Elektrophysiologische Methoden

2.6.1 Zwei-Elektroden-Spannungsklemme

Um transmembranäre Ströme der Oozyten, die heterolog Membrankanäle exprimierten, abzuleiten und zu untersuchen, mussten, wie unter 1.6.2 beschrieben, 2 Elektroden in die Oozyte eingestochen werden. Nach Herstellung feiner Glasmikroelektroden mithilfe eines vertikalen Pullers, wurde die Spitze manuell mit einer feinen Pinzette abgebrochen, bis sie den gewünschten Durchmesser aufwies. Anschließend wurde die Mikroelektrode vollständig und luftblasenfrei mit einer 3 M KCl-Lösung befüllt. Diese Elektroden wiesen Widerstände von 0,3-2,0 MΩ auf, wobei darauf geachtet wurde, dass die Stromelektrode nicht höherohmig als 1 MΩ war, um Messfehler zu vermeiden, da bei zu hohem Widerstand - dem Ohmschen

Gesetz folgend - die angelegte Spannung sehr hoch sein müsste, was dann zu Artefakten führen kann.

Zur Messung wurde die Oozyte in die dafür vorgesehene und mit MgORi gefüllte Bohrung der Messkammer gelegt und so positioniert, dass der animale Pol nach oben zeigte, da die animale Hemisphäre eine höhere Rezeptordichte aufweist als die vegetative [BOSSI et al., 2008].

Anschließend wurden die Elektroden mithilfe des Mikromanipulators in die Nähe der Oozyte gebracht, ihr Potential auf 0 mV abgeglichen, um sämtliche Potentialbeiträge, die nicht von der Membran stammen, auszuschalten. Sodann wurden die Elektrodenspitzen im rechten Winkel und in einer Linie zueinander in die Oozyte eingestochen. Das Ruhemembranpotential konnte nun am Verstärker abgelesen werden und lag typischerweise zwischen -20 und -40 mV.

Nach Einschalten des Voltage Clamp-Modus (VC) wurde die Oozytenmembran, wenn nicht anders vom auszuführenden Messprotokoll vorgegeben, auf -60 mV geklemmt und der zugehörige transmembranäre Strom detektiert. Da durch das Einstechen der Elektroden die Integrität der Oozytenmembran beeinträchtigt werden kann, wurde in manchen Fällen bis zum Messbeginn kurze Zeit gewartet, um der Oozytenmembran ein „Abdichten“, d. h. eine Regeneration rund um die Einstichstelle, zu ermöglichen. Nachvollzogen werden konnte dies am geringer werdenden Leckstrom.

Während der Messungen erfolgten mehrere Badlösungswechsel, wodurch die Oozyten unterschiedlichen extrazellulären Bedingungen bzw. Agonisten/Antagonisten des zu untersuchenden Membrankanals ausgesetzt wurden, was zu einer Aktivierung (bzw.

Deaktivierung), in diesem Fall zum Öffnen (bzw. Schließen) des Kanals führte. Aufgrund des vorherrschenden chemischen Konzentrationsgradienten über der Oozytenmembran und der angelegten negativen Sollspannung führte diese zu messbaren Veränderungen der Ströme. Die Applikation der angeschlossenen Lösungen wurde über Magnetventile gesteuert, die durch das Messprogramm CellWorks (s. 2.2.5) kontrolliert wurden, und in dem unterschiedlichste Messprotokolle vordefiniert werden konnten. Im Falle von spannungsaktivierten Membranproteinen führte eine Änderung der angelegten Sollspannung zu deren Aktivierung.

Da es sich bei den in dieser Arbeit untersuchten P2X Rezeptoren um Kanäle handelt, die z. T.

sehr schnelle Desensibilisierungsverhalten aufweisen (z. B. P2X1 und P2X3, vollständige Desensibilisierung innerhalb 1-2 s [NORTH, 2002; EGAN et al., 2006]), war ein schneller Lösungswechsel für reproduzierbare und aussagekräftige Ergebnisse unabdingbar. Jedoch bedarf es aufgrund der Größe einer Oozyte besonderer Maßnahmen, um einen ausreichend schnellen Lösungswechsel zu garantieren. Man kann dies erreichen, indem man ein kleines Messkammervolumen (vorliegend 10 µl) mit einem hohen Lösungsdurchfluss (vorliegend

Abb. 2.1: Schema des hier verwendeten, schnellen Lösungswechsels für Two Electrode Voltage Clamp -Messungen an Xenopus Oozyten. (Links: vertikaler Schnitt durch die Messkammer, rechts: Aufsicht auf die Messkammer; nach [RETTINGER &SCHMALZING, 2003])

200 µl/s) kombiniert. Auf diese Art und Weise konnte ein Lösungswechsel realisiert werden, der innerhalb von 0,3-0,5 s abgeschlossen war (s. Abb. 2.1).

In diesem Versuchsaufbau vereinigten sich 8 Lösungsschläuche in einem manifold, der an der vorderen Spitze nur ein sehr geringes Totvolumen aufwies und somit, in Verbindung mit dem schnellen Lösungsdurchfluss (200 µl/s), einen schnellen Lösungswechsel garantierte. Der manifold selber war an einem Mikromanipulator fixiert. Die gebogene Spitze des manifolds (Durchmesser 1,2 mm) wurde so nahe an die Oozyte herangeführt, dass sie ihr fast auflag. Da die Messkammer an sich ebenfalls nur ein sehr kleines Volumen besaß (10 µl), und die Absaugung (Vakuumpumpe) während der Messung permanent eingeschaltet war, war auch der Lösungswechsel in der Kammer schnell vollzogen.

Der Messverstärker war über einen A/D-D/A-Wandler (Interface) mit einem Personal Computer verbunden, wodurch es möglich war, die Steuerung der einzelnen Messparameter über den PC durchzuführen und die Messgrößen digital aufzuzeichnen. Die Messprotokolle, die für jedes Experiment neu angelegt bzw. angepasst wurden und die Sollspannung sowie die Lösungswechsel automatisch ausführten, wurden in der Steuersoftware (CellWorks 3.6) definiert und gespeichert. Die Aufzeichnung der Daten erfolgte ebenfalls über diese Steuersoftware. Die Filterfrequenz bei kontinuierlicher Datenaufzeichnung betrug 100 Hz (Samplingfrequenz 400 Hz) und 1 kHz (Samplingfrequenz 10 kHz), wenn Spannungssprünge oder –rampen ausgeführt wurden. Sämtliche Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

2.6.2 Membranfleck-Spannungsklemme

In Patch Clamp-Experimenten ist, wie in 1.6.3 dargelegt, nur eine einzige Glas-Mikroelektrode vonnöten, um transmembranäre Ströme zu detektieren, und aufgrund der Größe des herausgerissenen Membranflecks ist es möglich, einzelne Kanäle zu isolieren und deren Ströme zu messen.

Die Glas-Patch-Pipetten wurden jeweils kurz vor den Messungen gezogen, um eine Kontamination der fein ausgezogenen Spitze durch Staub o. a. Kleinstteilchen zu verhindern.

Die verwendeten Elektroden wiesen nach Befüllen Widerstände zwischen 2-4 MΩ im Falle von Makro-Patches/whole cell-Messungen und 5-11 MΩ im Falle von single channel-Messungen auf und wurden, je nach Versuchsobjekt (Oozyten/HEK293-/PC12-Zellen) mit entsprechender Pipettenlösung, die den jeweiligen intrazellulären Gegebenheiten entsprach, befüllt (s. 2.3.2). Anders als in TEVC-Messungen konnten die hier verwendeten Glas-Mikroelektroden lediglich für eine einzige Messung verwendet werden. Im Falle von Einzelkanal-Messungen an Oozyten wurde Quarzglas verwendet, da es deutlich bessere elektrische Eigenschaften besitzt und der Abdichtwiderstand zwischen Glas und Membran wesentlich höhere Werte annimmt als mit herkömmlichem Glas [L^EVIS &R^AE, 1993; N^UMBERGER

&DRAGUHN, 1996]. Für alle anderen Messungen wurde Borosilikatglas verwendet.

Nach Überführung der entsprechend vorbereiteten Zellen (s. 2.5.4) wurde eine Mikroelektrode vorbereitet, diese an den Elektrodenhalter/Vorverstärker („headstage“) luftdicht angeschlossen und ein geringer Überdruck angelegt, um eine Verschmutzung der Pipettenspitze beim Eintauchen in die Badlösung zu verhindern. Anschließend wurde die Elektrode in die die Zelle umgebende Badlösung eingetaucht und der Potentialabgleich zwischen Elektrode und Badlösung durchgeführt. Dann wurde der Kontakt zwischen Elektrodenspitze und Zelle hergestellt - bei Oozyten war es sogar nötig, so nah an die Zelle heranzufahren, dass man eine leichte Eindellung der Membran wahrnehmen konnte - und ein Unterdruck an die Pipette angelegt. Bei PC12 Zellen musste ein vergleichsweise hoher Unterdruck angelegt werden. In dieser on cell-Konfiguration wurden die kapazitiven Ströme, die aufgrund des Test-Spannungspulses (in der Regel 5 mV), der permanent an die Elektrode angelegt wurde, um den Abdichtwiderstand zu messen, und die von Kapazität des Glases und der Membrankapazität des Patches stammten, durch den Messverstärker kompensiert. Nach Erreichen eines ausreichend hohen seals („Gigaseal“, >1 GΩ, s. 1.6.3) musste, um in die whole cell-Konfiguration zu gelangen, ein hoher Spannungspuls (500 mV) angelegt werden, der die Membran zerstört („elektrischer Durchbruch“). Der dabei immer noch an die Elektrode angelegte Unterdruck war beim Durchbrechen der Membran hilfreich.

Nachvollzogen werden konnte das Durchbrechen der Membran im Falle von HEK293- bzw.

PC12-Zellen an einer spontanen Zunahme der kapazitiven Ströme, die nun vom Umladen der Membran der gesamten Zelle stammten. Sobald die Membran durchbrochen war, wurde der Pipetten-Unterdruck entfernt, die kapazitiven Ströme erneut mithilfe des Verstärkers kompensiert und anschließend die Zelle vorsichtig vom CoverSlip gelöst, um sie in der Messkammer vor den Perfusionsschlauch zu bringen, was mithilfe des Mikromanipulators geschah. Sodann wurde die Messung gestartet, indem die Zellmembran auf ein bestimmtes

Sollpotential (-70 bis -100 mV) geklemmt und die ATP-vermittelten P2X-Membranströme aufgezeichnet wurden.

Im Falle von Oozyten wurden Patch Clamp-Messungen in der outside out-Konfiguration ausgeführt. Dazu wurde nach Erreichen eines ausreichend hohen Abdichtwiderstandes die Zellmembran ebenfalls mit einem kurzzeitigen, hohen Spannungspuls durchbrochen.

Allerdings wurde dieser Vorgang dadurch gekennzeichnet, dass, im Gegensatz zu HEK293-/PC12-Zellen, der vom Verstärker gemessene Widerstand spontan wieder auf etwas mehr als den ursprünglichen, reinen Elektrodenwiderstand absank, da nun der Widerstand der Oozyte gemessen wird, der aufgrund der Größe der Zelle < 1MΩ ist. Somit wird nach Durchbruch der Oozytenmembran praktisch nur noch der Pipettenwiderstand gemessen. Anschließend wurde die Elektrode vorsichtig von der Oozyte weggezogen, um ein Stück Membran (Patch) aus der Oozyte herauszuziehen. Dieses schließt sich über der Pipettenöffnung derart, dass die Außenseite der Membran in Richtung Badlösung zeigt und die Innenseite der Membran in Richtung Pipetteninneres. Dieser Vorgang konnte durch ein erneutes Ansteigen des Widerstandes nachvollzogen werden, der dann Werte bis zu 50 GΩ erreichte (bei Verwendung von Quarzglas). Die nun auch hier auftretenden, jedoch deutlich geringeren kapazitiven Ströme wurden kompensiert, der Unterdruck von der Pipette entfernt und der Patch in der Messkammer direkt vor den Perfusionsschlauch gebracht. Der Patch wurde auf ein Sollpotential von -100 mV (Einzelkanal-Messungen) bzw. -60 mV (makroskopische Ströme) geklemmt und die Messung gestartet.

Auch hier war der Messverstärker über einen A/D-D/A-Wandler mit einem Personal Computer verbunden, wodurch es möglich war, die Steuerung der einzelnen Messparameter über den PC durchzuführen und die Messgrößen direkt abzuspeichern. Die Filterfrequenz betrug 1,5 kHz, die Messdaten wurden mit 10 kHz (100 µs) digitalisiert.

Sämtliche Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.