PI-Kinase-Beteiligung am Desensibilisierungsverhalten des P2X 2 Rezeptors

FUJIWARA &KUBO zeigten 2006, dass eine Inkubation von P2X2R exprimierenden Oozyten in 30 µM Wortmannin 1-2 h vor der Messung einen starken Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R Stroms hat. In der vorliegenden Arbeit konnte dieser Effekt bestätigt werden, der Rezeptorstrom (ausgelöst durch 100 µM ATP) zeigte nach 1-stündiger Vorinkubation in 30 µM des membrangängigen [VANHAESEBROECK et al., 2001]

Wortmannins (in ORi-+Ca²⁺) eine starke Desensibilisierung innerhalb von 100 s auf im Mittel weniger als 30 % des initialen, ATP-vermittelten Stroms (s. Abb. 3.27). Dahingegen zeigten die unbehandelten P2X2R (Kontroll-)Zellen lediglich eine leichte Desensibilisierung bei anhaltender ATP-Applikation. Diese verbleibenden ATP-vermittelten Rezeptorströme beider Gruppen unterschieden sich hochsignifikant voneinander. Es wurde aus Gründen der Vergleichbarkeit mit o. g. Studien auf eine 100-sekündige (statt wie unter 3.2.2.2 verwendete 300-sekündige) Agonisten-Applikation mit 100 µM ATP zurückgegriffen, was sich zudem als vorteilhaft herausstellte, da die Oozytenqualität durch Wortmannin negativ beeinflusst wurde, was längere Messungen, wie sie im Verlauf dieser Arbeit oft eingesetzt wurden, kaum möglich gemacht hätte.

Abb. 3.27.a: Wortmannin-Behandlung der Oozyten beschleunigte die Desensibilisierung des P2X2

Rezeptorstroms. Inkubation P2X2R exprimierender Oozyten in Wortmannin vor der Messung (1 h, 30 µM) führte zu einer Verstärkung und Beschleunigung der endogenen Desensibilisierung des P2X2

Rezeptorstroms (rechts: PI-Kinase nicht inhibiert, links: PI-Kinase durch Wortmannin-Inkubation inhibiert), die auch vonFUJIWARA &KUBO, 2006, gezeigt wurde; Vm = -60 mV. Die eingesetzte ATP-Konzentration betrug 100 µM, dargestellt sind beispielhafte Original-Messungen.

FUJIWARA & KUBO [2006] interpretieren diesen Desensibilisierungs-fördernden Effekt als Hemmung der PI3-Kinase (PI3K). Die IC50-Konzentration für eine Wortmannin-bedingte PI3K-Hemmung liegt bei 5 nM [OKADA et al., 1994]. Die irreversible Hemmwirkung des Wortmannins ist begründet in einer kovalenten Modifikation des Lys802 der PI3K, das an der Phosphattransfer-Reaktion beteiligt ist [WYMAN et al., 1996]. Sie stützen ihre Hypothese aus weitergehenden Untersuchungen mit einem spezifischen PI3K-Inhibitor, der jedoch weniger potent ist: LY294002 (IC50 = 1 µM, [VANHAESEBROECK et al., 2001]. Durch 12-stündige Inkubation der Oozyten in 30 µM LY294002 konnten sie ähnliche Verstärkungen der Rezeptor-Desensibilisierung hervorrufen. Jedoch muss in Betracht gezogen werden, dass es sich möglicherweise um keine reine PI3K-Inhibition handelte, da Wortmannin in höheren Dosen auch die PI4-Kinase (PI4K) hemmt (IC50 = 50-140 nM [NAKANISHI et al., 1995; BALLA et al., 1997; C^UTLER et al., 1997; X^IE et al., 1999; G^UO et al., 2003; G^AMPER &S^HAPIRO, 2007]). Aus diesem Grund wird im weiteren – trotz der eindeutigen Auslegung FUJIWARAS UND KUBOS – von einer PI-Kinase-Inhibition gesprochen, um die Spezifizierung, ob es sich um die PI3K oder die PI4K handelt, zunächst außen vor zu lassen.

0 20 40 60 80 100

IEnde [%], normiert

**

W Abb. 3.27.b: Wortmannin verstärkte die

Desensibilisierung des P2X2 Rezeptors. Inkubation P2X2R exprimierender Oozyten (rechts, „W“) in Wortmannin vor der Messung (s. o.) führte zu einer Verstärkung und Beschleunigung der endogenen Desensibilisierung des P2X2 Rezeptorstroms im Vergleich zu nicht behandelten Zellen (links), Vm = -60 mV, ATP = 100 µM, „IEnde“ = verbleibender Strom nach 100 s Rezeptoraktivierung, Mittelwerte

± Standardfehler, n = 5, **student´s t-Test, p < 0,01).

Abb. 3.28.a: Inhibition der PI-Kinase verstärkte den „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X2 Rezeptorstrom. Inkubation der Ci-VSP/P2X2R coexprimierenden Oozyten in Wortmannin vor der Messung (1 h, 30 µM) führte zu einer Verstärkung der Herunterregulierung des P2X2

Rezeptorstroms durch die Ci-VSP-Aktivierung nach einer Membran-depolarisation auf 0 mV (vgl. Abb. 3.15).

Die eingesetzte ATP-Konzentration betrug 30 µM (EC50), dargestellt ist eine beispielhafte Original-Messung.

In vielen Wortmannin-behandelten Zellen konnte eine generelle Verringerung des anfänglichen Rezeptorstroms beobachtet werden, was auch schon durch FUJIWARA [2006] und Kollegen gefunden wurde und von ihnen mit einer möglichen Internalisierung der Rezeptoren nach Wortmannin-Inkubation in Verbindung gebracht wurde. Im Zuge dessen wurde vorliegend die elektrische Kapazität der Oozytenmembranen bestimmt (vgl. 3.2.2.7), jedoch kein Unterschied zwischen beiden Versuchsgruppen festgestellt (nicht gezeigt). Somit konnten endocytotische Prozesse an der behandelten Oozytenmembran nicht bestätigt werden.

Die Tatsache, dass eine PI-Kinase-Inhibition durch Wortmannin die Desensibilisierung des P2X2R beschleunigt, ist auch für die vorliegende Arbeit von großem Interesse, da PI-Kinasen in direktem Antagonismus zu PI-Phosphatasen in der Zelle arbeiten. Ci-VSP stellt ebenfalls eine PI-Phosphatase dar, von der bekannt ist, dass sie sowohl PI4,5P2 als auch PI3,4,5P3

dephosphorylieren kann. Die Aktivierung dieser Ci-VSP in Oozyten führte ebenfalls zu einer Herunterregulierung des P2X2 Rezeptorstroms. Zwar ist an dieser Stelle noch unklar, ob es sich dabei um eine Beschleunigung der Rezeptor-Desensibilisierung handelte oder um einen hemmenden Effekt. Falls jedoch sowohl PI-Kinase-Inhibition als auch Ci-VSP-Aktivierung auf das gleiche System in der Oozyte wirken, so sollte in coexprimierenden Oozyten eine Wortmannin-Inkubation 1 h vor der Messung eine Verstärkung des „Ci-VSP-Effekts“ hervorrufen.

Tatsächlich war in Ci-VSP/P2X2R coexprimierenden Zellen genau dies zu beobachten. Die Herunterregulierung des Rezeptorstroms durch Ci-VSP war nach Wortmannin-Inkubation und anschließender Durchführung des Depolarisations-Messprotokolls (0 mV, 30 µM) deutlich verstärkt (s. Abb. 3.28.a). Während in Oozyten, die nicht mit Wortmannin behandelt wurden, der Rezeptorstrom auf ca. 20 % der initalen Größe absank (vgl. Abb. 3.15), fiel er im Mittel in PI-Kinase-inhibierten Oozyten auf ca. 5 % ab, unterschied sich somit signifikant von den unbehandelten, coexprimierenden Zellen (Abb. 3.28.b).

0 50 100 150 200 250 300 350 400 Ci-VSP/P2X2R coexprimierenden Oozyten verstärkte den „Ci-VSP-Effekt“. Die Herunter-regulierung des halb-maximalen (30 µM) ATP-vermittelten P2X2 Rezeptorstroms nach Ci-VSP-Aktivierung durch Depolarisation auf 0 mV war durch PIK-Inhibition (6, 1 h 30 µM Wortmannin) im Vergleich zur Kontrollgruppe (■) sowohl verstärkt als auch beschleunigt. (Mittelwerte ^± Standardfehler, Kontrolle: n = 5, Wortmannin-behandelte Oozyten : n = 4; * student´s t-Test, p < 0,05).

Abb. 3.29.a: Die Beschleunigung der Desensibilisierung des P2X2 Rezeptorstroms durch eine Wortmannin-Behandlung war in Ci-VSP/P2X2R coexprimierenden Oozyten noch verstärkt.

Inkubation coexprimierender Oozyten in Wortmannin vor der Messung (1 h, 30 µM) führte zu einer weiteren Verstärkung und Beschleunigung der endogenen Desensibilisierung des P2X2 Rezeptorstroms (rechts: PI-Kinase nicht inhibiert, links: PI-Kinase durch Wortmannin-Inkubation inhibiert). ATP-Konzentration: 100 µM (100 s), Vm = -60 mV. Dargestellt sind beispielhafte Original-Messungen; vgl.

Abb. 3.27.

Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass nicht nur die Herunterregulierung des Rezeptorstroms durch VSP-Aktivierung beschleunigt und verstärkt war, sondern dass Ci-VSP/P2X2R coexprimierende Zellen auch ohne eine Aktivierung dieser PI-Phosphatase (d. h.

bei -60 mV) eine Verstärkung des durch Wortmannin-Inkubation induzierten Effekts im Vergleich zu rein P2X2R exprimierenden Zellen aufwiesen. Die in Abb. 3.27 erläuterten TEVC-Messungen wurden in identischer Weise an coexprimierenden Oozyten durchgeführt.

Original-Stromspuren daraus können der Abb. 3.29.a entnommen werden, die gemittelten Daten mehrerer Messungen der Abb. 3.29.b. Die Abbildungen zeigen, dass die Desensibilisierung in nicht-behandelten, coexprimierenden Oozyten nur gering ausgeprägt war und der Desensibilisierung in rein P2X2R exprimierenden Oozyten ähnelte (vgl. Abb. 3.27).

Nach einer 1-stündigen Wortmannin-Inkubation zeigte sich eine Desensibilisierung (Abnahme auf 16 % des initialen Stroms; Abb. 3.29.a, rechts; Abb. 3.29.b), die sich nicht nur

0 20 40 60 80

100 Ci-VSP/P2X

2

W W

I Ende

[%], normiert

P2X2

**

Abb. 3.29.b: Einfluss von Wortmannin auf das Desensibilisierungsverhalten von P2X2

Rezeptorströmen in P2X2R bzw. Ci-VSP/P2X2R coexprimierenden Oozyten. ATP = 100 µM (100 s, Vm = -60 mV). Die Wortmannin-behandelten Zellen wurden 1 h vor der Messung in 30 µM Wortmannin inkubiert. Während Wortmannin die Desensibilisierung des P2X2R (links) um das Doppelte vergrößerte (80 bzw. 40 %), wurde die Desensibilisierung des Rezeptorstroms in coexprimierenden Oozyten (rechts) noch wesentlich stärker, um ca. das 5-fache (76 bzw. 15 %) beeinflusst („W“ = Wortmannin-Behandlung;

Mittelwerte ± Standardfehler, jeweils n = 5, ** student´s t-Test, p < 0,01, Wert unterschied sich hochsignifikant von allen anderen Versuchsgruppen).

hochsignifikant von unbehandelten, coexprimierenden Oozyten (76 %; Abb. 3.29.a, links;

Abb. 3.29.b) unterschied, sondern auch von rein P2X2R exprimierenden, Wortmannin-behandelten Oozyten (40 %; Abb. 3.27, rechts; Abb. 3.29.b).