In vitro Untersuchungen von TGF-β induzierbaren Proteinen

Nach der erfolgreichen Etablierung der primären in vitro Podozytenkulturen (Punkt 5.1), lag im nächsten Schritt der Fokus auf den funktionellen Veränderungen, die durch den jeweils modifizierten TGF-β Signalweg hervorgerufen werden. Dazu wurden die Expressionsmuster von PAI-1 (Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1) und CTGF (Connective Tissue Growth Faktor) innerhalb der jeweiligen Knockout-und Kontrollpodozyten analysiert. PAI-1 und CTGF gelten als charakteristische Reporterproteine, deren Expression durch die Aktivierung des TGF-β Signalwegs induziert wird.

5.5.1.1 P-S7 kn Podozyten zeigten in vitro eine verstärkte Induktion von PAI-1 und CTGF

Nach der Herstellung von primären P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Podozyten wurden die Zellen nach einer 24-stündigen Kultivierung unter serumfreien Bedingungen mit 2 ng/ml rekombinantem TGF-β1 behandelt.

Die immunzytochemischen Färbungen von PAI-1 zeigten in allen primären Zellen ein Fluoreszenz-Signal im Zytoplasma der Podozyten. Unbehandelte P-S7 kn und Smad7^flox/flox -Podozyten wiesen dabei lediglich eine sehr geringe Basalexpression von PAI-1 auf (Abb. 32, oben).

Abb. 32: P-S7 kn Podozyten zeigten nach TGF-β1 Behandlung eine verstärkte PAI-1 Expression.

Immunzytochemische Färbung von PAI-1 in primären P-S7 kn und Smad7^flox/flox Podozyten. Die primären Zellen wurden für 24 h mit 2 ng/ml rekombinantem TGF-β1 behandelt. Als Kontrolle dienten Zellen mit serumfreien Medium. Beide Zelltypen zeigten eine Induktion von PAI-1 nach TGF-β1 Behandlung, welche in P-S7 kn Podozyten weiter verstärkt wurde. Rot: PAI-1; Grün: Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm

In TGF-β1 behandelten primären Podozyten aus P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Mäusen konnte eine deutliche Steigerung des PAI-1 Signals detektiert werden. Demzufolge konnte hierdurch eine TGF-β1-induzierte Expressionserhöhung von PAI-1 bestätigt werden (Abb. 32, oben).

P-S7 kn Podozyten zeigten dabei nach der Behandlung das stärkste Signal, das zeigte, dass hier die PAI-1 Expression zusätzlich angehoben wurde.

Die anschließende Analyse der Induzierbarkeit von CTGF lieferte entsprechend vergleichbare Ergebnisse. Auch hier konnte in allen Zellen ein Fluoreszenz-Signal für CTGF detektiert werden, das sich im gesamten Zytoplasma der Podozyten verteilte.

Abb. 33: P-S7 kn Podozyten zeigten nach TGF-β1 Behandlung eine verstärkte Expression von CTGF.

Immunzytochemische Färbung von CTGF in primären P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Podozyten. Die primären Zellen wurden für 24 h mit 2 ng/ml rekombinantem TGF-β1 behandelt. Als Kontrolle dienten Zellen mit serumfreien Medium. Beide Zelltypen zeigten eine Induktion von CTGF nach TGF-β1 Behandlung, welche in P-S7 kn Podozyten weiter verstärkt wurde. Rot: CTGF; Grün: Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm

Unbehandelte primäre P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Podozyten wiesen erneut eine relativ geringe basale Expression von CTGF auf, die in P-S7 kn Podozyten leicht erniedrigt schien (Abb. 33, obere Reihen). Eine Induktion von CTGF konnte durch die Behandlung mit 2 ng/ml TGF-β1 sowohl in Smad7^flox/flox- als auch in P-S7 kn Podozyten erzielt werden. Diese gesteigerte Expression von CTGF wurde in P-S7 kn Podozyten allerdings zusätzlich verstärkt. Dementsprechend konnte auch hier bestätigt werden, dass die Desinhibierung des TGF-β Signalwegs in P-S7 kn Podozyten dazu führte, dass es zu einer Verstärkung der induzierten Expression von typischen TGF-β Reporterproteinen, wie CTGF, kam.

Während der Analyse konnte eine weitere interessante Feststellung gemacht werden. Es war deutlich zu erkennen, dass P-S7 kn Podozyten eine deutlich schwächere Synaptopodin-Färbung aufwiesen, als Smad7^flox/flox-Podozyten (Abb. 32; Abb. 33). Demnach schien sich ein Knockout von Smad7 negativ auf das Expressionsniveau von Synaptopodin auszuwirken.

5.5.1.2 P-TR2 kn Podozyten zeigten in vitro keine Induktion von PAI-1 und CTGF

Die oben genannten Experimente wurden parallel an primären P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Podozyten durchgeführt.

Unbehandelte primäre P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Podozyten wiesen auch hier eine sehr geringe basale Expression von PAI-1 auf.

Abb. 34: Primäre P-TR2 kn Podozyten zeigten nach TGF-β1 Behandlung keine Induktion von PAI-1.

Immunzytochemische Färbung von PAI-1 in primären P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Podozyten. Die primären Zellen wurden für 24 h mit 2 ng/ml rekombinantem TGF-β1 behandelt. Als Kontrolle dienten Zellen mit serumfreien Medium. Die durch TGF-β1 induzierte Expression von PAI-1 konnte lediglich in TGF-β RII^flox/flox -Podozyten beobachtet werden, während P-TR2 kn -Podozyten keine verstärkte Expression von PAI-1 aufwiesen.

Rot: PAI-1; Grün: Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm

Die Behandlung mit 2 ng/ml TGF-β1 führte bei diesem Experiment jedoch lediglich in TGF-β RII^flox/flox-Kontrollpodozyten zu einer gesteigerten Expression von PAI-1, während primäre P-TR2 kn Podozyten nach der Behandlung keine Induktion von PAI-1 aufwiesen (Abb. 34).

Die anschließende Analyse von CTGF bestätigte den oben genannten Befund, dass P-TR2 kn Podozyten nicht in der Lage waren, auf eine Behandlung mit TGF-β1 zu reagieren.

Abb. 35: Primäre P-TR2 kn Podozyten zeigten nach TGF-β1 Behandlung keine Induktion von CTGF.

Immunzytochemische Färbung von CTGF in primären P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Podozyten. Die primären Zellen wurden für 24 h mit 2 ng/ml rekombinantem TGF-β1 behandelt. Als Kontrolle dienten Zellen mit serumfreien Medium. Die durch TGF-β1 induzierte Expression von CTGF konnte lediglich in TGF-β RII^flox/flox -Podozyten beobachtet werden, während P-TR2 kn -Podozyten keine verstärkte Expression von CTGF aufwiesen.

Rot: CTGF; Grün: Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm

In unbehandelten primären P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Podozyten konnte eine basale Menge von CTGF detektiert werden. Durch die Behandlung mit TGF-β1 konnte die CTGF-Expression jedoch nur in TGF-β RII^flox/flox-Podozyten gesteigert werden. In P-TR2 kn Podozyten kam es zu keiner Induktion von CTGF, wodurch gezeigt werden konnte, dass der Knockout des TGF-β RII tatsächlich dazu führte, dass diese Zellen nicht auf eine Aktivierung des Signalwegs mit einer induzierten Expressionssteigerung von CTGF reagieren konnten (Abb. 35).

Die Auffälligkeit eines unterschiedlichen Expressionsniveaus von Synaptopodin, wie sie für P-S7 kn Podozyten beobachtet wurde, konnten in P-TR2 kn Podozyten nicht detektiert werden. P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Podozyten exprimierten vergleichbare Level von Synaptopodin (Abb. 35).