P-S7 kn Mäuse zeigten im Alter eine progressive Steigerung von Glomerulo-

Um altersprogressive Veränderungen zwischen P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Geschwistertieren zu detektieren, wurde die Glomeruli-Morphologie von Mäusen im Alter von 2 Monaten mit dem glomerulären Erscheinungsbild von Mäusen im Alter von 9 Monaten verglichen.

Bei der lichtmikroskopischen Betrachtung der PAS-gefärbten Nierenschnitte von 2 Monate alten Mäusen (sowohl P-S7 kn als auch Smad7^flox/flox) konnten keine offensichtlichen Unterschiede der Morphologie der Glomeruli festgestellt werden. Es waren vermehrt Glomeruli mit einem locker erscheinenden Kapillarkonvolut sichtbar, während dunkel gefärbte (PAS-positive) sklerotische Bereiche innerhalb der Glomeruli nur sehr vereinzelt sichtbar waren (Abb. 28A, links). Die PAS-gefärbten Nierenschnitte von 9 Monate alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Mäusen zeigten offensichtliche Veränderungen im Vergleich zu jungen Tieren. Es war deutlich zu erkennen, dass die Glomeruli alter Tiere erheblich dunkler gefärbt waren und wesentlich weniger aufgelockert erschienen (Abb. 28A, rechts). Anhand des Vergleichs von 9 Monate alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Kontrollen wurde zusätzlich festgestellt, dass es innerhalb von P-S7 kn Mäusen zu einer weiteren Verschlechterung der glomerulären Morphologie kam. Der Anteil der dunkel gefärbten sklerotischen Fläche nahm hier nochmal deutlich zu (Abb. 28A, rechts oben vs. rechts unten).

Die semi-quantitative Auswertung der PAS-Färbungen erfolgte durch die Bestimmung des sog. Sklerose Indexes. Der Vergleich der jungen 2 Monatstiere ergab eine tendenzielle Steigerung der sklerotischen Flächen innerhalb der Glomeruli von P-S7 kn Mäusen (Abb. 28B). Als Sklerose Index für 2-monatige P-S7 kn Tiere wurde ein Wert von 1,46 ± 0,11 ermittelt, der damit höher lag als der Sklerose Index der Smad7^flox/flox-Kontrollmäuse, der einen Wert von 1,19 ± 0,11 lieferte.

Beim Vergleich der Glomerulosklerosen in jungen Tieren mit denen in 9-monatigen Mäusen konnte festgestellt werden, dass alte Tiere jeweils einen deutlichen Anstieg von Glomerulosklerosen aufwiesen. Der Sklerose Index von alten P-S7 kn Tieren ergab einen Wert von 2,54 ± 0,06 und zeigte dadurch eine hoch signifikante Steigerung der sklerotischen Areale im Vergleich zu jungen P-S7 kn Mäusen (Abb. 28B). Entsprechende Ergebnisse wurden durch den Vergleich von jungen und alten Smad7^flox/flox-Mäusen erzielt. Der ermittelte Sklerose-Index von 9-monatigen Smad7^flox/flox-Tieren stieg hier auf einen durchschnittlichen Wert von 2,17 ± 0,08, dessen Steigerung sich, vergleichen mit jungen Tieren, als hoch signifikant herausstellte (Abb. 28B). Interessanterweise zeigte der Vergleich von alten Smad7^flox/flox-Kontrollmäusen mit 9 Monate alten P-S7 kn Tieren eine signifikante Erhöhung des Sklerose-Indexes. Hierdurch konnte festgehalten werden, dass alte P-S7 kn Mäuse eine

eindeutige altersprogressive Verschlechterung der Glomeruli-Morphologie aufwiesen, als entsprechende gleichaltrige Smad7^flox/flox-Geschwistertiere (Abb. 28B).

Abb. 28: Im Alter zeigten P-S7 kn Mäuse eine zusätzliche Verstärkung von Glomerulosklerose.

Analysiert wurden PS7 kn und Smad7^flox/flox-Kontrollnieren im Alter von 2 und 9 Monaten. (A) Ausschnitt eines PAS-gefärbten Nierenschnitts. (B) Semi-quantitative Bestimmung des Sklerose Indexes anhand einer graduellen Einteilung von 0 – 4 der sklerotischen Fläche innerhalb der Glomeruli. 0 = keine Sklerose; 1 = < 25%;

2 = 25 – 50 %; 3 = 50 -75 %, 4 = > 75 %. n≥3; Mittelwert ± SD; *: p<0,05; **:p<0,001; Messbalken: 50 µm.

Weiterführende Untersuchungen erfolgten durch die Bestimmung der relativen GBM-Dicke und der Fußfortsatz-Frequenz anhand von TEM-Bildern.

Die Ergebnisse für den Vergleich von jungen P-S7 kn und den entsprechenden Kontrolltieren wurden bereits in der Phänotypanalyse (Punkt 5.3.2.1; Abb. 23C, D) beschrieben.

Aus diesem Grund wird im Folgenden nur auf den Vergleich zwischen jungen und alten Tieren eingegangen.

Die ultrastrukturelle Betrachtung der Glomeruli von 9 Monate alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox -Mäusen zeigte im Vergleich zu den entsprechend jüngeren Tieren deutliche strukturelle Veränderungen der GBM. Die GBM ließ auf den Aufnahmen eine deutliche Verbreiterung, die

vor allem die Lamina densa betraf, erkennen. Gleichzeitig verloren die einzelnen Fußfortsätze der Podozyten ihre regelmäßige Verteilung (Abb. 29A). Die einzelnen Fußfortsätze zeigten dabei zum einen eine Verbreitung, zum anderen ging die strukturierte Organisation verloren.

Abb. 29: Im Alter zeigten P-S7 kn Mäuse eine zusätzliche Verstärkung von Foot Process Effacement, während sich die Beschaffenheit der GBM nicht zusätzlich verschlechtert.

Analysiert wurden PS7 kn und Smad7^flox/flox-Kontrollnieren im Alter von 2 und 9 Monaten. (A) Ausschnitt einer TEM-Aufnahme der GBM. (B, C) Histologische Auswertung durch Vermessung der relativen GBM Dicke (B) und die Bestimmung der Fußfortsatz-Frequenz (C). n≥3; Mittelwert ± SD; *: p<0,05; Messbalken: 100 nm

Die Bestimmung der relativen Dicke der GBM ergab, dass es sowohl in 9 Monate alten P-S7 kn als auch in Smad7^flox/flox-Mäusen zu einer eindeutigen und signifikanten Steigerung der relativen GBM-Dicke im Vergleich zu den jungen Mäusen kam. Die relative GBM-Höhe von P-S7 kn Mäusen betrug 237,16 ± 17,94 nm, während für die glomeruläre Smad7^flox/flox -Basalmembran eine relative Dicke von 252,99 ± 23,05 nm gemessen wurde (Abb. 29B). Die Verdickung der GBM von P-S7 kn Mäusen im Vergleich zu jungen Tieren betrug dabei ca.

42 %. Durch den Vergleich von alten und jungen Smad7^flox/flox-Tieren konnte eine durchschnittliche Erhöhung der GBM-Dicke von ca. 52 % ermittelt werden (Abb. 29B).

Zwischen den jeweils 9 Monate alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Geschwistermäusen konnten keine statistisch relevanten Unterschiede ausgemacht werden.

In einem nächsten Schritt wurde die Fußfortsatz-Frequenz quantifiziert. Es zeigte sich, dass es bei 9 Monate alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Mäusen jeweils zu einer Verminderung des Frequenzwertes im Vergleich zu den Werten der entsprechenden jungen Tiere kam (Abb. 29C). Demzufolge konnte gezeigt werden, dass im altersprogressiven Verlauf morphologische Veränderungen in Form von Foot Process Effacement begonnen hatten.

9 Monate alte P-S7 kn Mäuse lieferten dabei den niedrigsten Wert von 1,63 ± 0,05 ^?

@A und zeigten eine signifikante Reduktion der Anzahl der Fußfortsätze pro GBM-Länge im Vergleich zu 2-monatigen P-S7 kn Tieren. Der Frequenz-Wert von alten Smad7^flox/flox-Mäusen betrug 2,03 ± 0,20 ^?

@A und lag damit ebenfalls unterhalb der entsprechenden jungen Smad7^flox/flox -Kontrollgruppe. Diese Verschlechterung der Fußfortsatz-Frequenz erwies sich zwar nicht als signifikant, deutete aber dennoch auf ein beginnendes Foot Process Effacement hin.

Interessant war allerdings, dass durch den Vergleich der 9 Monate alten P-S7 kn Mäuse mit 9-monatigen Smad7^flox/flox-Geschwisterkontrollen eine signifikante Verschlechterung der Fußfortsatz-Frequenz gezeigt werden konnte und damit einen eindeutigen Hinweis lieferte, dass ein Fehlen von Smad7 zu einer Verstärkung von Foot Process Effacement Prozessen innerhalb der Glomeruli führte.

5.4.2 P-TR2 kn Mäuse zeigten im Alter vergleichbare Glomerulosklerosen und Foot