Als Folge des verwendeten gewebsspezifischen Cre-loxP-Systems sollte der Knockout jeweils nur in den Podozyten der Niere erfolgen. Da die Podozyten nur einen Bruchteil der Zellen in der gesamten Niere ausmachen, war das erste Versuchsvorhaben dieser Arbeit die Etablierung primärer Podozytenkulturen der jeweiligen Mauslinien.
Die primären Zellen sollten daraufhin zum einen der Verifizierung des Knockouts dienen, zum anderen sollten diese die Möglichkeit für weiterführende in vitro Analysen bieten, um die Auswirkungen des veränderten TGF-β Signalwegs in Podozyten genauer analysieren zu können.
Für die Herstellung der primären Podozyten-Zelllinien wurden die Glomeruli vom restlichen Nierengewebe getrennt. Die Isolierung der Glomeruli erfolgte durch die Perfusion der Nieren mit magnetischen Mikropartikeln. Durch die Embolisation dieser Partikel in den glomerulären Blutkapillaren und dem anschließenden zeitlich definierten Verdau der Nieren konnten die einzelnen Glomeruli durch magnetische Separation isoliert werden. Durch mehrmalige Wiederholung der Waschschritte und der lichtmikroskopischen Überprüfung des Waschüberstands wurde sichergestellt, dass weitgehend reine Glomeruli-Isolate in Zellkulturgefäße ausgesät und kultiviert wurden (Abb. 7A). Nach 3 – 5-tägiger Inkubation begannen die Podozyten mit der Auswanderung aus dem glomerulären Aggregat und siedelten sich am Boden der Zellkulturgefäße an (Abb. 7B).
Abb. 7: Isolierte primäre Podozyten zeigten eine charakteristische längliche und verzweigte Morphologie.
(A) Einzelne isolierte Glomeruli, die weitgehend ohne tubuläre Verunreinigungen ausgesät wurden. Im Inneren der Glomeruli waren deutlich die embolisierten magnetischen Mikropartikel zu erkennen (vergrößerter Ausschnitt).
(B) Nach 3-5 Tagen begannen die Podozyten aus dem glomerulären Aggregat auszuwandern. (C) Konfluenter Podozytenrasen mit charakteristisch länglichen und verzweigten Podozyten. (D) Primäre Tubulus-Zellen als Vergleichskontrolle.
Um Kontaminationen mit Fremdzellen zu verringern, erfolgte ein zusätzlicher Siebschritt durch ein 40 µm Zellsieb, der die inneren mesangialen Kerne der Glomeruli von den bereits vereinzelten Podozyten trennen sollte. Nach einer ca. 7-tägigen Inkubation wurde meist ein konfluenter Zellrasen aus primären Zellen in den Kulturgefäßen beobachtet (Abb. 7C).
Um die erhaltenen Zellen als Podozyten zu identifizieren, wurde zuerst das morphologische Erscheinungsbild beurteilt. Die Zellen wiesen eine längliche Form mit vielen radiär vom Zellkörper abzweigenden Zellfortsätzen auf (Abb. 7C), die sich deutlich von den primären Zellen, die aus dem Waschüberstand gewonnen wurden, unterschied. Die Tubulus-Zellen waren rund geformt und zeigten einen stark epithelialen Charakter (Abb. 7D).
Demnach konnte für die aus den Glomeruli isolierten primären Zellen eine typische podozytäre Zellmorphologie nachgewiesen werden.
Die molekulare Charakterisierung der primären Zellen erfolgte durch quantitative real time RT-PCRs. Hierbei wurden die Expressionslevel (relativ zur Expression von Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, GAPDH) der spezifischen Podozyten-Marker Synaptopodin und WT-1 (Wilms-Tumor-Protein 1) innerhalb der primären Podozyten mit den jeweiligen Expressionslevel der primären Tubulus-Zellen verglichen.
Abb. 8: Primäre Podozyten exprimierten typische Podozyten-Marker wie Synaptopodin und WT-1.
(A, B) Quantitative real time RT-PCR Analysen von Synaptopodin bzw. WT-1 als Podozyten-Marker anhand von RNA/cDNA-Proben aus isolierten primären Podozyten und Tubulus-Zellen als Kontrolle. (C) Western Blot Analysen von WT-1 anhand von Gesamtproteinextrakten. Die Detektion einer spezifischen Bande für WT-1 erfolgte auf einer Höhe von ~52 kDa. Die Coomassie-Färbung diente als Ladungskontrolle. n≥3; Mittelwert ± SD;
*: p<0,05.
Diese Charakterisierung der isolierten Zellen zeigte eine starke Expression von Synaptopodin und WT-1 in den primären Podozytenkulturen, während diese Marker in den Kontrollzellen kaum detektierbar waren. Die Bestimmung des Expressionsunterschieds zeigte, verglichen zu den Kontrollen, in primären Podozyten eine ≥ 6-fache Erhöhung der Synaptopodin-Expression (Abb. 8A; PrimPodo: 6,25 ± 1,65; Tubulus: 1 ± 0,36). Die Analyse der WT-1 Expression ergab bei den primären Podozyten im Vergleich zu den Kontrollen eine mehr als 50-fach erhöhte WT-1 Expressionsrate. (Abb. 8B; PrimPodo: 50,1 ± 4,23; Tubulus:
1 ± 0,31).
Um Kontaminationen der Primärkulturen mit Endothel-Zellen auszuschließen, wurden die Zellen auf die Expression des Endothel-Markers CD 31 (Cluster of differentiation Faktor 31)
getestet. Diese Analyse ergab weder in den isolierten Podozyten noch in den tubulären Kontrollzellen eine Detektion von CD 31 (Daten nicht gezeigt). Hierdurch erwiesen sich die hergestellten primären Zellen jeweils als Endothelzell-frei.
Die real time RT-PCR Daten konnten anschließend auf Protein-Ebene durch Western Blot Analysen bestätigt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Gesamtprotein-Extrakte aus primären Podozyten eine deutliche und starke Bande für WT-1 auf der Höhe von 52 kDa lieferten, während in den primären Tubulus-Zellen WT-1 kaum detektierbar war (Abb. 8C).
Immunhistochemische Analysen zeigten, dass die überwiegende Mehrheit der Zellen ein deutliches WT-1 Fluoreszenz-Signal aufwies (Abb. 9A, oben). Eine spezifische Färbung für diesen Transkriptionsfaktor wurde im Bereich des Zellkerns sichtbar und ermöglichte hierdurch eine eindeutige Identifikation aller WT-1 positiven Zellen als Podozyten.
Abb. 9: Primäre Zellkulturen zeigten überwiegend WT-1 positive Podozyten mit geringen Verunreinigungen von α-SMA positiven Mesangial-Zellen.
(A) Immunzytochemische Färbung von WT-1 als Podozyten-Marker an primär angelegten Podozytenkulturen. Es zeigte sich eine deutliche Überzahl an WT-1 positiven Zellen. Die Pfeile der unteren Reihe zeigen WT-1 negative Zellen bei höherer Vergrößerung. (B) Immunzytochemische Färbung von Synaptopodin als Podozyten-Marker und α-SMA als Mesangial-Marker zur genaueren Charakterisierung der Zell-Verunreinigungen.
Bei genauerer Betrachtung wurde jedoch festgestellt, dass nicht alle Zellen eine WT-1 Färbung enthielten. Diese Beobachtung machte deutlich, dass die hergestellten Zellkulturen keine absoluten Reinkulturen darstellten, sondern zu geringen Anteilen Verunreinigungen mit Fremdzellen aufwiesen (Abb. 9A, unten). Da vermutet wurde, dass es sich bei den Kontaminationen um Mesangial-Zellen handelte, sollten diese Zellen anhand von Fluoreszenz-Färbungen mit einem spezifischen Antikörper gegen α-SMA (α-smooth muscle actin; charakteristischer Mesangial-Marker) näher bestimmt werden. Bei dieser Untersuchung diente die Doppelfärbung mit Synaptopodin der Identifikation der Podozyten.
Die Analyse unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ergab, dass beide Fluoreszenz-Signale (für Synaptopodin und α-SMA) detektierbar waren. Das entsprechend grüne Signal für α-SMA fiel allerdings insgesamt deutlich schwächer aus. Es konnte schließlich gezeigt werden, dass jeweils Synaptopodin-negative Zellen eine Färbung für α-SMA enthielten und entsprechend umgekehrt (Abb. 9B). Somit konnte festgehalten werden, dass es sich bei den enthaltenen Fremdzellen um geringe Kontaminationen mit Mesangial-Zellen handelte.
Die anschließende Quantifizierung der WT-1/Synaptopodin positiven Zellen im Vergleich zur Gesamtzellzahl ergab, dass die hergestellten primären Podozytenkulturen durchschnittlich eine Reinheit von > 86 % aufwiesen.
Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass erfolgreich angereicherte primäre Podozyten-kulturen etabliert wurden, die sich für weiterführende in vitro Experimente eigneten.