Die unter Kapitel 2.1.5. und 2.1.7. aufgeführten in vitro Untersuchungen zur Substratspezifität der DTAFII250-Kinase haben gezeigt, daß DTAFII250 bevorzugt Serine phosphoryliert. Durch die Verwendung von Histon H2B-Peptid-Mutanten konnte festgestellt werden, daß vornehm-lich ein Serin an Stelle 33 als Substrat erkannt und modifiziert wird. Um diesen Sachverhalt nochmals überprüfen zu können, wurden Phosphoserin-33-spezifische Antikörper erzeugt.
Polyklonale a-H2B-Phosphoserin-33-Antikörper wurden, wie in Kapitel 4.6. beschrie-ben, hergestellt und gereinigt. Hierbei wurden Phosphoserin-33-spezifische Antikörper von H2B-Peptid-spezifischen, jedoch Phosphoserin-33-unspezifischen Anrikörpern getrennt, und die so isolierten Antikörper auf Spezifität hin untersucht. Durch mehrmaliges Wiederholen der Reinigung war es möglich spezifische a-H2B-Phosphoserin-33-Antikörper zu isolieren, die abschließend konzentriert und erneut auf Phosphoserin-33-Spezifität hin untersucht wurden (Abb.2.34).
Abb.2.34. Gereinigte a-H2B-Phophoserin-33-Antikörper. Jeweils 10 µl von 4 gesammelten Fraktionen nach Konentration der a-H2B-Phophoserin-33-Antikörper über Protein G-Agarose (Boehringer) wurden auf ein PAA-Gel (12 %) aufgetragen (A). Die schwere und die leichte Antikörperkette wurden durch Färbung des PAA-Gels mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht und mit einem Pfeilkopf gekennzeichnet. Die Fraktion 2 enthält die höchste Konzentration an Antikörpern. Die Substrat-Spezifität der Fraktion 2 wurde mittels Western-Blot-Analyse untersucht (B). Hierfür wurden jeweils 10 µg des H2B-Serin-33-Peptids (siehe C) ohne modifiziertes Serin33, sowie 10 µg des H2B-Phosphoserin-33-Peptids (siehe C) auf eine Nitrocellulose-Membran aufgetragen. Nach einer Inkubation der Membran in einer 5 % igen Milchpulver-TBST-Lösung wurde ein Teil dieser Membran mit verschiedenen Verdünnungen der Fraktion 2 (1 : 10 - 1 : 1000) für 1 h bei RT inkubiert. Der zweite Teil der Membran wurde mit entsprechenden Verdünnungen des nicht gereingten Serums inkubiert. Die Inkubation des Zweitantikörpers (a-Rabbit-AP, Sigma) erfolgte in einer Verdünnung von 1 : 1000 für 1 h bei RT. C: Sequenzen der für die Herstellung und Reinigung a-H2B-Phophoserin-33-spezifischer Antikörper hergestellten Peptide. Die Aminosäuren sind im Einbuchstaben-Code wiedergegeben. Das Serin an Stelle 33 ist hervorgehoben. Das Phosphoserin des H2B-Phosphoserin33-Peptid ist durch den Buchstaben B gekennzeichnet. Für die Immu-nisierung wurde KLH-gekoppeltes Histon H2B-Phosphoserin-33-Peptid verwendet, wobei die Kopplung an KLH über ein NH2-terminal hinzugefügtes Cystein erfolgte, das normalerweise nicht in der Histon H2B-Sequenz vorkommt. Für die Reinigung der Antikörper wurden zwei Affinitätsmatrizen generiert, indem jeweils eines der Peptide H2B-Phosphoserin-33 und H2B-Serin-33 auf einer SulfoLink Matrix immobilisiert wurde.
2.3.1. Die gereinigten a-H2B-Phosphoserin-33-Antikörper erkennen in vitro phospho-ryliertes Histon H2B
Um die Spezifität der gereinigten Antikörper weiter zu charakterisieren, wurden Western-Blot-Analysen durchgeführt, für welche in vitro phosphoryliertes rekombinantes Histon H2B
und Histon H2B-Peptid verwendet wurden (Abb.2.35). Hiefür wurden die beiden Histon-Proteine gemeinsam mit 1 µg GST-FLAG-DTAFII250-CT1500-Protein nach Zugabe von 32 P-g-ATP für 1 h bei 30 °C in Kinasepuffer inkubiert. Anschließend wurden die phosphorylierten Histon-Proteine mittels SDS-PAGE (18 %) von den DTAFII250-Proteinen getrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und unter Verwendung der gereinigten a-H2B-Phospho-serin33-Antikörper auf Phosphorylierung des Serin-33 untersucht. Die Phosphorylierung des H2B-Histons und des H2B-Peptids wurde mittels Autoradiographie überprüft.
Abb.2.35. Gereinigte a-H2B-Phophoserin-33-Antikörper erkennen in vitro phosphoryliertes Histon H2B, aber kein in vitro phosphoryliertes H2B-Peptid. Jeweils 1 µg Sf9-exprimiertes, gereinigtes GST-FLAG-DTAFII250-CT1500-Protein (Spur 1 und 3) wurde mit 5 µg Histon H2B (Spur 1), sowie mit 5 µg H2B-Pepid (Spur 3) in Gegenwart von 0,5 µCi 32P-g-ATP in 1 x Kinasepuffer für 1h bei 30 °C inkubiert. Als Negativ-Kontrolle wurden Kinase-Assays mit jeweils 5 µg Histon H2B (Spur 2), sowie 5 µg H2B-Peptid (Spur 4) in Abwesenheit von DTAFII250-CT1500-Protein durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Pobenpuffer beendet und die Histon-Proteine mittels SDS-PAGE (18 %) von den DTAFII250-Fragmenten getrennt. Anschließend wurden die Proteine mittels Western-Blot auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert, mit PonceauS sichtbar gemacht und die Position der H2B-Histone und Peptide markiert (Pfeilköpfe). Die Inkubation mit dem a-H2B-Phosphoserin-33-Antikörper erfolgte in einer Verdünnung von 1 : 100 bei RT ÜN.
Der Zweitantikörper (a-Rabbit-AP, Sigma) wurde in einer Verdünnung von 1 : 10000 für 1 h bei RT eingesetzt, die Inkubationszeit betrug 1 h bei RT.
Mit Hilfe der a-H2B-Phosphoserin-33-Antikörper konnte zwar eine Phosphorylierung des Histons H2B durch das GST-FLAG-DTAFII250-CT1500-Protein nachgewiesen werden, jedoch keine Phosphorylierung des Histon-H2B-Peptids (Abb.2.35, Spur 1 und 3), obwohl eine Phosphorylierung der beide Substrate durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden konnte (S. Kwoczynski, nicht gezeigte Ergebisse). Nicht phosphoryliertes Histon H2B oder Histon H2B-Peptid werden nicht von den a-H2B-Phosphoserin-33-Antikörpern erkannt (Abb.2.35, Spur 2 und 4). Die Beobachtung, daß keine Phosphorylierung des Histon H2B-Peptids feststellbar war, läßt darauf schließen, daß das Phosphorylierungssignal zu schwach, bzw. die Konzentration der Antikörper zu gering war, um dieses Signal nachzuweisen. Eine weitere mögliche Erklärung dieser Beobachtung könnte durch die Sequenz des für die in vitro
Phosphorylierung verwendeten H2B-Peptids gegeben sein. Während das für die Im-munisierung verwendete H2B-Peptid COOH-terminal des phosphorylierten Serins 33 vier weitere Aminosäuren besitzt, endet das für die in vitro Phosphorylierung verwendete Peptid nach dem Serin 33 (Abb.2.37). Demzufolge könnte das in vitro phosphorylierte H2B-Peptid kein ausreichendes Epitop darstellen.
Deweiteren wurde versucht die eine Phsophorylierung des H2B-Histons an Serin 33 in gereinigten Drosophila Histon-Oktameren und Nukleosomen nachzuweisen. In beiden Fällen konnte kein Signal beobachtet werden. Auch die Färbung polytäner Chromosomen war bislang erfolglos (nicht gezeigte Ergebnisse). Vermutlich ist eine weitere Konzentrierung der a-H2B-Phosphoserin-33-Antikörper notwendig, um eine Phosphorylierung des Histons H2B gegebenenfalls in vivo nachweisen zu können.
2.4. Einfluß der DTAFII250-Mutationen 1984 und 3194 auf die Transkription des