In vivo Untersuchungen von TGF-β induzierten Proteinen

Als Nächstes sollte überprüft werden, ob die erhobenen Daten der in vitro Experimente tatsächlich der in vivo Situation entsprachen. Infolgedessen wurden Gefrierschnitte von Knockout und Kontrolltieren angefertigt, um die beiden durch TGF-β induzierten Proteine PAI-1 und CTGF anhand von immunhistochemischen Färbungen zu untersuchen. Da die in vitro Ergebnisse bestätigten, dass eine Induktion von PAI-1 und CTGF durch die Aktivierung des TGF-β Signalwegs hervorgerufen wurde und dass es ohne die exogene Zugabe von TGF-β1 lediglich zu einer basalen Expression der beiden Proteine kam, wurden die Fluoreszenz-Färbungen jeweils an jungen und alten Knockout- sowie Kontrolltieren durchgeführt. Grund hierfür war, dass junge Tiere eher der Situation der in vitro Kontroll-behandlung entsprachen, während alte Tiere, bedingt durch Alterungsprozesse eher der TGF-β Behandlung entsprechen sollten.

5.5.2.1 P-S7 kn Glomeruli zeigten im Alter eine verstärkte Induktion von PAI-1 und CTGF

Die Betrachtung der Fluoreszenz-Färbungen verdeutlichte, dass die zuvor beobachteten in vitro Ergebnisse tatsächlich den in vivo Gegebenheiten in P-S7 kn und Smad7^flox/flox -Mäusen entsprachen.

Die PAI-1 Färbung konnte in allen Nierenschnitten detektiert werden. Ein Fluoreszenz-Signal wurde dabei überwiegend im Bereich der Glomeruli gefunden. Durch die Kolokalisation mit Synaptopodin konnte eine Expression von PAI-1i vor allem den Podozyten zugeschrieben werden.

Die Glomeruli von 2 Monate alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Kontrollmäusen wiesen jeweils eine sehr geringe und vergleichbare Expression von PAI-1 auf (Abb. 36, oben).

Im Vergleich zu den jungen Mäusen zeigten die Glomeruli beider 9-monatigen Tiere eine eindeutige Verstärkung des PAI-1-Signals (Abb. 36, unten). In 9 Monate alten P-S7 kn Mäusen kam es allerdings nochmals zu einer besonders deutlichen Vermehrung von PAI-1, im Vergleich zu gleichaltrigen Smad7^flox/flox-Kontrolltieren.

Abb. 36: Im Alter zeigten P-S7 kn Mäuse innerhalb der Glomeruli eine verstärkte Expression von PAI-1.

Fluoreszenz-Doppelfärbung von PAI-1 zusammen mit Synaptopodin an Gefrierschnitten von P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Kontrollnieren. Im Alter kam es zu einer verstärkten Expression von PAI-1, die in P-S7 kn Mäusen zusätzlich verstärkt wurde. Rot: PAI-1; Grün: Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm.

Entsprechend den Erwartungen konnten ähnliche Ergebnisse auch für die Färbung von CTGF aufgezeigt werden.

Eine CTGF-Färbung konnte sowohl innerhalb der Glomeruli als auch im Tubulus-System detektiert werden.

Abb. 37: Im Alter zeigten P-S7 kn Mäuse innerhalb der Glomeruli eine verstärkte CTGF-Expression.

Fluoreszenz-Doppelfärbung von CTGF zusammen mit Synaptopodin an Gefrierschnitten von P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Kontrollnieren. Im Alter kam es zu einer verstärkten Expression von CTGF, die in P-S7 kn Mäusen zusätzlich verstärkt wurde. Rot: CTGF; Grün: Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm.

In 2 Monate alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Kontrollmäusen zeigten die Glomeruli vergleichbare, relativ niedrige Level einer CTGF Expression (Abb. 37, oben). In Glomeruli der 9 Monate alten Tiere kam es zu einer Steigerung von CTGF, welche in Smad7^flox/flox -Kontrollmäusen jedoch nicht so stark war, wie die, der PAI-1 Expressionssteigerung. Der Vergleich von den jeweils alten P-S7 kn und Smad7^flox/flox-Tieren verdeutlichte erneut, dass es in P-S7 kn Mäusen zu einer deutlich erhöhten CTGF Expression kam (Abb. 37, oben).

Auffällig war außerdem, dass das veränderte Expressionsniveau von Synaptopodin, das die in vitro Podozyten-Färbungen bereits aufzeigten, ebenfalls innerhalb der Glomeruli der gefärbten Nierenschnitte beobachtet werden konnte. Sowohl junge wie auch alte P-S7 kn Glomeruli zeigten eine deutliche Reduktion der Synaptopodin Expression. Zusätzlich konnte eine weitere Verminderung in alten P-S7 kn Tieren detektiert werden (Abb. 36, grün).

5.5.2.2 P-TR2 kn Glomeruli zeigten im Alter keine Induktion von PAI-1 und CTGF

Die Analyse der PAI-1 Färbungen der P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Nieren bestätigte die vorherigen Untersuchungen, bei der PAI-1 vorwiegend im Bereich der Glomeruli, speziell in den Podozyten zu erkennen war.

Abb. 38: Im Alter zeigten P-TR2 kn Mäuse innerhalb der Glomeruli keine Induktion von PAI-1.

Fluoreszenz-Doppelfärbung von PAI-1 zusammen mit Synaptopodin an Gefrierschnitten von P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Kontrollnieren. Im Alter kam es zu keiner Induktion der Expression von PAI-1. Rot: PAI-1; Grün:

Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm.

Anhand von jungen 3 Monate alten P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Kontrolltieren konnte festgestellt werden, dass PAI-1 in den Glomeruli nur in relativ geringen Mengen exprimiert wurde (Abb. 38, oben). Die Betrachtung der alten, 9-monatigen TGF-β RII^flox/flox-Kontrollen zeigte eine detektierbare Erhöhung der PAI-1 Expression. An Fluoreszenz-Färbungen von alten P-TR2 kn Mäusen konnte diese PAI-1 Expressionssteigerung nicht beobachtet werden (Abb. 38, unten) und entsprach damit der fehlenden Induktion, wie sie in TGF-β1 behandelten primären P-TR2 kn Podozyten aufgezeigt wurde.

Der Befund, dass P-TR2 kn Podozyten nicht auf eine Aktivierung des TGF-β Signalwegs mit einer Induktion von typischen TGF-β Zielproteinen antworteten, konnte zusätzlich anhand von CTGF Fluoreszenz-Färbungen bewiesen werden.

Abb. 39 Im Alter zeigten P-TR2 kn Mäuse innerhalb der Glomeruli keine Induktion von CTGF.

Fluoreszenz-Doppelfärbung von CTGF zusammen mit Synaptopodin an Gefrierschnitten von P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Kontrollnieren. Im Alter kam es zu keiner Induktion der Expression von CTGF. Rot: CTGF; Grün:

Synaptopodin; Blau: DAPI; Messbalken: 50 µm.

Junge P-TR2 kn und TGF-β RII^flox/flox-Kontrollmäuse zeigten innerhalb der Glomeruli vergleichbare, relativ niedrige Level einer CTGF Expression (Abb. 39, oben). Der Vergleich mit 9 Monate alten TGF-β RII^flox/flox-Tieren machte deutlich, dass es im Alter zu einer erhöhten Expression von CTGF kam. Diese Expressionssteigerung blieb in Glomeruli von 9 Monate alten P-TR2 kn Mäusen aus (Abb. 39, unten).

Die Beobachtung einer veränderten Synaptopodin Expression innerhalb der Glomeruli der Smad7 Knockout-Linie konnte für die Rezeptor-Knockout-Mäuse nicht gezeigt werden. Hier kam es sowohl in P-TR2 kn als auch in TGF-β RII^flox/flox-Kontrolltieren zu jedem Zeitpunkt zu einer vergleichbaren Expression von Synaptopodin.