5. Ergebnisse
5.5 Apoptosespezifische Proteine
Es wurde versucht, mit Hilfe der Methode des Western-Blots Proteine nachzuweisen, die im apoptotischen Prozeß eine wichtige Rolle einnehmen.
Bei Versuchen mit Antikörpern gegen Caspase 3, PARP und Bak konnte kein Antikörper gefunden werden, der reagiert hat. Mit den fraglichen Antikörpern wurden mehrere Versuche mit unterschiedlichem Aufbau durchgeführt, um sicher zu gehen, dass kein methodischer Grund für das Ausbleiben der Ergebnisse verantwortlich war. Es wurden unterschiedliche Konzentrationen des ersten und zweiten Antikörpers geprüft. Verschiedene Blockierungsreagenzien wurden verwendet, unterschiedliche Inkubationszeiten gewählt.
Trotz all dieser Bemühungen stellte sich kein Signal ein.
Für das Protein Bcl-2 wurden drei unterschiedliche Antikörper getestet, bei denen nur der von Santa Cruz hergestellte Antikörper Signale hervorbrachte. Diese waren vielfältig und wurden daher nicht für eine Aussage herangezogen.
Ein Erfolg konnte bei dem ebenfalls in der Einleitung erwähnten Protein Bax verzeichnet werden. Auch hier wurde ein Antikörper erfolglos getestet, mit dem zweiten verwendeten Antikörper von Upstate, Biotechnology, konnte eine einzelne Bande mit der erwarteten Größe von 23 kDa gezeigt werden. Als Kontrolle wurde Protein von HL-60 Zellen verwendet. Die Banden der Thekazellen befanden sich auf gleicher Höhe.
1 2
Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
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Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
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Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
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Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
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Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
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Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
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Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
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Vergleich der Western Blots mit unterschiedlichen Antikörpern
1: Bax, Upstate
2: Bcl-2, Santa Cruz
Abb. 5.5.1 Vergleich der Qualität zweier Antikörper
Während bei der Verwendung des Antikörpers gegen Bax nur eine Bande erscheint, zeigen sich multiple Banden bei der Verwendung des Antikörpers gegen Bcl-2.
Mit Hilfe dieses Proteins sollte nun die Apoptose der Thekazellen genauer untersucht werden.
Zuerst wurde festgestellt, welche Inkubationen bei dieser Versuchsanordnung eine Steigerung von Bax verursachen, also proapoptotisch wirken. Unter Berücksichtigung der schon beschriebenen Versuche wurde Serumentzug zur Einleitung der Apoptose genutzt. Dabei wurden Inkubationszeiten zwischen zwei und 24 Stunden gewählt. Diese kurzen Zeitspannen wurden ausgesucht, da die Beeinflussung des apoptotischen Prozesses noch möglich sein sollte. Das Überschreiten des „Point of no Return“ sollte vermieden werden. Bei allen Versuchen wurde durch Serumentzug eine Erhöhung der Menge von Bax-Protein in Thekazellen im Vergleich zu der entsprechend langen Inkubation mit Serum erreicht (siehe Abb. 5.5.2 und 5.5.3).
18,7
Inkubation über mehr als 24 Stunden
Bax, arbiträre Einheiten
Inkubation über mehr als 24 Stunden
Bax, arbiträre Einheiten
Abb. 5.5.2 Vergleich der Mengen an Bax-Protein in Thekazellen durch Western Blot vor und nach Einleitung der Apoptose
Thekazellen wurden mit 1. 1,5% Serum und 2. reinem Medium ohne Zugabe von Serum über 24 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen homogenisiert und deren Proteine extrahiert. Die Proteine wurden einer Gelelektrophorese unterzogen und auf eine Membran geblottet. Das Protein Bax wurde durch einen spezifischen Antikörper und darauf folgender Chemilumineszenz sichtbar gemacht (n = 3).
Apoptoseeinleitung durch Serumentzug über 4 Stunden
Inkubation über 4 Stunden
Bax, arbiträre Einheiten
Apoptoseeinleitung durch Serumentzug über 4 Stunden
Abb. 5.5.3 Vergleich der Mengen an Bax-Protein in Thekazellen durch Western Blot vor und nach Einleitung der Apoptose durch 4 Stunden Serumentzug
Thekazellen wurden mit 1. Medium mit 1,5% fetalem Kälberserum und 2. reinem Medium (Serumentzug) über 4 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen homogenisiert und deren Proteine extrahiert. Die Proteine wurden einer Gelelektrophorese unterzogen und auf eine Membran geblottet. Das Protein Bax wurde durch einen spezifischen Antikörper und darauf folgender Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Die Zellen zeigen nach 4 Stunden Serumentzug eine höhere Menge an Bax, als nach Inkubation mit Serum.
Um den Unterschied beziffern zu können, wurde die Dichte der Banden mit Hilfe des Programmes Scion Image gemessen und ausgewertet (* = P< 0,02 bei n = 4).
Es konnte festgestellt werden, das die Signale für Bax bei Thekazellen selbst nach Apoptoseeinleitung viel geringer waren, als bei der humanen promyeloischen Leukämie-Zelllinie HL-60, die als Kontrolle verwendet wurde (siehe Abb. 5.5.4). Der Unterschied war so groß, dass eine geringere Proteinmenge der HL-60 Zellen verwendet werden musste, um eine Überlagerung der angrenzenden Signale zu verhindern. Bei einem direkten Vergleich muß berücksichtigt werden, dass die Ausgangssituationen unterschiedlich sind. Bei der Kultivierung der HL-60 Zellen wurde eine wesentlich höhere Konzentration an fötalem Kälberserum verwendet, als bei Thekazellen.
β-Aktin
Bax18,7 31,9
1. 2. Bax bei Thekazellen und bei Hl-60 Zellen
0
Inkubation über 24 Stunden
Bax, arbiträre Einheiten
18,7 31,9
1. 2. Bax bei Thekazellen und bei Hl-60 Zellen
0
Inkubation über 24 Stunden
Bax, arbiträre Einheiten
β-Aktin
Bax18,7 31,9
1. 2. Bax bei Thekazellen und bei Hl-60 Zellen
0
Inkubation über 24 Stunden
Bax, arbiträre Einheiten
18,7 31,9
1. 2. Bax bei Thekazellen und bei Hl-60 Zellen
0
Inkubation über 24 Stunden
Bax, arbiträre Einheiten
Abb. 5.5.4 Vergleich der Bax-Protein-Mengen in Theka- und HL-60-Zellen mittels Western Blot 1: Thekazellen, für 24 Stunden mit 1,5% fetalem Kälberserum inkubiert.
2: HL-60 Zellen, mit 10% fetalem Kälberserum inkubiert.
Die Zellen wurden homogenisiert und deren Proteine extrahiert. Die Proteine wurden einer Gelelektrophorese unterzogen und auf eine Membran geblottet. Das Protein Bax wurde durch einen spezifischen Antikörper und darauf folgender Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Die Zellen zeigen einen großen Unterschied in der Bax-Proteinmenge.
Um diesen Unterschied beziffern zu können, wurde die Dichte der Banden mit Hilfe des Programmes Scion Image gemessen und ausgewertet (n = 5).
5.6 Wirkung von Lysophosphatidsäure auf die Apoptose der