Potentielle Substrat-bindende, katalytisch-aktive Subdomänen des DTAF II 250- 250-Proteins

Um weitere Hinweise auf katalytisch aktive Sequenzen des DTAFII250-Proteins zu erhaten wurde die DTAFII250-Aminosäuresequenz wie zuvor beschrieben auf Sequenzmotive untersucht, die mit dem PROSITE-Signaturpattern der Substrat-bindenden, bzw. katalytisch-aktiven Subdomäne eukaryotischer Serin/Threonin als auch Tyrosin-Kinasen übereinstimmen.

Durch einen manuellen Vergleich der DTAFII250-CT1500-Aminosäuresequenz mit den beiden Signaturpattern konnten zwei potentielle, für Serin/Threonin-Kinasen chrakteristische Sequenzen im Bereich der Aminosäuren 1534 - 1543 und 1883 - 1895 (Abb.2.30, S/T-7 und S/T-8), sowie eine für Tyrosin-Kinasen chrakteristische Sequenz im Bereich der Aminosäuren 1718 - 1730 (Abb.2.31, Y-8) identifiziert werden. Die S/T-7 Sequenz ist NH2-terminal der vermeintlich ATP-bindenden Sequenzen ATP-7 und ATP-8 lokalisiert, die S/T-8 Sequenz befindet sich COOH-terminal der ATP-7- und ATP-8-Sequenzen, zwischen den beiden Exon 12a und Exon 13a Insertionen. Alle drei der so identifizierten Motive stimmen in 8 von 13 Attributen mit dem verwendeten Signaturpattern überein und weisen somit eine Identität von 53 % auf.

Diese Ergebnisse konnten nur bedingt durch die automatische Analyse der DTAFII250-Sequenz unter Verwendung des NPSA-Programms bestätigt werden. So wurde zwar das Tyrosin-Kinase Motiv Y-8 gefunden, jedoch keines der beiden

Serin/Threonin-Kinase spezifischen Motive S/T-7 und -8. Insgesamt wurden sechs unabhängige Sequenz-abschnitte identifiziert, die als potentielle Serin/Threonin-Kinase Motive wirken könnten.

Zwei dieser Sequenzen sind im NH2-Terminus des DTAFII250-Proteins lokalisiert (S/T-1 und -2), zwei in der HAT-Domäne (S/T-5 und -6) und zwei in einem Bereich zwischen NH2 -Terminus und HAT-Domäne (S/T-3 und -4). In der CTK-Sequenz des DTAFII250-Proteins wurde kein Serin/Threonin-spezifisches Motiv gefunden. Das S/T-2 Motiv wurde bereits in früheren Untersuchungen als Subdomäne VI beschrieben (Dikstein et al., 1996).

Abb.2.30. Potentielle Serin/Threonin-Kinase-spezifische, katalytisch-aktive Subdomänen des DTAFII 250-Proteins. Die hier wiedergegebenen Sequenzen S/T-1 bis S/T-6 wurden unter Verwendung des NPSA-Pro-gramms identifiziert, wobei eine minimale Sequenzidentität von 50 % festgesetzt wurde, die Sequenzen S/T-7 und -8 wurden per Auge identifiziert. Ihre Sequenzidentität mit dem Signaturpattern ist mit einem X angegeben um sie von den Werten des NPSA-Algorithmus zu unterscheiden. Aminosäuren die mit dem oben gezeigten Signaturpattern übereinstimmen sind in Großbuchstaben dargestellt, mit dem PROSITE-Pattern nicht überein-stimmende Aminosäuren in Kleinbuchstaben. Die katalytisch-aktiven Aminosäuren Asparaginsäure (D) und Asparagin (N), sowie die die für Serin/Threonin-Kinasen spezifische Aminosäure Lysin (K) sind sowohl im PROSITE-Pattern als auch in den identifizierten DTAFII250-Sequenzen hervorgehoben. Die Identität der DTAF_II250-Sequenzen mit dem Signaturpattern ist in Prozent angegeben und hinter der jeweiligen Sequenz in Klammern gesetzt. Zum Verständnis des Signaturpatterns siehe Erläuterungen zur PROSITE-Syntax unter Abb.2.29 oder http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSAHLP/npsahlp_pattsyntax.html.

NTK: NH₂-terminale Kinase; HAT: Histonacetyltransferase-Domäne; UBAC: H1-Ubiquitinierungs-Domäne;

R74: RAP74-bindende Domäne; B1,2: Bromodomäne 1,2; 12a, 13a: alternative Exonsequenzen, CTK: COOH-terminale Kinase.

Des weiteren konnten acht voneinander unabhängige Sequenzen identifiziert werden, die Homologie zu Tyrosin-Kinase-spezifischen Signaturen aufweisen (Abb.2.31). Eine dieser Sequenzen ist in der CTK-Domäne lokalisiert und wurde bereits durch die manuelle Analyse identifiziert (Y-8). Auffällig ist, daß vier der identifizierten Motive mit jeweils einer der Serin/Threonin-spezifischen Sequenzen identisch sind, wobei die Prozentigkeiten der ange-gebenen Identität sich unterscheiden. Eine der acht identifizierten Sequenzen (Y-1) ist in der NTK-Domäne des DTAFII250-Proteins lokalisiert und ist mit der als S/T-1 gekennzeichneten Sequenz identisch.

Abb.2.31 Potentielle Serin/Threonin-Kinase-spezifische, katalytisch-aktive Subdomänen des DTAFII 250-Proteins. Die hier wiedergegebenen Sequenzen Y-1 bis Y-8 wurden unter Verwendung des NPSA-Programms identifiziert, wobei eine minimale Sequenzidentität von 50 % festgesetzt wurde. Die Sequenz Y-8 wurde zuvor bereits per Auge identifiziert. Die Sequenzen S/T-1 bis S/T-5 sind der Abb.2.30 entnommen und zum besseren Verständnis den Y-Sequenzen gegenübergestellt. Aminosäuren die mit dem oben gezeigten Signaturpattern übereinstimmen sind in Großbuchstaben dargestellt, mit dem PROSITE-Pattern nicht übereinstimmende Amino-säuren in Kleinbuchstaben. Die katalytisch-aktiven AminoAmino-säuren Asparaginsäure (D) und Asparagin (N), sowie die die für Serin/Threonin-Kinasen spezifische Aminosäure Lysin (K) sind sowohl im PROSITE-Pattern als auch in den identifizierten DTAFII250-Sequenzen hervorgehoben. Die Identität der DTAFII250-Sequenzen mit dem Signaturpattern ist in Prozent angegeben und hinter der jeweiligen Sequenz in Klammern gesetzt. Zum Ver-ständnis des Signaturpatterns siehe Erläuterungen zur PROSITE-Syntax unter Abb.2.29 oder http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSAHLP/npsahlp_pattsyntax.html. NTK: NH₂-terminale Kinase;

HAT: Histonacetyltransferase-Domäne; UBAC: H1-Ubiquitinierungs-Domäne; R74: RAP74-bindende Domäne;

B1,2: Bromodomäne 1,2; 12a, 13a: alternative Exonsequenzen, CTK: COOH-terminale Kinase.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß insgesamt 16 putativ Substrat-bindende Sequenzen identifiziert wurden: acht Serin/Threonin-spezifische (S/T-1 bis S/T-8) (S/T-2,

S/T-5, S/T-7 und S/T-8) und acht Tyrosin-spezifische (Y-1 bis Y-8) (Y-2, Y-5, Y-7 und Y-8).

Jeweils vier der als Serin/Threonin-spezifisch deklarierten Sequenzen sind mit vier der Tyrosin-Kinase-spezifischen Sequenzen identisch (1=Y-1, 3=Y-3, 4=Y-4, S/T-5=Y-6; Abb.2.32), womit die Zahl der identifizierten Sequenzen auf 12 eingeschränkt werden kann. Die Sequenzidentitäten mit dem PROSITE-Pattern sind bei allen Sequenzen relativ gering (51 - 66 %). Um dennoch möglichst relevante Sequenzen identifizieren zu können, wurden deshalb nur diejenigen als positive Treffer gewertet, die sowohl eine Asparaginsäure an Position 5, ein Asparagin an Position 10 sowie eine der Substrat-spezifizierenden, konservierten Aminosäuren an Position 7 aufweisen. Nur eine der acht identifizierten Serin/Threonin-Kinase spezifischen Sequenzen besitzt die katalytisch aktiven Aminosäuren Asparaginsäure und Asparagin, sowie das für Serin/Threonin-Kinasen charakteristische Lysin an Position 7 (S/T-2). Hierbei handelt es sich um eine bereits in vorangegangenen Experi-menten als Hank's Subdomäne VI identifizierte Sequenz (Dikstein et al., 1996). Zwei der Serin/Threonin-spezifischen Sequenzen zeigen zwar die beiden katalytsich aktiven Amino-säuren, jedoch keine der Substrat-spezifizierenden Aminosäuren (S/T-3 und S/T-6). Von acht der potentiellen Tyrosin-Kinase spezifischen Motive besitzt lediglich eines sowohl die zwei katalytisch aktiven Aminosäuren als auch eine der für Tyrosin-Kinasen spezifischen Amino-säuren (Y-8). Zwei der Tyrosin-Kinase spezifischen Motive weisen lediglich die beiden katalytsich aktiven Aminosäuren, jedoch keine der Substrat-spezifizierenden Aminosäuren auf (Y-3 und Y-7). Eines der gefundenden Motive zeichnet sich durch einen Asparaginsäure-Rest und der Substrat-spezifizierenden Aminosäure Threonin aus (Y-1). Die verbleibenden neun Sequenzen weisen lediglich eine der drei essentiellen Aminosäuren auf.

Von ursprüglich 16 potentiell katalytisch-aktiven Subdomänen zeigen lediglich zwei alle der katalytisch aktiven als auch Subtrat-spezifizierenden Aminosäuren (S/T-2 und Y-8) und vier zumindest zwei der katalytisch aktiven Aminosäuren (S/T-3, S/T-6, Y-3 und Y-7).

Zwei dieser Sequenzen sind identisch (S/T-3 und Y-3), womit die Zahl der gefundenen Sequenzen mit zwei katalytisch aktiven Aminosäuren, jedoch ohne eine Serin/Threonin- oder Tyrosin-Kinase spezifische Aminosäure, auf drei reduziert werden kann.

Während anhand dieser Analyse das Ergebnis vorangegangener Untersuchungen, in denen die S/T-2 Domäne bereits als potentielle Serin-Kinase Subdomäne beschrieben wurde, bestätigt werden konnte, konnten für die CTK-Domäne des DTAFII250-Proteins lediglich ein Tyrosin-Kinase spezifisches Motiv (Y-8), sowie zwei Serin/Threonin-Kinase-Motive identi-fiziert werden, die nur eine der katalytisch aktiven Aminosäuren, zudem jedoch ein für Serin/Threonin-Kinasen charakteristisches Lysin aufweisen (S/T-7 und S/T-8).

Abb.2.32. Zusammenfassende Darstellung der identifizierten, potentiellen Serin/Threonin- und Tyrosin-Kinase-spezifischen, katalytisch-aktiven Subdomänen des DTAFII250-Proteins. Für Erläuterungen siehe Text und die Abb.2.30 und 2.31.