw. Trennmittel (Deckplatte:

20 x 22,4 cm, PlusOne Repel Silane-Lsg.

Anhang) beschichtet, um das schadfreie

Ablösen der Deckplatte von der Gelträgerplatte nach der Elektrophorese zu erleichtern. Das Anmischen des Gels erfolgte auf einem Magnetrührer, die Zusammensetzung ist Tabelle 12 zu entnehmen. Die Platten wurden mit 0,75 mm dicken Abstandshaltern in den Gelgießstand eingebaut und das Gel blasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen und mit einem Kamm für die Geltaschen versehen. Ein 0,75 mm dickes PAA-Gel lag nach der Auspolymerisation (ca. 2 h) vor

Tabelle 11: Reaktionsansatz

(New England Biolabs, USA) 0,5

Probe (dsDNA) 26

und wurde in das DCode^® Universal Mutation Detection System eingebaut. Die Proben wurden mit 8 µl SSCP-Ladepuffer versetzt ( Anhang) und 2 Min. bei 95°C denaturiert, anschließend 3 Min. zum Abkühlen auf Eis gelagert. Links und rechts der Geltaschen mit den Proben wurde in freie Geltaschen ein Speziesstandard eingefüllt.

Als Laufpuffer wurde 1x Tris-Borat-EDTA-(TBE) verwendet, die Laufparameter betrugen 22,5 h bei 300 V. Um eine konstante Temperatur von +20°C gewährleisten zu können, befand sich das DCode^®-System in einem Eisbehälter, der kontinuierlich nachgefüllt wurde, um ein Überhitzen des Pufferbades zu vermeiden.

Silbernitratfärbung des Gels

Die Laufprofile wurden mit Silbernitrat angefärbt und sichtbar gemacht. Nach dem Ausbau aus dem DCode^®-System und Entfernen der Deckplatte wurde das Gel 30 Min. in 10 %-iger Essigsäure auf einem Schüttler bei 52 rpm (Typ 3017, GFL GmbH, D-30938 Burgwedel) fixiert. Danach wurde das Gel 3 x 5 Min. auf dem Schüttler mit Aq. bidest. gespült und anschließend lichtgeschützt 30 Min. mit Silbernitrat-Lösung ( Anhang) auf dem Schüttler gefärbt. Anschließend wurde das Gel 1 Min. mit Aqua bidest. und leichtem Schwenken gespült und danach mit 1/3 der Entwicklerlösung kurz inkubiert. Nach dem Verwerfen wurde die restliche Entwicklerlösung zugegeben. Unter leichtem Schwenken wurde das Gel bis zur gewünschten Färbungsintensität entwickelt und nach Verwerfen der Entwicklerlösung 5 Min. mit 10

%-iger Essigsäure fixiert und anschließend mit Aq. bidest. gespült. Das Gel wurde für ca. 12 h unter einem Abzug getrocknet.

Digitale Analyse und statistische Auswertung der Laufprofile

Die Digitalisierung und Auswertung erfolgte mit der Software GelComparII (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgien). Das Gel wurde dafür mit einem Durchlichtscanner (ScanMaker i800, Mikrotek, D-47877 Willich) mit einer Auflösung von 300 dpi eingelesen. Es wurden nach einer Subtraktion des Hintergrundes und Bereinigung von Artefakten densitometrische Kurven entlang des vertikalen

Verlaufes der Laufprofile erstellt. Diese densitometrischen Kurven wurden in einer Cluster-Analyse mittels Pearson Korrelations-Koeffizienten auf ihre Ähnlichkeit [%]

zueinander geprüft und in Form eines Dendrogramms, basierend auf der

„Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages (UPGMA)“ gruppiert und dargestellt.

Basierend auf der Ähnlichkeitsmatrix der Clusteranalyse wurde für die statistische Analyse der Gelbanden von Versuchstag 8 und 12 ein Permutationstest zur Identifizierung von Fütterungs- und Zeiteffekten angewendet (je Tier 2 Tage und 2 Fütterungsstufen; n=4). Verwendet wurde dafür das Programm Permanova (ANDERSON 2001; ANDERSON & ROBINSON 2003). Gemäß ANDERSON (2005) ist für p < 0,1 die Anzahl an Permutationen klein genug gewesen, um nicht die Monte-Carlo-Simulation (ANDERSON & ROBINSON 2003) durchführen zu müssen, um p zu erhalten.

Im Dokument Einfluss unterschiedlicher Stickstoff-Versorgungsstufen auf die Stickstoff-Bilanz und mikrobielle Pansenparameter von Ziegen (Seite 61-77)