Kinase-Aktivitäten der GST-FLAG-DTAF II 250-Fusionsproteine

Erste Untersuchungen der möglicherweise als CTK und NTK agierenden DTAFII 250-Fragmente DTAFII250-CT1500, DTAFII250-NT1400 und DTAFII250-NT750 haben ergeben, daß beide Fragmente sowohl auto- als auch transkatalytisch aktiv sind und das Histon H2B sowie das Histon H2B-Peptid phosphorylieren, wobei die Phosphorylierung der Histone durch das CTK-Fragment deutlicher ausgeprägt war (Abb.2.12).

Abb.2.12. GST-FLAG-DTAFII250-CT1500 phosphoryliert Histon H2B und Histon H2B-Peptid. Jeweils 1 µg Sf9-exprimiertes GST-FLAG-DTAFII250-CT1500- und GST-FLAG-DTAFII250-NT1400-Protein wurde mit 5 µg Histon H2B (Spur 1 und 2), sowie 5 µg H2B-Peptid (Spur 3 und 4) in Gegenwart von 0,5 µCi ³²P-g-ATP in 1 x Kinasepuffer für 1 h bei 30 °C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Histon-Proteine mittels SDS-PAGE (18 %) von den GST-FLAG-Proteinen getrennt. Die Position der Histon-Proteine im Proteingel wurde durch Färbung der Gele mit Coomassie-Blau bestimmt (rechts) und ist mit einem Pfeilkopf gekennzeichnet. Die Phosphorylierung wurde mittels Autoradiographie sichtbar gemacht (links).

Aufgrund der Beobachtung, daß für eine Phosphorylierung des Histons H2B die Aktivität des DTAFII250-CT1500-Proteins hinreichend ist, wurden verkürzte Formen des CT1500-Proteins hergestellt, anhand derer die Aktivität der CTK auf eine bestimmte AS-Sequenz eingeschränkt werden sollte. Hiefür wurde zunächst CTK-Proteine erzeugt, denen verschieden lange Abschnitte der NH₂-terminalen Sequenz des CT1500-Proteins fehlen (Abb.2.10, Unten, A - E; Abb.2.11., Spur 1 - 5) und auf Kinase-Aktivität untersucht. Um die Kinase-Aktivitäten der einzelnen Proteine vergleichen zu können, wurde jeweils 1µg der gereinigten Proteine pro Kinase-Assay eingesetzt. Als Substrat wurde rekombinantes Histon H2B sowie Histon H2B-Peptid verwendet (Abb.2.13).

Das Histon H2B wurde durch jedes der eingesetzten DTAFII250-Proteine phospho-ryliert (Abb.2.13, Spur 1 - 6), die deutlichste Phosphorylierung jedoch erfolgte durch das Fragment (Abb.2.13, Spur 1). Auch die Autophosphorylierung ist bei dem

CT1500-Phosphorylierung ist bereits bei dem CT1600-Fragment zu erkennen (Abb.2.13, Spur 2). Die Intensität der Phosphorylierungssignale ist bei allen drei der NH2-terminal verkürzten CTK-Proteine CT1600, CT1800 und CT1900 etwa gleich (Abb.2.13, Spur 2, 3 und 4), bei CT1900 eher noch geringer. Während eine Phosphorylierung des Histons H2B in verschiedener Ausprägung durch jedes der verwendeten Proteine beobachtet werden konnte, war eine Phosphorylierung des Histon H2B-Peptids nur in den Reaktionen mit CT1500-, NT1400- und NT750-Proteinen sichtbar (Abb.2.13, Spur 7, 11 und 12). Wiederum ist die Phosphhorylierung durch das DTAF_II250-CT1500 Protein am deutlichsten ausgeprägt (Abb.2.13, Spur 7).

Abb.2.13. Die Kinase-Aktivität NH2-terminal verkürzter Formen des GST-FLAG-DTAFII 250-CT1500-Proteins ist deutlich reduziert. Jeweils 1 µg Sf9-exprimiertes GST-FLAG-DTAFII250-Protein (siehe Abb.2.10) wurde mit 2 µg Histon H2B (Spur 1 - 8), sowie 2 µg H2B-Peptid (Spur 9 - 15), in Gegenwart von 0,5 µCi ³² P-g-ATP in 1 x Kinasepuffer für 1 h bei 30 °C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Histon-Proteine mittels SDS-PAGE (18 %) von den GST-FLAG-Proteinen getrennt. Die Position der Histon-Proteine im Proteingel wurde durch Färbung der Gele mit Coomassie-Blau bestimmt und ist mit einem Pfeilkopf gekennzeichnet. Die Phosphorylierung wurde mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.

Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, daß die Entfernung der NH2-terminalen 100 Aminosäuren des CT1500-Proteins eine deutliche Reduktion der Kinase-Aktivität mit sich bringt. Demzufolge wurde versucht die katalytisch aktive Domäne des DTAFII 250-CT1500-Proteins anhand weiterer verkürzter Formen des CT1500-250-CT1500-Proteins zu lokalisieren, denen verschieden lange Abschnitte der COOH-terminalen Sequenz fehlen (Abb.2.10, Unten, F - I;

Abb.2.11, Spur 6 - 9). Wie zuvor wurden diese Proteine hinsichtlich ihrer Fähigkeit sich selbst und das Histon H2B, als auch das Histon H2B-Peptid zu phophorylieren, untersucht (Abb.2.14).

Die Kinase-Aktivität der COOH-terminal vekürzten Formen des CT1500-Proteins ist im Vergleich mit der Aktivität der zuvor untersuchten NH2-terminal-verkürzten Proteine noch deutlicher reduziert. Während eine Autophosphorylierung der NH2-terminal-verkürzten Fragmente CT1600 und CT1800 im Vergleich zu dem CT1500-Protein zwar reduziert ist (Abb.2.14, Spur 1 - 3), so ist sie dennoch deutlicher ausgeprägt als die Autophosphorylierung der COOH-terminal verkürzten Proteine CT1500-1900, CT1500-1800, CT1500-1700 und CT1500-1600 (Abb.2.14, Spur 5 - 8). Die Intensität des Autophosphorylierungssignals dieser Fragmente ist mit der Phosphorylierung des CT1900-Proteins vergleichbar (Abb.2.14, Spur 4). Im Gegensatz zu dem vorangegangenen Versuch ist hier eine weitaus schwächere Phosphorylierung des Histons H2B durch die NH₂-terminal verkürzten Proteine CT1600, CT1800 und CT1900 zu erkennen (vergleiche Abb.2.13, Spur 2 - 4 und Abb.2.14, Spur 2 - 4).

Da auch die Phosphorylierung des Histons H2B durch das CT1500-Protein etwas schwächer erscheint, ist die Ursache hierfür vermutlich in einem der experimentellen Schritte zu suchen, wie z.B. einer kürzeren Exposition des Film bei der Herstellung des Autoradiogramms oder einer Inaktivierung der Auto- und Transkinase-Aktivität der DTAFII250-Proteine.

Abb.2.14. Die Kinase-Aktivität COOH-terminal verkürzter Formen des GST-FLAG-DTAF_II 250-CT1500-Proteins ist ebenfalls deutlich reduziert. Jeweils 1 µg Sf9-exprimiertes GST-FLAG-DTAFII250-Protein (siehe Abb.2.10) wurde mit 2 µg Histon H2B (Spur 1 - 8), sowie 2 µg H2B-Peptid (Spur 9 - 15) in Gegenwart von 0,5 µCi ³²P-g-ATP in 1 x Kinasepuffer für 1 h bei 30 °C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Histon-Proteine mittels SDS-PAGE (18 %) von den GST-FLAG-Proteinen getrennt. Die Position der Histon-Proteine im Proteingel wurde durch Färbung der Gele mit Coomassie-Blau bestimmt und ist mit einem Pfeilkopf gekennzeichnet. Die Phosphorylierung wurde mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.

Zusammnefassend läßt sich soweit feststellen, daß jede der NH2- oder COOH-terminal-verkürzten Formen des CT1500-Proteins eine deutlich verringerte Trans- sowie Autokinase-Aktiviät aufweist (Abb.2.15). Demzufolge scheint die gesamte Sequenz der Aminosäuren 1496 - 2133 für die katalytische Aktivität des Proteins notwendig zu sein.

Verwunderlich hierbei ist, daß die verkürzten Formen des CT1500-Proteins, wenn auch deutlich geringere, dennoch Kinase-Aktivität aufweisen. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, daß die Phosphorylierung der DTAFII250-Proteine nicht durch die Proteine selbt, sondern durch eine aufgrund unspezifischer Wechselwirkungen kopurifizierte Kinase erfolgt ist. Die Aktivität dieser Kinase scheint jedoch nur gering zu sein, da keines der DTAF_II 250-Fragmente dem CT1500-Protein entsprechend stark phophoryliert ist. Wenig wahrscheinlich ist, wenn auch nicht ausgeschlossen, daß es sich hierbei um eine Kinase handelt, die spezifisch an das CT1500-Protein bindet und sowohl das DTAFII250-Protein als auch das Histon H2B als Substrat erkennt und phosphoryliert. Ferner könnte es sein, daß die NH₂- und COOH-terminalen Sequenzen der DTAF_II250-CTK entscheidend für die Bildung oder Stabili-sierung der intakten Struktur der katalytischen Domäne sind und somit die katalytische Aktivität beeinflussen. Die NH2- und COOH-terminal verkürzten CTK-Proteine wären somit aufgrund geringerer Stabilität oder Fehlfaltungen vermindert aktiv.

Des weiteren konnte eine Phosphorylierung des Histons H2B und des Histon H2B-Peptids durch die potentielle NTK des DTAFII250-Proteins beobachtet werden. Die Intensität der Phosphorylierung war bei beiden NTK-Proteinen, NT1400 und der COOH-terminal verkürzten Form NT750, gleich stark ausgeprägt und deutlich geringer als durch das CTK-Protein.

Abb.2.15. Schematische Zusammenfassung der beobachteten Kinase-Aktivitäten der GST-FLAG-DTAFII250-Proteine. Die Plus- und Minuszeichen geben die Stärke der beobachteten Kinase-Aktivitäten wieder: starke (+++), weniger starke (++), geringe (+), keine Phosphorylierung (-).