Potentielle ATP-bindende Subdomänen des DTAF II 250-Proteins

Für die Analyse der DTAF_II250-Aminosäuresequenz wurde ein Signaturpattern der ATP-bindenden Subdomäne eukaryotischer Kinasen (Abb.2.28), sowie jeweils ein Signaturpattern der katalytischen Subdomäne Serin/Threonin- und Tyrosin-spezifischer Kinasen (Abb.2.30 und 2.31) der PROSITE-Datenbank entnommen (http://us.expasy.org/cgi-bin/get-prodoc-entry?PDOC00100). Anhand dieser Sequenzmotive wurde zunächst versucht entsprechende Motive in der CTK-Sequenz des DTAFII250-CT1500-Proteins manuell zu lokalisieren.

Hierfür wurde eine Proteinsequenz des DTAFII250-Proteins (NCBI, ID NP_476956.1) verwendet, in welche zuvor die beiden Exon 12a- und Exon 13a-Sequenzen eingefügt wurden (siehe Abb.2.7). Tatsächlich konnte auf diese Weise eine potentielle ATP-bindende Subdomäne im Bereich der Aminosäuren 1749 - 1780 identifiziert werden (Abb.2.28 und

Abb.2.29, ATP-6). Die identifizierte Sequenz stimmt mit 15 von 17 Attributen des PROSITE-Patterns überein, woraus eine Sequenzidentität von 88 % resultiert.

Abb.2.28. Potentielle ATP-bindende Subdomänen innerhalb der CTK-Domäne des DTAFII250-Proteins.

Die hier wiedergegebenen Sequenzen wurden unter Anwendung des PROSITE-Signaturpatterns der ATP-bindenden Domäne eukaryotischer Kinasen identifiziert. Aminosäuren, die mit dem oben gezeigten Signatur-pattern übereinstimmen sind in Großbuchstaben dargestellt, mit dem PROSITE-Pattern nicht übereinstimmende Amonosäuren in Kleinbuchstaben. Das ATP-bindende Motiv (GxGxxG, bzw. G-{P}-G-{P}-[FYWMGSTNH]-[SGA]) sowie ein hochkonservierter Lysin-Rrest (K) sind sowohl im PROSITE-Pattern als auch in den identifi-zierten DTAFII250-Sequenzen hervorgehoben. Die Identität der DTAFII250-Sequenzen mit dem Signaturpattern ist in Prozent angegeben und hinter der jeweiligen Sequenz in Klammern gesetzt. Erläuterungen zur PROSITE-Syntax: Benachbarte Aminosäuren sind durch einen Bindestrich (-) getrennt. Sind eine oder mehrere Amino-säuren von zwei eckigen Klammern ([]) umgeben, so kann an dieser Position innerhalb der Aminosäuresequenz eine der aufgeführten Aminosäuren stehen. Aminosäuren die von einer geschweiften Klammer ({}) umgeben sind hingegen dürfen nicht an dieser Position vorkommen, ansonsten wird jede der restlichen Aminosäuren als richtig gewertet. Kann an einer Position jede beliebige Aminosäure vorkommen, so ist die Position mit einem x gekennzeichnet. Handelt es sich hierbei um eine Folge von beispielsweise drei beliebigen Aminosäuren, so ist dieser Sachverhalt durch eine in Klammern gesetzte Drei wiedergegeben (x(3)). Ist diese Folge in ihrer Länge variabel, so werden die Mindestanzahl, sowie die maximale Anzahl an Aminosäuren in Klammern gesetzt und die beiden Angaben durch ein Komma getrennt (x(2,4)). Für weitere Erläuterungen zur PROSITE-Syntax siehe http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSAHLP/npsahlp_pattsyntax.html. NTK: NH2 -termin-ale Kinase; HAT: Histonacetyltransferase-Domäne; UBAC: H1-Ubiquitinierungs-Domäne; R74: RAP74-binden-de Domäne; B1,2: Bromodomäne 1,2; 12a, 13a: alternative Exonsequenzen, CTK: COOH-terminale Kinase.

Wie genauer unter Kapitel 2.2.4. beschrieben, konnten innerhalb der CTK-Sequenz zwei weitere ATP-bindende Motive identifiziert werden, zwei sogenannte Hooks. AT-Hooks sind charakteristische Strukturmerkmale verschiedener DNA-bindender Proteine (Reeves und Nissen, 1990; Friedmann et al., 1993). Indem sie mit ATP-Nukleotiden interagieren, ermöglichen sie die Bindung dieser Proteine an AT-reiche DNA-Sequenzen

(Reeves und Nissen, 1990; Friedmann et al., 1993). Da AT-Hooks demnach bereits eine für Proteinkinasen essentielle Eigenschaft aufweisen, nämlich die Bindung von Adenosin, wurde im Rahmen dieser Untersuchungen die Frage bearbeitet, in wiefern die identifizierten AT-Hooks dem Signaturpattern eukaryotischer Kinasen entsprechen. Es konnte eine Sequenz im Bereich der Aminosäuren 1791 - 1821 identifiziert werden, die 71 % Sequenzidentität mit dem PROSITE-Pattern aufweist (12 von 17 Attributen stimmen überein). Diese Sequenz wird sowohl NH2-terminal als auch COOH-terminal von jeweils einer der beiden AT-Hook-Sequenzen flankiert und reicht somit bis in die Exon 12a-codierte Sequenz hinein (siehe 2.1.6, Abb.2.28).

Dieses vorläufige Ergebnis konnte durch die weiterführende Analyse der DTAFII 250-Sequenz mit dem öffentlich zugänglichen Programm Network Protein Sequence @nalysis (NPSA) der Pôle Bio-Informatique Lyonnais bestätigt werden (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_pattinprot.html). Das NPSA-Programm ermöglicht eine automatisierte Suche nach Sequenzen innerhalb einer beliebigen Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 50 % zu einem gegeben Signaturpattern aufweisen. Für die Identifizierung potentieller ATP-Bindedomänen wurde die Volllängen Proteinsequenz des DTAFII250-Proteins mit den inserierten Exon 12a- und 13a-Sequenzen verwendet. Als Signa-turpattern wurde das bereits beschriebene PROSITE-Sequenzmuster eingesetzt und die minimale Sequenzidentität des PROSITE-Patterns mit der gefundenen DTAFII250-Sequenz auf 80 % festgesetzt.

Das Ergebnis dieser Untersuchung war die Identifizierung von acht putativ ATP-bindenden Sequenzabschnitten, von denen alle ein möglicherweise katalytisch aktives Lysin aufweisen (ATP-1 bis -8). Fünf dieser Abschnitte besitzen ein "vollständiges" ATP-bindendes GxGxxG-, bzw. G-{P}-G-{P}-[FYWMGSTNH]-[SGA]-Motiv, bestehend aud jeweils einem Glycin an Position 2 uns 4 innerhalb des Signaturpatterns, sowie einem dritten Glycin bzw.

einem Serin oder Alanin an Position 7 (Abb.2.29, ATP-1, -2, -3, -7 und -8). Die als ATP-4, ATP-5 und ATP-6 gekennzeichneten Sequenzen zeigen zwar hohe Sequenzidentität mit dem PROSITE-Pattern (82 - 85 %), jedoch ein "unvollständiges", nur wenig konserviertes DNA-bindendes Motiv. Von den acht identifizierten putativ ATP-bindenden Sequenzabschnitten weist die ATP-8 Sequenz mit 90 % die höchste Identität mit dem verwendeten Signaturpattern auf.

Abb.2.29. Potentielle ATP-bindende Subdomänen des DTAF_II250-Proteins. Die hier wiedergegebenen Sequenzen wurden unter Verwendung des NPSA-Programms identifiziert, wobei eine minimale Sequenzidentität von 80 % festgesetzt wurde. Aminosäuren die mit dem oben gezeigten Signaturpattern übereinstimmen sind in Großbuchstaben dargestellt, mit dem PROSITE-Pattern nicht übereinstimmende Amonosäuren in Klein-buchstaben. Das ATP-bindende Motiv (GxGxxG, bzw. G-{P}-G-{P}-[FYWMGSTNH]-[SGA]) sowie ein hochkonservierter Lysin-Rrest (K) sind sowohl im PROSITE-Pattern als auch in den identifizierten DTAFII 250-Sequenzen hervorgehoben. Die Identität der DTAF_II250-Sequenzen mit dem Signaturpattern ist in Prozent ange-geben und hinter der jeweiligen Sequenz in Klammern gesetzt. Erläuterungen zur PROSITE-Syntax: Benach-barte Aminosäuren sind durch einen Bindestrich (-) getrennt. Sind eine oder mehrere Aminosäuren von zwei eckigen Klammern ([]) umgeben, so kann an dieser Position innerhalb der Aminosäuresequenz eine der aufge-führten Aminosäuren stehen. Aminosäuren die von einer geschweiften Klammer ({}) umgeben sind hingegen dürfen nicht an dieser Position vorkommen, ansonsten wird jede der restlichen Aminosäuren als richtig gewertet.

Kann an einer Position jede beliebige Aminosäure vorkommen, so ist die Position mit einem x gekennzeichnet.

Handelt es sich hierbei um eine Folge von beispielsweise drei beliebigen Aminosäuren, so ist dieser Sachverhalt durch eine in Klammern gesetzte Drei wiedergegeben (x(3)). Ist diese Folge in ihrer Länge variabel, so werden die Mindestanzahl, sowie die maximale Anzahl an Aminosäuren in Klammern gesetzt und die beiden Angaben durch ein Komma getrennt (x(2,4)). Für weitere Erläuterungen zur PROSITE-Syntax siehe http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSAHLP/npsahlp_pattsyntax.html. NTK: NH2-terminale Kinase;

HAT: Histonacetyltransferase-Domäne; UBAC: H1-Ubiquitinierungs-Domäne; R74: RAP74-bindende Domäne;

B1,2: Bromodomäne 1,2; 12a, 13a: alternative Exonsequenzen, CTK: COOH-terminale Kinase.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß fünf der acht gefundenen Sequenzmotive deutlich mit dem Signaturpattern der ATP-bindenden Subdomäne eukaryotischer Kinasen übereinstimmen. Drei dieser Sequenzen sind in den NH₂-terminalen 100 AS und somit in der NTK Domäne des DTAFII250-Proteins lokalisiert, zwei dieser Sequnezen befinden sich in der CTK Domäne des DTAFII250-Proteins. Die drei im NH2-Terminus lokalisierten Sequenzen überschneiden sich bis auf einige terminale Aminosäuren, die im COOH-Terminus

identi-fizierten zwei Sequenzabschnitte überschneiden sich ebenfalls bis auf zwei terminale Aminosäuren.

Das Ergebnis dieser Untersuchung ist die Identifizierung von zwei Bereichen innerhalb des DTAFII250-Proteins, die vermutlich jeweils eine ATP-bindende Subdomäne ausbilden. Einer dieser Bereiche erstreckt sich über die Aminosäuren 39 - 75 und ist somit in der NTK-Domäne lokalisiert. Der zweite Bereich befindet sich in der CTK-Domäne und umfaßt die Aminosäuren 1747 - 1780. Ob es sich bei diesen Sequenzen tatsächlich um die ATP-bindenden Subdomänen der NTK und CTK des DTAF_II250-Proteins handelt wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Anhand dieser Daten wurde jedoch eine modifizierte Form des DTAFII250-CT1500-Proteins entwickelt, in welcher die potentiell ATP-bindende Subdomäne ATP-8 gezielt entfernt wurde. Ob diese Mutation mit einem Verlust der Kinase-Aktivität einhergeht wird Gegenstand künftiger Untersuchungen sein.

2.2.3. Potentielle Substrat-bindende, katalytisch-aktive Subdomänen des DTAFII