Analyse der mRNA Transkription von Smad7 bzw. des TGF-β RII

Neben dem genomischen Nachweis der erfolgreichen Rekombination ist eine Analyse des Transkriptoms des Gewebes von besonderem Interesse. Für die Bestätigung eines funktionellen Knockouts war der nächste Schritt der Nachweis, dass die Cre-vermittelte Rekombination tatsächlich zu einer fehlenden Smad7 bzw. TGF-β RII mRNA Expression in den Podozyten der beiden Mauslinien führte. Dies wurde mittels semi-quantitativer RT-PCR oder quantitativer real time RT-PCR untersucht.

Für die Gewinnung von Gesamt-RNA Proben dienten zum einen isolierte Glomeruli und zum anderen primäre Podozyten aus P-S7 kn, P-TR2 kn und den entsprechenden Kontroll-mäusen.

5.2.2.1 Reduktion der Smad7 mRNA Expression

Der Nachweis einer verminderten Smad7 mR Glomeruli RNA-Proben mit

Auswertung wurde die Expression von Smad7 relativ zur GAPDH Zusätzlich wurde die relative Expression von Synaptopodin (als Podozyten um sicherzustellen, dass Expressionsveränderungen nicht

eingesetzten Podozyten-Zahlen verursacht wurden

Als Folge der Cre-vermittelten Deletion der gefloxten Smad7 Sequenz konnte eine Reduktion der Smad7 mRNA innerhalb der Glomeruli von P

zu den Kontrolltieren, detektiert werden ( (Abb. 12A). Die Bestimmung der Expressio

Abb. 12: Der Podozyten-spezifische Knockout führte zu einer (A; B) Quantitative real time

RT-isolierten Glomeruli von P-S7 kn und Kontrollmäusen. (C) Repräsentative semi Smad7 mit RNA/cDNA aus primären Podozyten von P

Auswertung der semi-quantitativen

Reduktion der Smad7 mRNA Expression in P-S7 kn Mäusen

Der Nachweis einer verminderten Smad7 mRNA Expression in P-S7 kn Mäusen Proben mit Hilfe von semi-quantitativen RT-PCRs

Auswertung wurde die Expression von Smad7 relativ zur GAPDH-Expression er Zusätzlich wurde die relative Expression von Synaptopodin (als Podozyten

um sicherzustellen, dass Expressionsveränderungen nicht durch Unterschiede Zahlen verursacht wurden.

vermittelten Deletion der gefloxten Smad7 Sequenz konnte eine Reduktion der Smad7 mRNA innerhalb der Glomeruli von P-S7 kn Mäusen um ca. 50

zu den Kontrolltieren, detektiert werden (Smad7

flox/flox

: 1 ± 0,16,

P-. Die Bestimmung der Expressionslevel von Synaptopodin zeigte keine zwischen den Glomeruli-Proben aus P

1 ± 0,10, P-S7 kn: 0,94 ± 0,13)(Abb. 12B). Die Verringerung der Smad7 Expression wurde somit als eine Folge des Podozyten-spezifischen Knocko gewertet, die nicht durch unterschiedliche Podozyten-Mengen verursacht wurde.

spezifische Knockout führte zu einer Reduktion der Smad7 -PCR Analysen von Smad7 (A) und Synaptopodin (B) und Kontrollmäusen. (C) Repräsentative semi-quantitative RT

Smad7 mit RNA/cDNA aus primären Podozyten von P-S7 kn und Kontrollmäusen. (D) Densitometrische RT-PCR Analysen. n≥3; Mittelwert ± SD; *: p<0,05.

S7 kn Mäusen

S7 kn Mäusen wurde an analysiert. Für die Expression errechnet.

Zusätzlich wurde die relative Expression von Synaptopodin (als Podozyten-Marker) ermittelt, durch Unterschiede der

vermittelten Deletion der gefloxten Smad7 Sequenz konnte eine Reduktion S7 kn Mäusen um ca. 50 %, im Vergleich und Kontrollmäusen. (D) Densitometrische

Diese q RT-PCR Daten aus Glomeruli primären Podozyten mittels semi

Smad7 spezifischen Primern sollte hierbei ein 809 bp langes DNA werden. Die entsprechende Bande

Smad7

TGF-β RII^flox/flox-Mäusen analysiert, um nachzuweisen, dass die erfolgte Rekombination in P-TR2 kn Glomeruli auf mRNA

Abb. 13: Der Podozyten-spezifische Knockout führte zu eine (A; B) Quantitative real time RT-PCR Analysen

isolierten Glomeruli von P-TR2 kn

TGF-β RII (C) und WT-1 (D) mit RNA/cDNA aus Mittelwert ± SD; *: p<0,05.

aus Glomeruli konnten durch die Analyse der RNA/cDNA Proben mittels semi-quantitativer RT-PCR bestätigt werden. Mit Hilfe von mad7 spezifischen Primern sollte hierbei ein 809 bp langes DNA-Fragment amplifiziert

entsprechende Bande für Smad7 wurde jeweils in primären Podozyten n detektiert, während P-S7 kn Podozyten kein oder

Signal lieferten (Abb. 12C). Die anschließende densitometrische im Vergleich zu Smad7

flox/flox

-Zellen eine Reduktion der Smad7 mRNA innerhalb der primären P-S7 kn Podozyten um ca. 87 % (Abb.

Reduktion der TGF-β RII mRNA Expression in P-TR2 kn Mäusen

In parallelen Untersuchungen wurden die Expressionslevel des TGF-β RII in P

n analysiert, um nachzuweisen, dass die erfolgte Rekombination in kn Glomeruli auf mRNA-Ebene zu einer Reduktion der TGF-β RII Expression führte

spezifische Knockout führte zu einer Reduktion der TGF-β PCR Analysen von TGF-β RII (A) und Synaptopodin (B) TR2 kn und Kontrollmäusen. (C; D) Quantitative real time

RNA/cDNA aus primären Podozyten von P-TR2 kn und Kontrollmäusen

konnten durch die Analyse der RNA/cDNA Proben aus PCR bestätigt werden. Mit Hilfe von Fragment amplifiziert in primären Podozyten aus kein oder nur ein sehr C). Die anschließende densitometrische eine Reduktion der Smad7 mRNA

Mittels quantitativer real time RT-PCR wurde gezeigt, dass das Expressionsniveau der TGF-β RII mRNA innerhalb der Glomeruli von P-TR2 kn Mäusen im Vergleich zu TGF-β RII^flox/flox-Tieren bei nur ca. 40 % lag, (Abb. 13A; TGF-β RII^flox/flox: 1,0 ± 0,29;

P-TR2 kn: 0,39 ± 0,09). Die jeweiligen Glomeruli-RNA-Proben wiesen jedoch eine gleiche Expression für Synaptopodin auf (TGF-β RII^flox/flox: 1,0 ± 0,16; P-TR2 kn: 0,92 ± 0,17), wodurch der Einsatz von unterschiedlichen Podozyten-Mengen ausgeschlossen werden konnte (Abb. 13B).

Anhand der quantitativen real time RT-PCR Analysen der primären Podozyten konnte zusätzlich bestätigt werden, dass es in P-TR2 kn Podozyten zu einer weiteren Reduktion der TGF-β RII mRNA kam. In P-TR2 kn Podozyten konnte eine deutliche Reduktion der TGF-β RII Expression um ca. 75 % im Vergleich zu Kontrollzellen detektiert werden (Abb. 13C). Die Analyse der WT-1 Expression ergab wiederum ein gleiches Expressions-niveau (TGF-β RII^flox/flox: 1,0 ± 0,19; P-TR2 kn: 1,04 ± 0,09) und zeigte, dass vergleichbare Mengen an Podozyten eingesetzt wurden (Abb. 13D).

Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die zuvor auf DNA-Ebene bestätigte Deletion der gefloxten Sequenzen in P-S7 kn und P-TR2 kn Mäusen zu einer verminderten Transkription von Smad7 bzw. des TGF-β RII führte. Außerdem erfolgte die Bestätigung, dass diese reduzierte Expression durch den Knockout innerhalb der Podozyten hervorgerufen wurde.