4. Material und Methoden
4.9 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Mit Hilfe der PCR können spezifische Fragmente einer Ausgangs-DNA gezielt vervielfältigt werden. Die DNA wird durch eine ausreichend hohe Temperatur denaturiert (Standard-PCR:
94°C). Ihre beiden Stränge trennen sich aufgrund der Aufspaltung von Wasserstoffbrückenbindungen, so dass die zuvor im Überschuss zugegebenen Oligonukleotid-Primer der gesuchten Sequenz sich an die einzelnen Stränge anlagern können.
Diese Primer sind sequenzhomolog zu den Abschnitten der Einzelstrang-DNA, die vor und hinter dem zu vervielfältigenden Abschnitt liegen. Für diese Hybridisierung muß die Temperatur gesenkt werden. In den hier durchgeführten Versuchen wurde eine Senkung der Temperatur auf 50° C durchgeführt. Eine ebenfalls zu Beginn zugegebene, hitzestabile Taq-Polymerase ermöglicht die Anlagerung der passenden Nukleotide an den Primer, so dass wieder doppelsträngige DNA entsteht. Das Temperaturoptimum dieser Polymerase liegt bei 72° C. Diese Zyklen aus Denaturierungs-, Annealing- (wie der Hybridisierungsschritt genannt wird) und Elongationsschritt werden nun mehrfach wiederholt, so dass ein Vielfaches der gesuchten DNA-Stränge, auch Template genannt, entsteht.
4.9.1 RNA-Isolierung
Material
Die Reagenzien stammten, soweit nicht anders vermerkt, von Merck, Darmstadt
RNAClean-Lösung (PeqLab, Erlangen) PeqGold RNA Pure Chloroform p.a.
Isopropanol p.a.
75 %iges Ethanol
Tris/EDTA (TE), pH 7,4
1 ml 1M Tris/HCl, pH 7,4 0,2 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 ad 100 ml H2O
Um die RNA aus den Zellen zu isolieren, mussten diese zuerst homogenisiert werden. Unter einem Abzug wurden die Zellen in der RNAClean-Lösung in der Konzentration von 106 Zellen pro 0,2 ml in einem Glasdouncer homogenisiert. Danach wurde ein Zehntel des Volumens an Chloroform hinzugegeben, mindestens fünfzehn Sekunden gevortext und die Probe danach fünf Minuten bei 4° C stehen gelassen. Nun folgte eine fünfzehnminütige Zentrifugation bei 13400g in der Minute und 4° C. So entstanden drei Phasen. Die RNA befand sich in der oberen, wässrigen Phase, die untere Phase bestand aus Phenol und Chloroform. Die Interphase enthielt Proteine und DNA. Die wässrige Phase wurde abgenommen und eine Fällung der darin enthaltenen RNA mit dem gleichen Volumen an eiskaltem Isopropanol durchgeführt. Die Lösung ruhte hierfür fünfzehn Minuten bei 4° C.
Alternativ konnte die Ruhephase bei -20° C verlängert werden. Danach fand ein weiterer Zentrifugationsschritt zu den oben genannten Bedingungen statt. Der Überstand wurde entfernt und das RNA-Pellet mit eiskaltem, 75%igem Ethanol (-40° C) dreimal gewaschen.
Um alle Ethanolreste zu entfernen, wurden die Proben bei 68° C weitestgehend getrocknet und danach in 20 µl TE aufgenommen.
4.9.2 Bestimmung der Integrität der RNA
Material
Gelladepuffer
5ml 50% Glycerin 200 µl 0,5M EDTA
0,25 % (w/v) Bromphenolblau 0,25 % (w/v) Xylenxylanol ad 10 ml dd H2O
Alle übrigen Materialien wurden an anderer Stelle schon besprochen.
Die Herstellung eines Agarosegels wurde in dieser Arbeit schon besprochen (siehe Kapitel 4.6.4). Für die Gele zur Bestimmung der Integrität der RNA wurden jedoch immer 1,5%ige Gele hergestellt. Das bedeutet, dass 1,5 g Agarose auf 100 ml Puffer eingewogen wurden. Als Puffer diente immer TAE. 3 µl der Probe wurden mit 3 µl Gelladepuffer und 4 µl H2O versetzt und in die dafür vorgesehenen Wells gegeben. Es wurde eine Elektrophorese bei 90 V für ca. eine Stunde durchgeführt. Die RNA konnte danach unter UV-Licht betrachtet und ihre Integrität über die Digitalkamera dokumentiert werden.
Die RNA eukaryoter Zellen besteht zu 95% aus rRNA, die aus 28S, 18S und 5S RNA zusammengesetzt ist. Die beiden größeren RNA-Bestandteile lassen sich bei guter Integrität der RNA als zwei scharfe Banden bei 5,1 Kilobasen (kb) und 1,9 kb darstellen.
4.9.3 Konzentrationsbestimmung der RNA
Die Konzentrationsbestimmung der RNA wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, wie bei DNA-Proben (siehe S. 55). Bei RNA-Lösungen entspricht eine OD von eins ungefähr 40 µg/ml RNA. Damit verändert sich die beschriebene Formel auf:
OD260 x 40 (Faktor für RNA) x 100 (Verdünnungsfaktor) : 1000 = X µg RNA/µl
4.9.4 Herstellung von cDNA aus RNA durch Reverse Transkription
Material
0,5 µg/µl Oligo(dT)15 (in H2O) Roche, Mannheim
dNTP-Set PeqLAb, Erlangen, Amersham Biosciences
Stammlösungen: dATP, dCTP, dGTP, dTTP je 100 mM Je 25 µl der Stammlösungen
150 µl H2O
10 mM von jedem Nukleotid
SuperscriptII Reverse Transkriptase Kit Invitrogen, Karlsruhe
Darin enthalten:
0,1 M DTT
5 x First Strand Buffer 250 mM Tris/HCl, pH8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2
Superscript II-Enzymlösung 200 U/µl RNAse H Reverse Transcriptase in 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,01% (v/v) NP-40, 50% (v/v) Glycerin
Bei dieser Methode wird mit Hilfe einer reversen Transcriptase von einer vorhandenen mRNA die entsprechende cDNA abgelesen und hergestellt.
1-5 µg der RNA-Probe wurden fünf Minuten in einem Thermoblock bei 65° C erwärmt. Die Probe wurde mit H2O auf 11 µl aufgefüllt. Dieser Lösung wurden 1 µl der Oligo(dT)15 -Lösung und 1 µl dNTP zugegeben und die Mischung durch vortexen sichergestellt. Aus 4 µl 5 x First Strand Buffer und 2 µl 0,1 M DTT-Lösung pro RNA-Probe wurde ein Premix hergestellt. 6 µl des Premixes wurden zu der Probe zugegeben, die Probe gevortext und bei 42° C 2 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl SuperscriptII-Enzymlösung wurde die Lösung vorsichtig mit Hilfe der Pipette gemischt und nach kurzer Zentrifugation eine Inkubation von 50 bis 60 Minuten bei 42° C durchgeführt. Die Enzymreaktion konnte dann durch eine fünfzehnminütige Inkubation bei 70° C gestoppt werden. Die entstandene cDNA-Lösung wurde nun mit H2O auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt und bei -20° C gelagert.
4.9.5 Durchführung der RT-PCR
Material und Gerät
Die Reagenzien stammten, soweit nicht anders vermerkt, von Merck, Darmstadt.
Promega Taq-Polymerase-Puffer Promega, Mannheim PeqGold Leiter Mix (100 bp) PeqLab, Erlangen Biotherm, Taq-Polymerase GeneCraft, Münster
Tris/EDTA (TE), pH 7,4
1 ml 1M Tris/HCl, pH 7,4 0,2 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 ad 100 ml H2O
dNTP-Set PeqLAb, Erlangen, Amersham Biosciences
Stammlösungen: dATP, dCTP, dGTP, dTTP je 100 mM Je 25 µl der Stammlösungen
150 µl H2O
10 mM von jedem Nukleotid
Ladepuffer
1,5 g Ficoll 400 20 ml H2O
Tatrazine zum Färben
4.9.6 Sequenzen der Oligonukleotid-Primer für die RT-PCR
Die Auswahl der Oligonucleotid-Primer erfolgte auf der Grundlage der in den öffentlichen Datenbanken zugänglichen Sequenzen.
Konzentration 100 pmol/µl:
NCBI-Accession No.
Bos taurus apoptosis regulator bax-alpha mRNA (348bp): (gi:1938370)
sense 5´-AAG CTG AGC GAG TGT CTG AAG-3´
antisense 5´-CAA AGA TGG TCA CTG TCT GCC-3´
Bos taurus bcl-2 mRNA (303bp und 285bp) (gi:2058667)
sense 5´-ACA GGC TAC GAT AAC CGA GAG-3´
und
sense 5´-GAG ATC GTG ATG AAG TAC ATC-3´
antisense 5´-ACT GGA CAT CTC GGC GAA GTC-3´
Bos taurus glyceraldehyde-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) mRNA (198 bp)
(gi:1841757) sense 5'-GTCTTCACCACCATGGAG-3';
antisense 5'-GTCATGGATGACCTTGGC-3'
PCR-Maschine Biometra, Göttingen
Die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellte cDNA-Sequenz sollte nun vervielfältigt werden. Dies wurde mit Hilfe der oben beschriebenen Standard-RT-PCR durchgeführt. Um auf ein Volumen von 50 µl pro Probe zu kommen, wurden 47 µl eines vorher erstellten Premixes mit 3 µl der cDNA Probe versetzt. Der Premix bestand aus jeweils 29 µl H2O, 5 µl des Taq-Polymerase-Puffers, 1 µl der 10mM dNTP-Lösung, je 1 µl der 3´- und 5´-Primer und 0,1 µl der Taq-Polymerase. Da der verwendete Ladepuffer mit Ficoll hitzeresistent war, konnten auch je 10 µl dieses Puffers vor der RT-PCR hinzugegeben werden, so dass die Proben gleich danach auf ein Agarosegel aufgetragen werden konnten.
Die Herstellung eines 1,5 prozentigen Agarosegels wurde schon beschrieben. Als Laufpuffer wurde TAE verwendet, als Standard 15 µl des PeqGold Leiter Mixes. Die Elektrophorese wurde für ca. eine Stunde bei 90 V durchgeführt. Die cDNA konnte danach unter UV- Licht betrachtet und über die Digitalkamera dokumentiert werden. Dabei wurde die Größe der zu erwartenden Fragmente mit dem eingesetzen 100 bp Leiterstandard verglichen.