Optische Dichtemessung der GABA A -Rezeptoruntereinheiten

Zur Übersicht wurden zunächst histologische Aufnahmen in 40facher Vergrößerung angefertigt. Dabei wurde aus mehreren Einzelaufnahmen ein so genanntes Panoramabild (Multiple Image Alignment = MIA) eines Hirnschnitts erzeugt. Als Bildanalysesoftware diente das Programm cellSense (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland). Die Erstellung der Bilder fand mit freundlicher Unterstützung von Frau Professor Dr. C. Grothe und Frau I. Kalve statt (Institut für Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover).

Die Analyse der optischen Dichte der GABAA-Rezeptoruntereinheiten erfolgte mittels eines computerbasierten Bildanalysesystems bestehend aus einem Axioskop-Mikroskop mit einer Plan-Neofluar Linse (Zeiss, Deutschland), einer digitalen Farbkamera (CCD, Axiocam, Zeiss, Göttingen, Hallbergmoos, Deutschland) sowie einem Computer mit einem Pentium III-Rechenprozessor, welcher mit einem Bildgrabber ausgestattet war (V7-Mirage, Spea, USA). Als Bildanalysesoftware diente das Programm Axiovision 4.6 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen).

Die Gehirnschnitte wurden bei 100facher Vergrößerung ausgewertet. Es wurden Messungen der optischen Dichte in verschiedenen Regionen der Basalganglien

Material und Methoden

durchgeführt: im Striatum, der SNr, der SNc, dem STN, dem GP sowie dem PPN, der als einziger Kern nicht zu den Basalganglien gehört, aber mit ihnen reziprok verbunden ist. Die Messung erfolgte dabei in Feldern von je 38.321,06 µm². Die Anzahl der Felder war abhängig von Größe und Einteilung der Region in verschiedene Subregionen. Die Größe eines Bildes lag bei 1300 x 1030 Pixel.

Zunächst wurden die Grauwerte der Pixel erfasst und diese danach in optische Dichte-Werte umgerechnet. Das System der Grauwertmessung wurde mit einem Standard kalibriert (Calibration of Step Tablet No. 507ST101, Eastman Kodak Company, USA). Der Standard enthielt 20 verschiedene Stufen von weiß bis schwarz. Die mit Hilfe des Programms Axiovision gemessenen Grauwerte wurden mit denen vom Hersteller angegebenen Werten für die optische Dichte in Beziehung gesetzt um eine mathematische Gleichung zu ermitteln. Um Messschwankungen zu vermeiden wurde ein Mittelwert der Grauwerte des Standards aus drei verschiedenen Messreihen an drei unterschiedlichen Tagen verwendet. Die Mittelwerte und die zugehörigen Werten der optischen Dichte wurden in Beziehung gesetzt und graphisch dargestellt (s. Abb. 16, Wertetabelle s. Anhang).

Eichkurve

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

Grauwerte [grey]

Optische Dichte

Abb. 16: Grauwerteichung durch den Kodak Standard 507ST101

Danach erfolgte die Erstellung der mathematischen Funktion, die der Umrechnung der Grauwerte in Werte der optischen Dichte diente:

Material und Methoden

Optische Dichte (OD)= 10 0,13667-0,0001077*B2

B2 = gemessener Grauwert

Die Beleuchtungsstärke des Mikroskops wurde während der gesamten Messung konstant gehalten. Um exakte Grauwerte zu erhalten, erfolgte vor Beginn jeder Messung eine 2 h lange Aufwärmphase der Kamera, da die Temperatur dieser bedeutsam für das Signal-Rausch-Verhältnis ist und damit einen Einfluss auf die Messparameter hat (WILLEMSE et al. 1993). Durch eine so genannte „Shading correction“ konnten die eingelesenen Bilder auf optische Distorsion korrigiert und Unregelmäßigkeiten der Helligkeit ausgeglichen werden. Für letzteres wurde ein Bild eines freien Bereiches des Objektträgers (Hellfeld-Hintergrund) eingelesen und von den gemessenen Bildern subtrahiert.

Die Unterscheidung des positiven Signals der angefärbten GABAA -Rezeptoruntereinheiten vom Hintergrundsignal erforderte die Messung einer Kontrollregion in den Hirnschnitten jedes einzelnen Tieres, in der keine Expression der jeweiligen Untereinheit stattfindet. In die Auswertung wurden nur diejenigen Pixel einbezogen, welche eine optische Dichte über dem Kontrollwert aufwiesen. In Abhängigkeit des Verteilungsmusters der angefärbten Untereinheit, sowie der untersuchten jeweiligen Region wurden verschiedene Kontrollregionen gewählt. Jede Kontrollregion pro Tier bestand aus mindestens drei Feldern, in denen der Grauwert der Pixel gemessen wurde. Anschliessend wurden diese Grauwerte in optische Dichte-Werte umgerechnet und ein Mittelwert aus den drei Werten erstellt. Dieser Mittelwert konnte danach von den Werten der optischen Dichte, die in der interessierenden Region desselben Tieres erhalten wurden, abgezogen werden.

Eine Übersicht der verwendeten Kontrollregionen und der untersuchten Regionen pro Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten α1, α2, α3, α4, β2/3, γ2 und δ zeigt Tabelle 4. Da die Färbungen der beiden GABAA-Rezeptoruntereinheiten α2 und γ2 nicht auswertbar waren, sind hierfür in Tabelle 4 keine Angaben vorhanden (s.

5.2.5.).

Material und Methoden

Angefärbte Untereinheit des GABAA-Rezeptors

Untersuchte Hirnregion

Kontrollregion für die untersuchte Hirnregion

α1 Striatum 3 Felder weiße Substanz im Striatum SNr 10 Purkinjezellen des Cerebellums STN 3 Felder weiße Substanz im Striatum

GP 3 Felder weiße Substanz im GP PPN 3 Felder weiße Substanz im Striatum

α2 - -

α3 Striatum 3 Felder weiße Substanz im Striatum

SNr „

SNc „

STN „

GP „

PPN

α4 Striatum „

SNr „

STN „

GP „

β2/3 Striatum 3 Felder weiße Substanz im Striatum

SNr „

STN „

GP „

PPN „

γ2 - -

δ Striatum 3 Felder weiße Substanz im Striatum

SNr „

STN „

Material und Methoden

GP 3 Felder weiße Substanz im Striatum

Tab. 4: Übersicht der verwendeten Kontrollregionen und der untersuchten Regionen für die Darstellung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten α1, α2, α3, α4, β2/3, γ2 und δ. Substantia nigra pars reticulata (SNr), Substantia nigra pars compacta (SNc), subthalamischer Nucleus (STN), Globus pallidus (GP), pedunculopontiner Nucleus (PPN).

Zur Beurteilung unspezifischer Markierungen erfolgte bei jedem Färbedurchgang eines Tieres die Färbung einer Negativkontrolle. Hierbei wurde der primäre Antikörper durch die gleiche Menge Serum, aus welchem der jeweilige Sekundärantikörper stammte, ersetzt. Um die Variation der Free-Floating-Färbungen möglichst konstant zu halten, wurde bei jedem Färbedurchgang darauf geachtet, dass eine gewisse Anzahl vollständiger Schnittserien naiver Tiere, sham-gekindelter Tiere und gekindelter Tiere gleichzeitig gefärbt wurde.

Die untersuchten Regionen der Basalganglien wurden in der vorliegenden Arbeit bezüglich der rechten und linken Hirnhemisphäre getrennt betrachtet. Zudem wurden einige Hirnregionen zur Auswertung in weitere Subregionen eingeteilt. Zur Messung der Grauwerte bzw. der optischen Farbdichte wurde das Striatum in eine anteriore und eine posteriore Region eingeteilt. Die anteriore Region wurde in einen Bereich von 2,25 mm bis 0,84 mm relativ zu Bregma festgelegt, wohingegen sich die posteriore Region 0,60 mm bis -1,56 mm relativ zu Bregma befand. Der jeweilige anteriore Anteil des Striatums in der rechten und linken Hemisphäre wurde in vier etwa gleich große Bereiche aufgeteilt: dorsolateral, dorsomedial, ventrolateral und ventromedial, wohingegen der posteriore Teil des Striatums in jeder Hirnhemisphäre nur in einen dorsalen und einen ventralen Bereich eingeteilt wurde (s. Abb. 2). Es wurden jeweils drei Schnitte jeder Region des Striatums pro Hemisphäre eines Tieres analysiert.

Die SNr wurde ebenfalls zur Auswertung in Subregionen eingeteilt. Auch hier erfolgte die Betrachtung eines anterioren und posterioren Anteils der Struktur. Allerdings erfolgte die Schnittauswahl nicht wie in 4.6.5. beschrieben, da durch den relativ großen Abstand der Schnitte von jeweils 360 µm die Schnittanzahl pro Serie geringer war. Der anteriore und der posteriore Teil der SNr grenzten somit direkt aneinander.

Material und Methoden

Die anteriore Region wurde auf den Bereich von -4,8 mm bis zu -5,4 mm relativ zu Bregma festgelegt, wohingegen die posteriore Region -5,52 mm bis -6,48 mm umfasste. In beiden Abschnitten der SNr erfolgte eine Unterteilung in eine dorsolaterale und ventromediale Subregion in jeder Hirnhemisphäre (s. Abb. 13).

Bezüglich dieser Struktur und ihren Subregionen wurden bis zu vier Schnitte pro Hemisphäre jedes Tieres ausgewertet.

Die anderen untersuchten Kerne wurden nicht in Subregionen unterteilt. Die Auswertung der SNc erfolgte in dem Bereich -5,88 mm bis zu -6,42 mm zu Bregma.

Auch hier wurden bis zu vier Schnitte pro Hemisphäre eines Tieres ausgewertet. Die Betrachtung des STNs erfolgte in einer Region -3,24 mm bis -3,96 mm relativ zu Bregma wohingegen der GP in einem Bereich von -0,48 mm bis -1,44 mm untersucht wurde. Bezüglich des STNs wurden bis zu drei Schnitte pro Hemisphäre jedes Tieres ausgewertet. Da der auswertbare Bereich des GP relativ groß war, konnten bis zu fünf Schnitte pro Hemisphäre in die Auswertung eingehen. Im Falle des PPNs wurden nur ein bis zwei Schnitte pro Hemisphäre pro Tier analysiert. Der in den Gewebeschnitten sichtbare Teil des Kerns umfasste die Region -6,72 mm bis -8,16 mm zu Bregma. Die exakte Position der verschiedenen Hirnstrukturen wurde mit Hilfe des stereotaktischen Atlas von PAXINOS und WATSON (2007) bestimmt.