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1. Auflage 2010
© 2010 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-941703-
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net 96-4
Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Immunhistologische Untersuchung des Kaliumkanals K
Ca2.2 (SK2) und der GABA
A-Rezeptoruntereinheiten in
den Basalganglien im Kindling-Modell für Temporallappenepilepsie
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -
(Dr.rer.nat)
im Fachgebiet
Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover und dem Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover
vorgelegt von
Stefanie Honndorf
aus Stuttgart
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. M. Gernert (Supervisorin) Prof. Dr. C. Grothe (Co-Supervisorin) Prof. Dr. A. Tipold (Co-Supervisorin)
1. Gutachter: PD Dr. M. Gernert (Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover)
2. Gutachter: Prof. Dr. C. Grothe (Institut für Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover)
3. Gutachter: Prof. Dr. A. Tipold (Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover)
4. Gutachter: Prof. Dr. A. Richter (Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Freie Universität Berlin)
Datum der mündlichen Prüfung: 09.10.2010
Fördernde Institution: Georg-Christoph-Lichtenberg
Promotionsstipendium des niedersächsischen Ministeriums für Kultur und Wissenschaft
„Mauern sind nicht dazu da, um uns von etwas abzuhalten, sondern um uns die Möglichkeit zu geben, zu zeigen, wie sehr wir etwas wirklich wollen!“
(Professor Randy Pausch, 1960-2008)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
... IX1. Einleitung
... 12. Literaturübersicht
... 42.1. Epilepsien... 4
2.1.1. Definition und Bedeutung ... 4
2.1.2. Temporallappenepilepsie ... 5
2.1.3. Das Kindling-Modell für Temporallappenepilepsie ... 6
2.2. Die Basalganglien... 8
2.2.1. Das Striatum ... 10
2.2.2. Die Substantia nigra... 12
2.2.3. Der subthalamische Nucleus ... 13
2.2.4. Der Globus pallidus ... 14
2.2.5. Der pedunculopontine Nucleus ... 15
2.2.6. Bedeutung der Basalganglien für TLE ... 17
2.3. Untersuchte Rezeptortypen... 20
2.3.1. Der calcium-aktivierte Kaliumkanal mit geringer K+-Leitfähigkeit (KCa2.2; SK2) ... 20
2.3.2. Bedeutung der SK-Rezeptorkanäle für TLE... 22
2.3.3. Der GABAA-Rezeptor ... 23
2.3.4. Bedeutung des GABAA-Rezeptors für TLE ... 27
3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen
... 304. Material und Methoden
... 334.1. Übersicht zum Versuchsablauf ... 33
4.2. Versuchstiere und Tierhaltung... 34
4.3. Implantation von Elektroden in die basolaterale Amygdala ... 34
4.4. Amygdala-Kindling-Modell ... 37
4.4.1. Das Stimulationsprotokoll... 37
4.5. Histologie ... 41
4.5.1. Fixierung des Gewebes durch Perfusion... 41
4.5.2. Gefrierschnitte... 41
Inhaltsverzeichnis
4.6. Immunhistologische Untersuchungen der Anzahl der SK2-positiven
Neurone in den Basalganglien ... 43
4.6.1. Fixierung des Gewebes durch Perfusion... 43
4.6.2. Gefrierschnitte... 43
4.6.3. Nissl-Färbung ... 44
4.6.4. Immunperoxidasefärbung ... 44
4.6.5. Untersuchung der Anzahl der SK2-positiven Kanäle... 45
4.7. Immunhistologische Untersuchungen der Expression der GABAA- Rezeptoruntereinheiten... 49
4.7.1. Fixierung des Gewebes durch Perfusion... 49
4.7.2. Gefrierschnitte... 50
4.7.3. Nissl-Färbung ... 50
4.7.4. Immunperoxidasefärbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten ... 50
4.7.5. Optische Dichtemessung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten .... 52
4.8. Statistik... 57
5. Ergebnisse
... 595.1. Bestimmung der Anzahl SK2-positiver Neurone in Regionen der Basalganglien ... 59
5.1.1. Gruppengröße ... 59
5.1.2. Kindling-Prozedur ... 59
5.1.3. Anzahl der SK2-positiven Neurone... 59
5.2. Untersuchung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten ... 66
5.2.1. Gruppengröße ... 66
5.2.2. Kindling-Prozedur ... 66
5.2.3. Untersuchte GABAA-Rezeptoruntereinheiten ... 66
5.2.4. GABAA-Rezeptoruntereinheiten in den Regionen der Basalganglien und dem PPN ... 69
5.2.5. Die GABAA-Rezeptoruntereinheiten α2 und γ2... 72
5.2.6. Die GABAA-Rezeptoruntereinheit α1... 73
5.2.7. Die GABAA-Rezeptoruntereinheit α3... 78
5.2.8. Die GABAA-Rezeptoruntereinheit α4... 83
5.2.9. Die GABAA-Rezeptoruntereinheiten β2/3... 88
5.2.10. Die GABAA-Rezeptoruntereinheit δ... 93
Inhaltsverzeichnis
6. Diskussion
... 1006.1. Histologische Untersuchungen der SK2-positiven Neurone in der SNr und dem STN im Amygdala-Kindling-Modell ... 100
6.2. Histologische Untersuchungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten in den Basalganglien im Amygdala-Kindling-Modell... 102
6.2.1. Diskussion der kindling-induzierten Veränderungen der Immunreaktivität der GABAA-Rezeptoruntereinheit α1... 104
6.2.2. Diskussion der kindling-induzierten Veränderungen der Immunreaktivität der GABAA-Rezeptoruntereinheit α3... 106
6.2.3. Diskussion der kindling-induzierten Veränderungen der Immunreaktivität der GABAA-Rezeptoruntereinheit α4... 107
6.2.4. Diskussion der kindling-induzierten Veränderungen der Immunreaktivität der GABAA-Rezeptoruntereinheiten β2/3... 109
6.2.5. Diskussion der kindling-induzierten Veränderungen der Immunreaktivität der GABAA-Rezeptoruntereinheit δ... 111
6.2.6. Diskussion der Ergebnisse der Färbungen der GABAA- Rezeptoruntereinheiten α2 und γ2... 113
6.2.7. Zusammenfassende Betrachtungen der Untersuchungsergebnisse der GABAA-Rezeptoruntereinheiten in den Basalganglien im Amygdala-Kindling-Modell ... 115
6.2.8. Abschliessende Anmerkungen und Ausblicke ... 119
7. Zusammenfassung
... 1218. Summary
... 1249. Literaturverzeichnis
... 12610. Anhang
... 14310.1. Tabellen... 143
10.1.1. Grauwerteichung zur Messung der optischen Dichte... 143
10.1.2. Untersuchung der Anzahl SK2-positiver Neurone pro 0,11 mm3 in den Basalganglien... 143
10.1.3. Untersuchung der optischen Dichte der Färbung der GABAA- Rezeptoruntereinheit α1 in Regionen der Basalganglien ... 144
Inhaltsverzeichnis
10.1.5. Untersuchung der optischen Dichte der Färbung der GABAA-
Rezeptoruntereinheit α4 in Regionen der Basalganglien ... 147
10.1.6. Untersuchung der optischen Dichte der Färbung der GABAA- Rezeptoruntereinheiten β2/3 in Regionen der Basalganglien... 149
10.1.7. Untersuchung der optischen Dichte der Färbung der GABAA- Rezeptoruntereinheit δ in Regionen der Basalganglien ... 151
10.2. Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 153
10.3. Puffer und Lösungen ... 156
10.4. Färbeprotokolle ... 159
10.5. Publikationen ... 160
10.6. Erklärung... 162
10.7. Danksagung ... 163
Abkürzungen
Abkürzungen
Abb. Abbildung
ADD1 Nachentladungsdauer 1 ADD2 Nachentladungsdauer 2 ADT Nachentladungsschwelle Ak Antikörper
Aqua dest. Aqua destillata BLA basolaterale Amygdala bzgl. bezüglich
bzw. beziehungsweise
CA Cornu ammonis (Ammonshorn) ca. zirka
cm Zentimeter
d.h. das heißt DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EEG Elektroenzephalogramm
EPN Entopedunkulärer Nucleus des Nagers etc. et cetera
evtl. eventuell
Fa. Firma
g Gramm
GABA γ-Aminobuttersäure GP Globus pallidus
GPe Äußeres Segment des Globus pallidus beim Primaten GPi Inneres Segment des Globus pallidus beim Primaten GST Generalisierte Anfallsschwelle
h Stunde
HRP Horseradish Peroxidase
Hz Hertz
IC Inferiorer Colliculus
Abkürzungen
i.p. intraperitoneal i.v. intravenös Kap. Kapitel
kg Kilogramm
M Molar
max. maximal
MEZ Mitteleuropäische Zeit mg Milligramm
min Minute mind. mindestens ml Milliliter mm Millimeter ms Millisekunden MW Mittelwert
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
Nr. Nummer
o.g. oben genannt
PBS Phospat-gepufferte Kochsalzlösung PPN Pedunculopontiner Nucleus
RT Raumtemperatur
s Sekunde
s. siehe
s.c. subcutan
SC Superiorer Colliculus SD1 Anfallsdauer 1 SD2 Anfallsdauer 2
SEM standard error of the mean (Mittelwertfehler)
SK2 Ca2+-abhängiger Kalium-Kanal und gleichnamige UE mit geringer Leitfähigkeit für K+-Ionen
SN Substantia nigra
SNc Substantia nigra pars compacta SNl Substantia nigra, lateraler Teil SNr Substantia nigra pars reticulata
Abkürzungen
STN Subthalamischer Nucleus s.u. siehe unten
Tab. Tabelle
TBS TRIS-gepufferte Kochsalzlösung TLE Temporallappenepilepsie u.a. unter anderem
v.a. vor allem µA Mikroampère µl Mikroliter µm Mikrometer XEM Xylolersatzmedium z.B. zum Beispiel
Einleitung
1. Einleitung
Epilepsie ist mit einer Prävalenz von ca. 1 % der Weltbevölkerung die häufigste chronische neurologische Erkrankung des Menschen. Dies entspricht mehr als 50 Millionen Menschen weltweit (HAUSER 1999; LÖSCHER 1994; LÖSCHER et al.
2006b). Die Temporallappenepilepsie (TLE) stellt dabei die häufigste Epilepsieform dar (SPERK 2006). Die Anfallstherapie bei der TLE ist äußerst schwierig, da 50-90 % der Patienten nicht auf eine Behandlung mit verfügbaren Antikonvulsiva ansprechen (LÖSCHER et al. 2008; SCHMIDT u. LÖSCHER 2005; VAN VLIET et al. 2008).
Daher gibt es großen Bedarf, das Verständnis der Pathomechanismen der TLE zu verbessern, um neue Ansatzpunkte für eine wirksame Therapie zu finden.
Die komplex-fokalen Anfälle eines TLE-Patienten entstehen meist in einer umschriebenen Region des Gehirns, dem Anfallsfokus (fokal), im Bereich des Temporallappens und lösen eine Beeinträchtigung des Bewusstseins (komplexer Anfall) aus (WOLF 1994). Von diesem Anfallsfokus aus können sich die epileptischen Entladungen der Neuronen während der Erkrankung zunehmend auf andere Hirnregionen ausbreiten. Die Ausbreitung der Anfallsaktivität erfolgt nicht zufällig, sondern bevorzugt entlang der anatomischen Bahnen und Hirnregionen, die auch bei der Ausübung der Motorik eine wichtige Rolle spielen, wie die Regionen der Basalganglien (GALE et al. 2008; GERNERT et al. 2004; LOTHMAN et al. 1991;
LÖSCHER et al. 2008; MCINTYRE u. GILBY 2008; MCNAMARA 1984).
Insbesondere tierexperimentell wurde gezeigt, dass einige Gebiete der Basalganglien nachweislich eine große Bedeutung bei der Modulation und Ausbreitung der neuronalen Anfallsaktivität mit Fokus im limbischen System haben (DEPAULIS et al. 1994; GALE 1988; GALE et al. 2008; GERNERT et al. 2004;
IADAROLA u. GALE 1982; LÖSCHER u. EBERT 1996; MCNAMARA et al. 1984).
Epileptische Anfälle gelten als Manifestationen abnormer hyperaktiver Entladungen von Neuronen, die durch ein Ungleichgewicht an neuronaler Hemmung und Erregung hervorgerufen werden (TASKER u. DUDEK 1991). Tatsächlich wurden unter Verwendung elektrophysiologischer Methoden anfalls-induzierte (akute) sowie epilepsie-induzierte (chronische) funktionelle Veränderungen in den Basalganglien und assoziierten Regionen nachgewiesen (BONHAUS et al. 1986; BONHAUS et al.
Einleitung
1991; FEDROWITZ et al. 2002; GERNERT et al. 2004; KÜCKER et al. 2010; NOLTE et al. 2006). Diese anfalls-/epilepsie-induzierten Aktivitätsveränderungen von Basalganglienneuronen lassen sich zum Teil auf Netzwerkebene durch entsprechende Aktivitätsänderungen afferenter Eingänge erklären (KÜCKER et al.
2010; NOLTE et al. 2006). Darüber hinaus ist davon auszugehen, dass Veränderungen auf molekularer Ebene (Rezeptoren, Ionenkanäle) an den beobachteten Aktivitätsänderungen beteiligt sind. Der Fokus dieser Arbeit sollte daher auf der Untersuchung eines Kaliumkanals und des GABAA-Rezeptors liegen, welche für die Pathophysiologie der TLE eine potentielle Bedeutung haben.
Calcium-aktivierte Kaliumkanäle mit geringer Leitfähigkeit für Kalium-Ionen vom Typ 2 (SK2) spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation der Neuronenerregbarkeit, synaptischer Plastizität und der Signalübertragungsstärke und stellen daher ein potentielles therapeutisches Zielmolekül bei der Behandlung von Epilepsien dar (PEDARZANI u. STOCKER 2008). Veränderungen der SK2-Kanal-Expression in den Basalganglien könnten zu Netzwerkveränderungen beitragen, die bei TLE auftreten.
Des Weiteren treten bei der TLE Modifikationen der Funktion von postsynaptischen GABAA-Rezeptoren auf, die als potentielle Mechanismen für die Epileptogenese von Bedeutung sind (BROOKS-KAYAL et al. 1998; BUHL et al. 1996; GIBBS et al. 1997).
In Tiermodellen der TLE konnte bereits gezeigt werden, dass es bei epileptischen Anfällen zu Veränderungen in der Anzahl und Zusammensetzung der Untereinheiten der GABAA-Rezeptoren in limbischen Hirnbereichen kommt (BETHMANN et al. 2008;
BOUILLERET et al. 2000; BROOKS-KAYAL et al. 1998; NUSSER et al. 1998;
SCHWARZER et al. 1997). Die Basalganglien sind in dieser Hinsicht bislang weniger gut untersucht. Verschiedene pharmakologische und biochemische Befunde legen aber nahe, dass Dysfunktionen des GABAergen Systems innerhalb der Basalganglien bei experimenteller TLE beteiligt sind, weswegen in dieser Arbeit potentielle Veränderungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten untersucht wurden.
Es besteht also ein großer Forschungsbedarf, um das Verständnis der Rolle der Basalganglien und deren Zielregionen bei der Ausbreitung der neuronalen Anfallsaktivität zu verbessern. Hieraus lassen sich neue Ansatzpunkte für Therapien entwickeln, um TLE-Patienten mit schwer therapierbaren Anfällen weitere
Einleitung
Behandlungsmöglichkeiten zu liefern. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Anzahl SK2-positiver Neurone und die Zusammensetzung der GABAA- Rezeptoruntereinheiten in den Basalganglien und assoziierten Regionen untersucht.
Literaturübersicht
2. Literaturübersicht 2.1. Epilepsien
2.1.1. Definition und Bedeutung
Nach der Definition der Kommission der Internationalen Liga gegen Epilepsie (International League Against Epilepsy: ILAE) ist die Diagnose einer Epilepsie gerechtfertigt, wenn mindestens ein epileptischer Anfall aufgetreten ist und Befunde vorliegen, die auf eine Prädisposition für weitere epileptische Anfälle hinweisen.
Epilepsie ist demnach eine Störung des Gehirns, die durch eine dauerhafte Prädisposition zur Entwicklung epileptischer Anfälle sowie durch die neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und sozialen Konsequenzen dieses Zustandes gekennzeichnet ist (ILAE, FISHER et al. 2005). Ein epileptischer Anfall entsteht durch plötzliche, synchrone elektrische Entladungen einzelner Neuronengruppen im Gehirn. Diese Entladungen können als pathologisches Muster im Elektroenzephalogramm (EEG) sichtbar gemacht werden (JAGGY 2007). Der Begriff Epilepsie fasst verschiedene Erkrankungen und Syndrome mit zerebraler Funktionsstörung zusammen.
Epilepsien sind beim Menschen die häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (BROWNE u. HOLMES 2001;
LÖSCHER 1994). Weltweit sind ca. 1 % der Bevölkerung betroffen, was mehr als 50 Millionen Menschen entspricht (DUNCAN et al. 2006). Auch bei Haustieren wie Hund und Katze sind Epilepsien weit verbreitet und stellen ebenfalls die häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen dar (LÖSCHER 1994). Für eine erfolgreiche Behandlung von Epilepsien ist eine korrekte Diagnose notwendig. Nur unter Betrachtung dieses Gesichtspunkts kann die richtige Therapie gewählt werden, die von der Art des epileptischen Syndroms und der epileptischen Anfälle abhängig ist (BROWNE u. HOLMES 2001).
Die Einteilung epileptischer Syndrome und Anfälle erfolgt anhand der Merkmale Anfallsmuster, Ursache, Alter bei Krankheitsbeginn, auslösende Faktoren und elektroenzephalographische Befunde. Es werden fokale (partielle) von generalisierten Anfallstypen unterschieden. Fokale Anfälle entstehen in einer
Literaturübersicht
definierten Ansammlung von Neuronengruppen im Gehirn, welche als Anfallsfokus bezeichnet wird. Der einfach-fokale Anfall manifestiert sich klinisch in unwillkürlichen Bewegungen einzelner Muskelgruppen, ohne das Bewusstsein des Patienten zu beeinträchtigen. Bei einem komplex-fokalen Anfall hingegen ist das Bewusstsein des Patienten gestört. Dieser Anfallstyp kann sekundär generalisieren. Das heißt, die epileptische Aktivität des Anfallsfokus breitet sich auf beide Hirnhemisphären aus.
Bei den primär generalisierten Anfällen sind von Anfallsbeginn an beide Hirnhemisphären betroffen (FISHER et al. 2005; MCNAMARA 1994). Anhand der auftretenden motorischen Funktionsstörungen werden generalisierte Anfälle klinisch in tonische (Streckkrämpfe), klonische (Ruderkrämpfe), tonisch-klonische, myoklonische (Muskelzuckungen ohne Bewegungseffekt) und atonische Krämpfe (Erschlaffung der Muskulatur) sowie sogenannte Absencen (Bewusstseinsminderung mit anschliessender Amnesie) eingeteilt (WESTBROOK 2000). Des Weiteren können auch nicht klassifizierbare Anfälle sowie weitere Syndrome wie der Status epilepticus definiert werden. Der Status epilepticus stellt eine Serie von lang anhaltenden epileptischen Anfällen ohne eine Wiedererlangung des Bewusstseins dar (LOWENSTEIN et al. 1999).
In der Veterinärmedizin erfolgt die Einteilung der epileptischen Anfälle in Anlehnung an die Klassifizierung in der Humanmedizin. Die häufigsten Anfälle bei Hund und Katze stellen primär oder sekundär generalisierte Anfälle mit tonisch-klonischer Krampfaktivität dar (DEWEY et al. 2004; LECOUTEUR u. CHILD 1989).
2.1.2. Temporallappenepilepsie
Die Temporallappenepilepsie (TLE) stellt die häufigste komplex-fokale Epilepsieform beim Menschen dar. Komplex-fokale Anfälle treten mit oder ohne eine sekundäre Generalisierung auf (GASTAUT et al. 1975; HAUSER et al. 1993). Auch bei Hunden und Katzen sind komplex-fokale Anfälle weit verbreitet. Die Anfälle entstehen zu 70- 80 % im Bereich des Temporallappens, insbesondere in den beiden limbischen Hirnstrukturen Hippokampus und Amygdala, weshalb diese Epilepsieform Temporallappenepilepsie genannt wird (BERTRAM 2009; WOLF 1994). Bei komplex-fokalen Anfällen, wie sie während der TLE auftreten, kommt es zu einer
Literaturübersicht
leichten Benommenheit des Patienten, sowie zu Verhaltensänderungen und Automatismen. Die sekundäre Generalisierung zeigt sich in Form von generalisierten tonisch-klonischen Anfällen. Die Therapie dieser Anfälle erweist sich als äußerst schwierig, da 50-90 % der TLE-Patienten eine Pharmakoresistenz gegenüber den zur Verfügung stehenden Antikonvulsiva zeigen (LÖSCHER et al. 2008; SCHMIDT u.
LÖSCHER 2005; VAN VLIET et al. 2008). Zwar ist für einige der pharmakoresistenten Patienten eine chirurgische Resektion des epileptischen Fokus im Temporallappen möglich (FOLDVARY et al. 2001), jedoch gilt dies nur für diejenigen, bei denen ein klarer Fokus lokalisiert werden kann. Daher gibt es großen Bedarf, die pathophysiologischen Mechanismen der TLE zu untersuchen, um neue Ansatzpunkte für eine wirksame Therapie zu finden.
2.1.3. Das Kindling-Modell für Temporallappenepilepsie
Zur genaueren Untersuchung von Epilepsien dienen verschiedene experimentelle Tiermodelle. Es werden dabei experimentelle Modelle der genetischen (idiopathischen) von denen der erworbenen (symptomatischen) Epilepsie unterschieden (LÖSCHER 2002). Die Modelle für TLE, welche eine symptomatische oder kryptogene (Ursache zu Zeit nicht bekannt) Epilepsieform darstellt, können sowohl chemisch als auch elektrisch induziert werden (LÖSCHER u. SCHMIDT 1988). Das Kindling-Modell ist ein elektrisch induziertes Modell für TLE.
Im Jahre 1969 wurde das Kindling-Modell erstmals von Graham Goddard an Ratten beschrieben. Das Modell wurde ursprünglich entwickelt, um das Lernverhalten durch subkonvulsive elektrische Stimuli zu beeinflussen (GODDARD et al. 1969). Im Kindling-Modell werden epileptische Anfälle durch wiederholte, zunächst subkonvulsive, elektrische Stimulationen über eine unilaterale Reiz- und Ableitelektrode im Bereich des limbischen Systems ausgelöst. Die Anfälle nehmen bei weiteren Stimulationen in ihrer Schwere und Dauer zu. Der Begriff Kindling (engl.:
to kindle = anfachen, sich entzünden) beschreibt also einen fortschreitenden Prozess, in dem durch wiederholte, elektrische Stimulation einer Hirnregion im limbischen System wie z.B. dem Hippokampus oder der Amygdala eine erhöhte Anfallsbereitschaft erreicht wird. Das heißt, dass die Anfallsaktivität einen progressiven Verlauf nimmt, indem sie sich durch das Kindling in ihrer Stärke und
Literaturübersicht
Dauer steigert (LÖSCHER 2002; SPERK 2006). Heute ist das Kindling-Modell eines der am häufigsten verwendeten Modelle für die TLE, da es eine gute Übertragbarkeit zu Therapie und Symptomen der TLE beim Menschen aufweist. Des Weiteren besteht ein Vorteil dieses Modells darin, epileptische Anfälle nach Bedarf auslösen zu können, um pharmakologische Untersuchungen durchzuführen (LÖSCHER 2002). Aufgrund des progressiven Kindling-Verlaufs können zudem antiepileptogene als auch antikonvulsive Substanzeffekte untersucht werden.
Im Kindling-Modell werden die Tiere in der Regel wiederholt einmal täglich über eine Elektrode im limbischen System stimuliert. Zunächst zeigen sie fokale Anfälle, die bei einer Fortführung der Stimulation an Schwere und Dauer zunehmen und schliesslich sekundär generalisieren. Dabei breitet sich die Anfallsaktivität nicht zufällig, sondern bevorzugt entlang anatomischer Bahnen aus, die auch bei normalen Bewegungsabläufen eine Rolle spielen (Abb. 1; GALE 1988; GALE et al. 2008;
LÖSCHER et al. 2008; LÖSCHER u. EBERT 1996). Die Regionen der Basalganglien spielen hierbei eine große Rolle, da sie u.a. an der Kontrolle von Bewegungskoordination und Körperhaltung beteiligt sind (BOLAM et al. 2000;
DECETY et al. 1994; EVARTS u. WISE 1984; PARENT u. HAZRATI 1995a).
Während des Kindling-Prozesses nimmt die Empfindlichkeit des Gehirns auf den Stimulus fortlaufend zu, bis der erhöhte Empfindlichkeitsgrad dauerhaft besteht. Zu diesem Zeitpunkt werden die Tiere als „voll-gekindelt“ bezeichnet (MCNAMARA 1984; MORIMOTO et al. 2004). Die erhöhte konvulsive Empfindlichkeit im Gehirn führt zu dauerhaften funktionellen Veränderungen in verschiedenen Hirnstrukturen (GODDARD et al. 1969; SATO et al. 1990), ohne jedoch zu einem massiven Neuronenverlust bzw. anderen neurologischen Schäden zu führen, welche als Folge schwerer Anfälle auftreten können. Das Kindling-Modell ermöglicht somit Einblicke in die Mechanismen der progressiven Epileptogenese (SPERK 2006).
Literaturübersicht
2.2. Die Basalganglien
Neben dem limbischen System selbst spielen die Basalganglien eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung epileptischer Anfallsaktivität mit Fokus im limbischen System (Abb. 1). Der Begriff „Basalganglien“ umfasst mehrere subkortikal gelegene Kerne, die jeweils in beiden Hirnhemisphären anatomisch und funktionell miteinander verbunden sind. Diese Kerne spielen vor allem für motorische Funktionen aber auch für assoziative, kognitive und Gedächtnis-Funktionen eine wichtige Rolle. Die Basalganglien sind mit motorischen Arealen des zerebralen Kortex und efferenten motorischen Hirnzentren eng verbunden. Diese motorischen Zentren im Gehirn spielen bei der Koordination von Bewegungsabläufen und bei der Körperhaltung eine große Rolle (BOLAM et al. 2000; DECETY et al. 1994; EVARTS u. WISE 1984;
PARENT u. HAZRATI 1995a). Beim Säugetier werden das Striatum, der Nucleus accumbens, der Globus pallidus (GP), der subthalamische Nucleus (STN) und die Substantia nigra (SN) den Kerngebieten der Basalganglien zugeordnet (SMEETS et al. 2000). Das dorsale Striatum (hier nur Striatum genannt) des Primaten wird in Nucleus caudatus und Putamen unterteilt, wohingegen es beim Nager diese Unterteilung nicht gibt. Der GP ist anatomisch in zwei Segmente unterteilt. Das innere Segment des GP des Primaten (GPi) entspricht dem entopedunkulären Nucleus (EPN) des Nagers. Das äußere Segment des Kerns (GPe) beim Primaten entspricht dem Globus pallidus der Ratte (SMITH et al. 1998).
Der häufigste inhibitorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem ist die γ- Aminobuttersäure (GABA) (BORMANN 2000). Dieser Botenstoff stellt innerhalb des Netzwerks der Basalganglien den Haupttransmitter dar. Des Weiteren werden die Neurotransmitter Glutamat, Acetylcholin und Dopamin sowie verschiedene Neuropeptide innerhalb des Netzwerks verwendet (AFIFI 1994).
Literaturübersicht
Abb. 1: Verschaltungsschema der an der Ausbreitung limbischer und generalisierter Anfallsaktivität beteiligten Hirnregionen bei TLE unter besonderer Berücksichtigung der Basalganglien. Die epileptische Anfallsaktivität breitet sich entlang spezifischer anatomischer Bahnen aus, die auch bei Ausübung der Motorik eine wichtige Rolle spielen (GALE et al. 2008; LOTHMAN et al. 1991;
MCNAMARA 1984). Die anatomischen Verbindungen zwischen den Hirnstrukturen des limbischen Systems (orange), kortikalen Regionen (blau), Basalganglien (gelb) und die Projektionsorte der Basalganglien (grün) sind dargestellt. Die Signalübertragung zwischen den Strukturen erfolgt durch die Neurotransmitter GABA (rote Pfeile), Glutamat (blaue Pfeile) und verschiedene andere Transmitter, auf die hier nicht weiter eingegangen wird (graue Pfeile). Die epileptische Anfallsaktivität entsteht im limbischen System und kann sich von dort aus über andere Hirnregionen ausbreiten. Im Netzwerk der Basalganglien ist die SNr von besonderem Interesse, da diese Struktur als Ausgangsstruktur der Basalganglien bei der Modulation epileptischer Anfallsaktivität aus dem limbischen System eine große Rolle spielt (GALE et al. 2008). Modifiziert nach LÖSCHER et al.
(2008).
Das Striatum stellt die Haupteingangsstruktur der Basalganglien dar und erhält Informationen von motorischen und sensorischen Kortexarealen. Diese werden über zwei Wege an die Hauptausgangsstrukturen Substantia nigra pars reticulata (SNr) und dem GPi beim Primaten bzw. dem EPN beim Nager weitergeleitet (AFIFI 1994;
BOLAM et al. 2000; PARENT u. HAZRATI 1995a). Der erste Weg führt direkt über Subthalamischer
Nucleus
Pedunculopontiner Nucleus Superiorer Colliculus Thalamus Substantia nigra pars reticulata (SNr)
Globus pallidus
Weitere Generalisierung Striatum Nucleus
accumbens Kortex
Literaturübersicht
bezeichnet. Die zweite Verschaltung führt zunächst über GABAerge Projektionen zum GPe beim Primaten bzw. GP beim Nager und von dort über den STN und seine glutamatergen Projektionen zur SNr und dem GPi bzw. EPN. Dieser Weg wird indirekter Weg genannt (GERFEN 1992). Die Ausgangsstrukturen modulieren mittels GABAerger Projektionen die für die Motorik wichtigen Zielregionen Thalamus, den superioren Colliculus (SC) und den pedunculopontinen Nucleus (PPN, BOLAM et al.
2000).
2.2.1. Das Striatum
Die wichtigste Eingangsstruktur der Basalganglien ist das so genannte Corpus striatum oder synonym Striatum (lat.: gestreift). Die Struktur stellt die größte Region der Basalganglien dar und setzt sich aus den beiden Kernen Nucleus caudatus und Putamen zusammen. Entwicklungsgeschichtlich entstammen Nucleus caudatus und Putamen zwar einer gemeinsamen Anlage, werden aber sekundär durch die einsprossenden Fasern der Capsula interna voneinander getrennt, die zwischen den beiden Strukturen verläuft. Diese Trennung ist unvollständig, da die beiden Teile des Striatums noch über kleine Streifen grauer Substanz verbunden sind. Dies verleiht dem humanen Striatum ein charakteristisch gestreiftes Aussehen (TREPEL 2008).
Bei der Ratte findet keine Einteilung des Striatums in Nucleus caudatus und Putamen statt, da die Fasern anatomisch nicht einheitlich angeordnet sind.
Glutamaterge Eingänge erhält das Striatum von verschiedenen kortikalen Arealen und dem Thalamus (GALVAN et al. 2006; KAWAGUCHI et al. 1995). Dopaminerge Projektionen zum Striatum entstammen der Substantia nigra pars compacta, einer Region der SN (AFIFI 1994; BOLAM et al. 2000). Die Struktur enthält funktionell unterschiedliche Neuronentypen (FUJIYAMA et al. 2006; GERFEN 1989; KUBOTA u. KAWAGUCHI 1993). Projektionsneurone machen 95 % der striatalen Neurone aus (GERFEN 1992; TEPPER et al. 2008). Dieser Neuronentyp wird charakterisiert durch eine hohe Anzahl an synaptischen Ausstülpungen (Dornen) und langen Axonen. Die Projektionsneurone sind GABAerg und senden striatale Informationen sowohl zu beiden Teilen des GP beim Primaten (bzw. zum EPN und GP beim Nager) als auch zur SNr (PARENT u. HAZRATI 1995a; WU et al. 2000). Bei den restlichen
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Nervenzellen des Striatums handelt es sich um Interneurone. Es gibt verschiedene Typen dieser Interneurone, wobei der größte Anteil den Neurotransmitter GABA enthält (KAWAGUCHI 1993; KAWAGUCHI et al. 1995; KUBOTA et al. 1993;
KUBOTA u. KAWAGUCHI 1994; TEPPER et al. 2008). Der GABAerge Einfluss spielt eine sehr wichtige Rolle bei der Modulation des striatalen Outputs (TEPPER et al.
2008).
Im Folgenden wird das Striatum der Ratte genauer betrachtet. Das Striatum der Ratte ist in Subregionen einteilbar (Abb. 2). Der anteriore sowie der zentrale Teil lässt sich in einen dorsolateralen, dorsomedialen, ventrolateralen und ventromedialen Bereich teilen (GERNERT et al. 1999; GERNERT et al. 2000;
LÖSCHER et al. 2006a; NOBREGA et al. 1996), wohingegen der posteriore Abschnitt des Striatums nur in eine dorsale und ventrale Region unterteilt wird (LÖSCHER et al. 2006a). Das Striatum besitzt einerseits eine somatotope Gliederung der Neuronen, andererseits eine funktionelle Gliederung (CHO u. WEST 1997). Die dorsolaterale Region scheint an sensorimotorischen Funktionen beteiligt zu sein (BALLEINE et al. 2008; WEST et al. 1990). Die ventralen und dorsomedialen Bereiche des Striatums haben eine Funktion bei Lern- und Assoziationsvorgängen (BALLEINE et al. 2008).
Abb. 2: Subregionen des Striatums. Linke Abbildung: Einteilung des anterioren und zentralen Striatums dl: dorsolateral, dm: dorsomedial, vl: ventrolateral, vm: ventromedial. Rechte Abbildung:
Einteilung des posterioren Striatums d: dorsal, v: ventral (modifiziert nach PAXINOS u. WATSON 2007).
dl dm vl vm
dl dm vm vl
d
v
d
v
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2.2.2. Die Substantia nigra
Die SN (lat.: schwarze Substanz) ist ein wichtiger Bestandteil der Basalganglien. Die Struktur ist im Netzwerk der Hirnzentren, welche die Motorik beeinflussen, eingebunden und liefert einen wesentlichen Anteil an der Kontrolle und der Modulation von Bewegungsabläufen und -impulsen. Die SN ist im Mittelhirn lokalisiert. Anhand ihrer Anatomie wird die Struktur in die Substantia nigra pars compacta (SNc), die Substantia nigra pars reticulata (SNr) und die Substantia nigra pars lateralis (SNl) unterteilt (Abb. 3; HANAWAY et al. 1970). Von den drei Subregionen der Substantia nigra spielt die SNr als Ausgangsstruktur der Basalganglien eine wichtige Rolle. Die SNr ist reich an GABAergen Neuronen, wohingegen in der SNc dopaminerge Neuronen dominieren (CONDÉ 1992;
FLAHERTY u. GRAYBIEL 1994; JURASKA et al. 1977). Der Name „schwarze Substanz“ beruht auf der dunklen Pigmentierung der SNc beim Menschen, die durch einen hohen Gehalt an Melanin in den Perikaryen verursacht wird (TREPEL 2008).
Bei der Ratte tritt die dunkle Färbung der SNc allerdings nicht auf. Bei der SNr der Ratte ist eine funktionelle Unterteilung in eine anteriore und eine posteriore Subregion möglich (Abb. 3; GERNERT et al. 2004; SHEHAB et al. 1996;
VELÍSKOVÁ u. MOSHÉ 2006).
Abb. 3: Regionen der Substantia nigra. SNR: Substantia nigra pars reticulata, SNCD: dorsaler Teil der Substantia nigra pars compacta, SNL: Substantia nigra pars lateralis (modifiziert nach PAXINOS u.
WATSON 2007).
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Wie bereits erwähnt sendet das Striatum über den direkten und den indirekten Weg GABAerge Projektionen zu den beiden Ausgangsstrukturen SNr und dem GPi beim Primaten bzw. dem EPN beim Nager. Die beiden Ausgangskerne sind funktionell und anatomisch vergleichbar (TREPEL 2008). Wird der direkte Projektionsweg aktiviert, kommt es zu einer Modulation der SNr durch striatale GABAerge Projektionsneurone. Dies führt zu einer Hemmung der Aktivität in der SNr und zu einer Enthemmung der Neuronen in den nachfolgenden Zielregionen (Thalamus, SC, PPN). Bei einer Aktivierung des indirekten Weges werden die Neurone des GPe beim Primaten bzw. des GP beim Nager gehemmt was zu einer Enthemmung des STNs führt. Die glutamatergen exzitatorischen Neurone des STNs fördern die nigrale Aktivität. Dies resultiert in einer verstärkten Hemmung der Neurone in den Zielregionen (BOLAM et al. 2000).
Treten Störungen in diesem Netzwerk auf, kann es zu schwerwiegenden hypo- oder hyperkinetischen Erkrankungen wie Parkinson´scher Erkrankung, Dystonie oder Chorea Huntington kommen. Bei diesen neurologischen Krankheiten ist die Bewegungskontrolle gestört (DELONG u. WICHMANN 2007).
2.2.3. Der subthalamische Nucleus
Der STN wird in der vorliegenden Arbeit als weiterer Bestandteil der Basalganglien untersucht. Dieser Kern liegt bei Primaten ventromedial des GP und ist entwicklungsgeschichtlich ein Bestandteil des Subthalamus des Zwischenhirns, wird aber funktionell zu den Basalganglien gezählt (TREPEL 2008). Bei der Ratte ist der STN dorsal der Capsula interna und des Hirnstiels lokalisiert (Abb.4; HEISE u.
MITROFANIS 2004). Die Projektionsneurone des STNs enthalten als einzige im Netzwerk der Basalganglien den exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat. Die efferenten erregenden Verbindungen führen vor allem zu den Ausgangsstrukturen der Basalganglien, der SNr und dem EPN (GPi beim Primaten). Ferner sind die subthalamischen Neurone reziprok mit dem GP (GPe beim Primaten) und dem PPN verbunden (HAMANI et al. 2004; PARENT u. HAZRATI 1995b). Herausragend bei den Verschaltungen des STNs ist die direkte exzitatorische Afferenz aus kortikalen Arealen (CANTERAS et al. 1988; CANTERAS et al. 1990; NAMBU et al. 2000;
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über das Striatum geleitet werden. Somit ist der STN Teil des indirekten Weges, der vom Striatum zu der Ausgangsstruktur SNr verläuft. Frühere elektrophysiologische Studien an der Ratte weisen auf eine Kontrolle der Motorikeinleitung durch die Efferenzen des STNs hin (PARENT u. HAZRATI 1995b).
Abb. 4: Lage des subthalamischen Nucleus (STN, in Abb.: STh) im Gehirn der Ratte (modifiziert nach PAXINOS u. WATSON 2007).
2.2.4. Der Globus pallidus
Medial des Putamens liegt der GP (Abb. 5, lat.: bleiche Kugel). Diese Struktur entstammt embryologisch zu einem großen Teil dem Zwischenhirn und lässt sich wie zuvor erwähnt beim Primaten in ein inneres und äußeres Pallidumsegment einteilen (TREPEL 2008). Die pallidalen Neurone sind GABAerg und die Dendriten tragen meist dornartige Fortsätze (HEIMER et al. 1995; MILLHOUSE 1986). Projektionen erhalten sie vor allem von striatalen GABAergen Afferenzen des indirekten Wegs.
Die folgenden Betrachtungen beziehen sich auf den GP der Ratte. Dem GP nachgeschaltet sind Neurone des STNs und der SNr (OORSCHOT 1996). Des Weiteren innerviert der GP die SNc, welche das Ursprungsgebiet dopaminerger Neurone darstellt (PALADINI et al. 1999). Afferente Eingänge erhalten GP und EPN vom STN. Da der STN auch gleichzeitig die Hauptefferenz des GP ist, sind die beiden Kerne reziprok verschaltet und gelten als Schrittmacher der Basalganglien (PLENZ u. KITAI 1999; WICHMANN u. DELONG 1999). Damit spielt der GP eine
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große Rolle bei der Modulation der Aktivität der Basalganglien. In der vorliegenden Arbeit wird der GP der Ratte als einheitliche Struktur untersucht (Abb. 5).
Abb. 5: Lage des Globus pallidus (GP) im Gehirn der Ratte (modifiziert nach PAXINOS u. WATSON 2007).
2.2.5. Der pedunculopontine Nucleus
Der PPN befindet sich nahe dem Kleinhirnstiel im rostralen Hirnstamm und gehört im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Kernen nicht zu den Basalganglien (Abb. 6).
Der PPN ist eine sehr heterogene Struktur (KANG u. KITAI 1990). Neben cholinergen Neuronen sind glutamaterge, GABAerge und dopaminerge Zellgruppen zu finden (CLEMENTS u. GRANT 1990; FORD et al. 1995; JONES u. BEAUDET 1987). Der PPN ist mit den Basalganglien durch zahlreiche Projektionen reziprok verknüpft (MENA-SEGOVIA et al. 2004). Diese reziproken Verbindungen verbinden den PPN und die folgenden Regionen der Basalganglien: Striatum, SNr, SNc, STN und GP (GRÖNEWEGEN et al. 1994; LAVOIE u. PARENT 1994; MORIIZUMI u.
HATTORI 1992; SEMBA u. FIBIGER 1992). Bei einer Betrachtung des PPNs und den Basalganglien als Einheit fällt auf, dass sie ähnliche Muster an afferenten und efferenten Eingängen aufweisen. Beide Regionen sind mit dem Kortex, dem Thalamus, dem superioren Colliculus, der Amygdala und dem Hirnstamm verbunden (MENA-SEGOVIA et al. 2004). Die SNr wird als größte und bedeutendste inhibitorische Inputquelle für den PPN vermutet (GRANATA u. KITAI 1991;
GROFOVA u. ZHOU 1998; NODA u. OKA 1984).
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Die Ausgangsstrukturen der Basalganglien, SNr und GPi beim Primaten bzw. der EPN beim Nager, bilden gemeinsam die stärksten inhibitorischen Afferenzen (GABA), wohingegen der STN den stärksten exzitatorischen Einfluss auf den PPN ausübt (Glutamat). Der PPN hingegen sendet Projektionen zu diesen drei Gebieten zurück und moduliert dadurch deren neuronale Aktivität (BENINATO u. SPENCER 1987; BENINATO u. SPENCER 1988; CHARARA et al. 1996; DI LORETO et al.
1992; FUTAMI et al. 1995; LAVOIE u. PARENT 1994a; NOMURA et al. 1980;
SCARNATI et al. 1984). Die zentrale anatomische Position des PPNs und dessen reziproke Projektionen zur SNr, zum STN, zum Thalamus und zum limbischen System, scheint auf eine anfallsmodulierende Funktion bei TLE hinzuweisen.
Tatsächlich wird in einigen Modellen eine Beteiligung der Projektionen zwischen SNr und dem PPN an Vorgängen, die den epileptischen Netzwerkveränderungen im Gehirn folgen, beschrieben (DEPAULIS et al. 1994; NOLTE et al. 2006). Dennoch sind weitere Untersuchungen notwendig, um die Bedeutung des PPN innerhalb des Netzwerks der Basalganglien aufzuklären. Aus diesem Grund wird der PPN der Ratte (Abb. 6) in die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit einbezogen.
Abb. 6: Lage des pedunculopontinen Nucleus (PPN, in Abb.: PTg) im Gehirn der Ratte (modifiziert nach PAXINOS u. WATSON 2007).
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2.2.6. Bedeutung der Basalganglien für TLE
In zahlreichen klinischen Studien an TLE-Patienten konnte eine Beteiligung der Basalganglien bei der Weiterleitung von epileptischen Anfällen mit Fokus im limbischen System nachgewiesen werden (BOUILLERET et al. 2005; FRANCESCHI et al. 1995; JOO et al. 2005; KAIBORIBOON et al. 2005; REKTOR et al. 2002; SHIN et al. 2001; SHIN et al. 2002).
In tierexperimentellen Untersuchungen wurde bereits früh gezeigt, dass die SN neben der anfallsweiterleitenden eine anfallsmodulierende Funktion besitzt (GALE et al. 2008; IADAROLA u. GALE 1982). Zahlreiche Studien belegen zudem eine Beteiligung der Basalganglien an epilepsie-induzierter Netzwerkplastizität. Frühere Untersuchungen beschrieben eine Reduktion der Aktivität des GABA- produzierenden-Enzyms Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) in der SN gekindelter Ratten. Dies weist auf eine mögliche Verringerung des GABA-Turnovers und damit eine veränderte Funktion des Neurotransmitters GABA in der SN gekindelter Ratten hin (LÖSCHER u. SCHWARK 1985, 1987). In späteren Studien konnte gezeigt werden, dass eine lokale pharmakologische Hemmung der SNr sich entweder pro- oder antikonvulsiv auswirken konnte oder keinen Effekt zeigte, je nachdem ob der anteriore oder posteriore Bereich der SNr gehemmt wurde, wobei die Zuteilung der Eigenschaften zu den Subregionen unterschiedlich ausfiel (SHEHAB et al. 1996;
VELίSKOVÁ et al. 1998). Dieses Resultat weist auf eine Subregionenspezifität der SNr bei der Anfallsmodulation hin. Eine Injektion des GABAA-Rezeptor-Agonisten Muscimol in die SNr löste in Abhängigkeit von Injektionslokus, Anfallsmodell, Rattenstamm, -geschlecht und -alter entweder anikonvulsive oder prokonvulsive oder aber auch keine Effekte durch die Muscimol-Injektion aus (GERNERT u. LÖSCHER 2001; NOLTE et al. 2006; MOSHÉ et al. 1994). Diese kontroversen Ergebnisse weisen auf eine hohe funktionelle Komplexität der SNr bei der Anfallsmodulation hin.
Die Aktivität nigraler Neurone wurde in einer Studie von BONHAUS et al. (1986) mit Hilfe der in vivo-Einzelableitung untersucht. Es konnte eine Veränderung der iktalen Aktivität nigraler Neurone nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigten GERNERT et al. (2004) mittels elektrophysiologischer Untersuchungen der SNr, dass die spontane Aktivität der GABAergen nigralen Neurone in der posterioren SNr auch
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noch 24 h nach einem generalisierten Anfall in weiblichen amygdala-gekindelten Ratten signifikant erhöht war. Veränderungen des Feuermusters der Neuronen konnten in der gesamten SN gezeigt werden. Zusätzlich wurde eine geringere Sensitivität der Neuronen in der anterioren SN auf die Hemmwirkung von systemisch verabreichter Valproinsäure im Kindling-Modell für TLE festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass die posteriore SNr bei gekindelten Ratten anfallsmodulierend wirkt, wohingegen der anteriore Teil der SNr bei Mechanismen, die Pharmakoresistenz vermitteln, mitwirken könnte (GERNERT et al. 2004).
Eine veränderte Informationsverarbeitung der SNr bei gekindelten Ratten macht sich auch in nachgeschalteten Kernen und ihren Neuronen bemerkbar. Der SC ist eine der Zielregionen, insbesondere des anterioren Teils der SNr, und gibt somit die Anfallsmodulierung der SNr an andere Hirnregionen weiter (BECKSTEAD et al.
1981; GERFEN et al. 1982; GARANT u. GALE 1987). Die posteriore SNr sendet aber auch zahlreiche Projektionen zum PPN (LEE et al. 2000). In einer Studie von NOLTE et al. (2006) konnte gezeigt werden, dass PPN-Neurone gekindelter Tiere 24 h nach einem Anfall eine verringerte Entladungsrate gegenüber Kontrolltieren aufwiesen. Das Entladungsmuster dieser Neurone war unregelmäßig und burst-artig.
Diese Resultate werden vermutlich durch eine verstärkte Inhibition des PPN durch die SNr gekindelter Ratten hervorgerufen, was möglicherweise zu einer erleichterten Ausbreitung der epileptischen Aktivität im Gehirn beitragen könnte.
Die gestörte Aktivität der SNr lässt sich über veränderte afferente Eingänge modulieren. Exzitatorische glutamaterge Eingänge erhält die Struktur vom STN.
Frühere Studien zeigten, dass bilaterale Injektionen eines GABA-Agonisten in den STN oder eine hochfrequente Stimulation die Aktivität nigraler Neurone senkt (BENAZZOUZ et al. 1995; FÉGER et al. 1992). Beide Wege, die glutamaterge Übertragung zu senken, führen zu einer Unterdrückung epileptischer Anfälle in verschiedenen Epilepsie-Modellen einschliesslich dem Amygdala-Kindling-Modell der TLE (DEPAULIS et al. 1994; DERANSART et al. 1996; DERANSART et al. 1998;
DYBDAL u. GALE 2000; VELίSKOVÁ et al. 1996).
Im Einklang mit diesen Resultaten wurde nachgewiesen, dass subthalamische glutamaterge Neurone gekindelter Ratten 24 h nach einem generalisierten Anfall
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vermehrt burst-artig feuern (FEDROWITZ et al. 2002). Der STN spielt deshalb bei der Erforschung der Netzwerkveränderungen bei der TLE eine bedeutende Rolle.
Das Striatum übt ebenfalls einen großen Einfluss über den direkten, als auch über den indirekten Weg auf die SNr aus (DELONG u. WICHMANN 2007; PARENT u.
HAZRATI 1995a). Immunhistochemische Untersuchungen belegten eine Reduktion der GAD-Aktivität und des GABA-Levels im Striatum gekindelter Ratten eine Woche nach dem letzten generalisierten Anfall (LÖSCHER u. SCHWARK 1987). Dabei wurden die Ergebnisse beider Hirnhemisphären gepoolt ausgewertet, so dass keine Unterscheidung in ipsi- oder kontralateral zur Kindlingelektrode erfolgte. Eine reduzierte Neuronendichte im Striatum konnte mittels GABA-Immunhistochemie in gekindelten Ratten allerdings nicht gezeigt werden (LÖSCHER et al. 2006a).
Hingegen konnte eine erhöhte Dichte GAD67-exprimierender Neurone im anterioren Striatum kontralateral zur Kindlingelektrode detektiert werden. Tatsächlich gibt es sowohl durch Untersuchungen an epileptischen Patienten als auch gekindelten Tieren Hinweise, die für eine bilaterale Beteiligung epilepsie-induzierter Netzwerkveränderungen sprechen (JOO et al. 2006; KÜCKER et al. 2010). KÜCKER et al. (2010) konnten eine veränderte Aktivität der Projektionsneurone im anterioren Striatum gekindelter Ratten 24 h nach einem generalisierten Anfall zeigen. In dieser Studie wiesen die Projektionsneurone des anterioren Striatums ipsilateral zur Kindlingelektrode vermehrt unregelmäßige Entladungen auf, wohingegen die Projektionsneurone kontralateral zur Elektrode erhöhte spontane Entladungsraten zeigten (KÜCKER et al. 2010).
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2.3. Untersuchte Rezeptortypen
2.3.1. Der calcium-aktivierte Kaliumkanal mit geringer K+-Leitfähigkeit (KCa2.2;
SK2)
Nach der internationalen Union für Pharmakologie werden calcium-abhängige Kaliumkanäle mit einer geringen Leitfähigkeit für K+-Ionen mit KCA abgekürzt (WEI et al. 2005). Eine andere übliche Bezeichnung für diese Kanalgruppe lautet SK und soll im Folgenden in dieser Arbeit verwendet werden (KÖHLER et al. 1996). Schwach leitende calcium-aktivierte Kaliumkanäle (SK-Kanäle) sind kaliumselektive, spannungsunabhängige Kanäle, die durch die ansteigende intrazelluläre Calciumkonzentration während eines Aktionspotentials aktiviert werden.
Die SK-Kanäle spielen eine große Rolle bei der Kontrolle der Erregbarkeit von Neuronen (KÖHLER et al. 1996). Wird ein Aktionspotential in einem Neuron generiert, kommt es durch Öffnung calcium-selektiver Kanäle zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration. Dieser Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration führt zu der Aktivierung der SK-Kanäle. Dabei interagieren die Calciumionen mit dem Protein Calmodulin, das mit dem SK-Kanal in Verbindung steht. Die Bindung der Ca2+-Ionen an das Calmodulin führen zu Konformationsänderungen und schliesslich zu der Öffnung des SK-Kanals (KEEN et al. 1999; SCHUMACHER et al. 2001; XIA et al. 1998).
Die Aktivierung eines SK-Kanals resultiert in einer Hyperpolarisation der Membran, welche die Frequenz der Aktionspotentiale der Zelle limitiert. Die Hyperpolarisation wird als Nachhyperpolarisation bezeichnet. In vielen Neuronen werden Aktionspotentiale von einer Nachhyperpolarisation gefolgt, die aus verschiedenen Phasen (langsame, mittlere und schnelle Phase) besteht, welche die Aktivierung verschiedener Kaliumionenströme reflektieren (Abb. 7; SAH 1996; STORM 1987, 1990). Die Nachhyperpolarisation sorgt für eine Adaptation der Feuerfrequenz und schützt die Zelle vor einem übererregten Zustand. Des Weiteren ist dieses Phänomen essentiell für eine normale Signalübertragung zwischen Neuronen (LANCASTER et al. 1986; MADISON et al. 1984; SAH et al. 1996).
Die SK-Kanäle sind den spannungsabhängigen Kaliumkanälen strukturell sehr ähnlich. Sie bestehen aus vier Untereinheiten mit sechs Transmembran-Domänen.
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Die N- und C-terminalen Endigungen sind im Zytosol lokalisiert (PEDARZANI et al.
2000; SAILER et al. 2002; VERGARA et al. 1998). Es wurden drei Typen der SK- Kanäle bei Säugern nachgewiesen, die durch drei verschiedene Gene kodiert werden: SK1 (KCa2.1), SK2 (KCa2.2) und SK3 (KCa2.3). Diese drei Typen können durch ihre Sensitivität bezüglich des Bienengifts Apamin, dass eine blockierende Wirkung auf die SK-Kanäle ausübt, unterschieden werden (BLATZ u. MAGLEBY 1986; BURGESS et al. 1981; ROMEY et al. 1984).
Die Expression der Kanäle SK1, SK2 und SK3 erfolgt in unterschiedlichen Mustern im ganzen zentralen Nervensystem, wobei der SK2-Kanal der am weitesten verbreitete Kanaltyp ist (KÖHLER et al. 1996; SAILER et al. 2004). In den Regionen der Basalganglien konnte durch in situ-Hybridisierung unter anderem eine moderate Expression der mRNA des SK2-Kanals im STN als auch eine hohe Expression der mRNA dieses Kanals in Neuronen der SNr nachgewiesen werden (GU et al. 1992;
SEUTIN et al. 1993; SHEPHARD u. BUNNEY 1991; PING u. SHEPHARD 1996;
STOCKER u. PEDARZANI 2000).
Abb. 7: Linke Abbildung: Spikemuster eines Neurons mit anschliessender Nachhyperpolarisation durch die schwach leitenden calcium(Ca2+)-aktivierten Kalium(K+)-Kanäle (SK). Rechte Abbildung: SK- Kanal Typ 2 (SK2) der durch einströmendes Calcium aktiviert wird (modifiziert nach MURPHY 2009).
Die Rolle der SK-Kanäle bei der Modulation der Neuronenerregbarkeit, der synaptischen Plastizität und der Signalübertragungsstärke weist darauf hin, dass die Kanäle möglicherweise auch bei neuronalen Erkrankungen, wie Epilepsie beteiligt sind. Diese Proteine könnten entweder ein Teil des kausalen Mechanismus der
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neurologischen Dysfunktion sein, oder aber auch ein potentielles therapeutisches Zielmolekül (PEDARZANI u. STOCKER 2008). Aus diesem Grund wurden die Kanäle in der vorliegenden Arbeit im Kindling-Modell der TLE untersucht.
2.3.2. Bedeutung der SK-Rezeptorkanäle für TLE
Wie bereits beschrieben, spielen SK-Kanäle eine wichtige Rolle bei der Modulation der Neuronenerregbarkeit, synaptischer Plastizität und der Signalübertragungsstärke und stellen daher ein potentielles therapeutisches Zielmolekül bei der Behandlung von Epilepsie dar (PEDARZANI u. STOCKER 2008). Da bisher über die Rolle der SK-Kanäle für TLE noch keine Studien bekannt sind, werden im Folgenden die Erkenntnisse der Rolle dieser Kalium-Kanäle für Epilepsie im Allgemeinen betrachtet.
Eine frühere Studie von MCCOWEN und BREESE (1990) zeigte, dass eine Blockade der SK-Kanäle durch Verabreichung hoher Dosen des SK-Kanal-Inhibitors Apamin in eine bestimmte Hirnstruktur, den inferioren Colliculus, spontane Anfälle bei naiven Ratten auslösen kann. Da der SK2-Kanal von den SK-Kanälen die höchste Sensitivität gegenüber Apamin aufweist (KÖHLER et al. 1996), deutet das Ergebnis daraufhin, dass der SK2-Kanal bei Epilepsien funktionell bedeutsam ist. Dies führt zu der Annahme, dass Stoffe, welche die Aktivität der SK-Kanäle fördern, eine mögliche Anwendung bei der Behandlung von Epilepsie finden könnten (BLANK et al. 2004;
FABER u. SAH 2007).
Neben der potentiellen Bedeutung der SK2-Kanäle für therapeutische Manipulationen von Epilepsien finden sich Hinweise auf epilepsie-induzierte Veränderungen der SK2-Kanäle in einem genetischen Tiermodell für audiogene Reflexepilepsie (N´GOUEMO et al. 2009). In zahlreichen in vitro-Modellen für induzierte Epilepsie in hippokampalen Schnitten oder Schnittkulturen wurde zudem eine Verringerung der durch SK-Kanäle hervorgerufenen Nachhyperpolarisation festgestellt, welche das Auftreten der epileptischen Aktivität begleitete (FERNÁNDEZ DE SEVILLA et al. 2006). Weitere Studien belegen, dass SK-Kanal-Inhibitoren die Dauer und den Anstieg der epileptischen burst-artigen Aktivität in der hippokampalen CA3-Region beeinflussen (EMPSON et al. 2001; FERNÁNDEZ DE SEVILLA et al.
2006). Schliesslich konnte bereits gezeigt werden, dass eine Verstärkung der SK- Kanal-Aktivität durch Agonisten des Rezeptors zu einer Aufhebung der epileptischen
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Aktivität in hippokampalen Schnitten führt (FERNÁNDEZ DE SEVILLA et al. 2006;
GARDUNO et al. 2005; LAPPIN et al. 2005).
In Regionen der Basalganglien konnte, wie bereits erwähnt, eine moderate Expression der mRNA des SK2-Kanals im STN als auch eine hohe Expression der mRNA dieses Kanals in Neuronen der SNr nachgewiesen werden (GU et al. 1992;
PING u. SHEPHARD 1996; SEUTIN et al. 1993; SHEPHARD u. BUNNEY 1991;
STOCKER u. PEDARZANI 2000). SK2-Kanäle werden u.a. in den GABAergen Neuronen der SNr exprimiert (STOCKER u. PEDARZANI 2000). Diese Neuronen sind spontan aktiv. Werden sie dem SK-Kanal-Inhibitor Apamin ausgesetzt, so führt dies durch die Reduktion der Nachhyperpolarisation zu einer Änderung des spike- artigen Feuermusters zu einem burst-artigen Feuermuster (YANOVSKY et al. 2005).
Ein verändertes Feuermuster der SNr-Neuronen ist in Tiermodellen für Epilepsie charakteristisch (BONHAUS et al. 1986; DERANSART et al. 2003; GERNERT et al.
2004). Da die SNr und der STN ein große Rolle bei der Ausbreitung von komplex- fokalen Anfällen, wie sie bei TLE vorkommen, spielen, wurden in dieser Arbeit die SK2-Kanäle im Kindling-Modell der TLE in den beiden Regionen untersucht.
2.3.3. Der GABAA-Rezeptor
Die γ-Aminobuttersäure (GABA) ist der häufigste inhibitorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (BORMANN 2000). Als solcher begrenzt GABA die Erregbarkeit der Neuronen in allen Gebieten des adulten Gehirns (NUTT u. MALIZIA 2001). Eine exzessive GABAerge Transmission führt zu Sedation, Amnesie und Ataxie wohingegen eine mildere Transmission zu Schlaflosigkeit und Ruhelosigkeit führt (NUTT 2006). GABA wird in präsynaptischen Neuronen synthetisiert und in synaptischen Vesikeln gelagert. Nach der Aktivierung des Neurons fusionieren diese Vesikel mit der präsynaptischen Membran wodurch es zur Freisetzung von GABA kommt. Der Neurotransmitter wird in den synaptischen Spalt ausgeschüttet und kann dann an GABA-Rezeptoren binden, die in der postsynaptischen Membran lokalisiert sind. GABA kann zudem durch Diffusion in den extrasynaptischen Raum gelangen und an GABA-Rezeptoren binden, die am postsynaptischen Neuron extrasynaptisch lokalisiert sind. Die Wirkung des Neurotransmitters wird durch GABA-Transporter in
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der präsynaptischen Membran sowie von Gliazellen, die ebenfalls GABA aufnehmen, beendet. Somit wird der Spiegel an extrazellulärem GABA durch das Gleichgewicht zwischen GABA-Ausschüttung durch das präsynaptische Neuron und der GABA- Aufnahme durch GABA-Transporter bestimmt (CHERUBINI u. CONTI 2001; DEKEN et al. 2003). Es werden zwei Rezeptor-Typen für GABA unterschieden. Die ionotropen GABAA und GABAC sowie die metabotropen GABAB-Rezeptoren (BORMANN 2000). Der vorherrschende Rezeptortyp im Gehirn ist der GABAA- Rezeptor (BOWERY et al. 1987). Dieser soll in der vorliegenden Arbeit untersucht werden.
GABAA-Rezeptoren bestehen aus 5 Untereinheiten, die ringförmig um eine zentrale, wassergefüllte Pore angeordnet sind. Wird der Rezeptor durch GABA aktiviert, kommt es zu einem Influx von Chlorid-Ionen, der zu einer neuronalen Hyperpolarisation bzw. zu einer Stabilisierung des Membranpotentials führt (NUTT u.
MALIZIA 2001). Bei Säugetieren konnten insgesamt 19 Untereinheiten differenziert werden: α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, ρ1-3, θ und π (BARNARD 2000; KORPI et al. 2002;
SIMON et al. 2004). Die Verteilung der Untereinheiten in den verschiedenen Hirnregionen ist unterschiedlich (PIRKER et al. 2000). Tabelle 1 gibt einen immunhistochemischen Nachweis der Rezeptoruntereinheiten, die in dieser Arbeit untersucht wurden, im naiven Rattenhirn in Regionen der Basalganglien und dem PPN, wieder (PIRKER et al. 2000):
α1 α2 α3 α4 β2 β3 γ2 δ
Striatum ++zz +++ +zz +++ ++zz ++++ + ++
SNr +zz # +z +z ++ - ++ z
SNc ## # ++zz ++zz # - ++ +z
STN ++zz ++zz + + ++ ++ + +
GP zzz + z z zzz + + +z
PPN + - + +z + + + zz
Tab. 1: Immunhistochemischer Nachweis der Untereinheiten des GABAA-Rezeptors in Basalganglienregionen der Ratte (nach PIRKER et al. 2000). Diffuse Färbung: +, Zellkörper sind angefärbt: z, nur Nervenzellfortsätze sind gefärbt: #. Die Häufigkeit der Symbole gibt das Ausmaß der
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Färbung von nicht gefärbt (-) bis zur maximalen Färbeintensität (4 Symbole) wieder. Substantia nigra pars reticulata (SNr), Substantia nigra pars compacta (SNc), subthalamischer Nucleus (STN), Globus pallidus (GP), pedunculopontiner Nucleus (PPN).
Im Zentralnervensystem werden überwiegend Rezeptoren bestehend aus α1β2γ2 exprimiert, gefolgt von α2β3γ2 und α3β3γ2-Isoformen. Die α- und die β- Untereinheiten tragen zur GABA-Bindungsstelle bei (Abb. 8; ALEXANDER et al.
2007). Die verschiedenen Isoformen üben einen großen Einfluss auf die Bindungseigenschaften des Rezeptors aus, da sie von einer Vielzahl positiver und negativer allosterischer Modulatoren, einschliesslich Barbituraten, Benzodiazepinen, Neurosteroiden, Penizillinen, Picrotoxin, Bicucullin und Zink moduliert werden können (KAPUR u. MACDONALD 1997). Da Barbiturate und Benzodiazepine als gängige Antiepileptika eingesetzt werden, ist die Zusammensetzung der GABAA- Rezeptoruntereinheiten für eine therapeutische Behandlung von Patienten mit neurologischen Erkrankungen, wie TLE, von großer Bedeutung (MACDONALD u.
OLSEN 1994).
Abb. 8: Der GABAA-Rezeptor. Mögliche Kombinationen der verschiedenen Untereinheiten und die Bindungsstellen für GABA und Benzodiazepine (BZs) sind dargestellt (nach JACOB et al. 2008).
Die Rezeptorkomposition α1β1γ2 ist beispielsweise sensitiv für die Benzodiazepine Zolpidem und Diazepam, wohingegen α2β1γ2-Rezeptoren eine hohe Diazepam- und geringe Zolpidemsensitivität aufweisen. Die α4β1γ2-Rezeptoren hingegen sind insensitiv gegenüber Benzodiazepinen (MACDONALD u. KAPUR 1999;
MACDONALD u. KELLY 1995). Für die Bindung von Barbituraten ist die β-
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Untereinheit des GABAA-Rezeptors essentiell. Beeinflusst wird diese Bindung durch die jeweilige α-Untereinheit des Rezeptors (DRAFTS u. FISHER 2006). Barbiturate erhöhen die Dauer der Kanalöffnung (MACDONALD et al. 1989; TWYMAN et al.
1989), wohingegen Benzodiazepine die Frequenz der Rezeptoröffnung erhöhen (ROGERS et al. 1994; VICINI et al. 1987). Die Sensitivität von GABAA-Rezeptoren bezüglich der Benzodiazpine erfordert die Präsenz einer γ-Untereinheit, wobei die relative Affinität für viele Benzodiazpinrezeptor-Agonisten wiederum auf der jeweiligen α-Untereinheit des Rezeptors basiert (KAPUR u. MACDONALD 1997).
Die verschiedenen GABAA-Rezeptortypen sind entweder innerhalb oder außerhalb der Synapse in der Membran des postsynaptischen Neurons lokalisiert. Die am häufigsten exprimierten GABAA-Rezeptoren (α1β2γ2, α2β3γ2, α3β3γ2) im Zentralnervensystem sind überwiegend innerhalb der Synapse angeordnet und an der relativ kurzen, phasischen Inhibition durch die Ausschüttung von GABA in den synaptischen Spalt beteiligt. Durch die GABA-Ausschüttung kommt es zu einer vorübergehenden Aktivierung der GABA-Rezeptoren, die zu der phasischen Inhibition führt (FARRANT u. NUSSER 2005; GOETZ et al. 2007; KULLMANN et al.
2005; SEMYANOV et al. 2004).
Die extrasynaptischen Rezeptoren, enthalten häufig eine δ-Untereinheit. Sie spielen eine Rolle bei der durch GABA vermittelten lang anhaltenden, tonischen Inhibition, die durch eine anhaltende Aktivierung der GABA-Rezeptoren vermittelt wird. Die tonische Inhibition kommt durch die Diffusion von überschüssigem Neurotransmitter aus der Synapse zustande (Abb. 9; BRICKLEY et al. 1996; KULLMANN et al. 2005;
ROSSI u. HAMANN 1998; WHITING 2003).
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Abb. 9: Verteilung der GABAA-Rezeptortypen innerhalb und außerhalb der Synapse (modifiziert nach JACOB et al. 2008).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression der GABAA-Rezeptoruntereinheiten α1-4, β2/3, γ2 und δ in Regionen der Basalganglien und dem PPN untersucht.
2.3.4. Bedeutung des GABAA-Rezeptors für TLE
Wie in Kap. 2.3.3. beschrieben, vermitteln GABAA-Rezeptoren die inhibitorische Signalübertragung zwischen den Neuronen im Gehirn. Viele Forschungsarbeiten weisen daraufhin, dass Veränderungen in der GABAergen Signalübertragung zu epileptischen Anfällen führen können (DEDEYN et al. 1990; KANG u. MCDONALD 2009; MELDRUM 1989; NISHIMURA et al. 2005). Bei experimenteller TLE wurden bereits biochemische, pharmakologische und elektrophysiologische Veränderungen im GABAergen System in den Basalganglien beschrieben. Auf biochemischer Ebene zeigten frühere Studien am Tiermodell der TLE beispielsweise, dass die Aktivität des GABA-synthetisierenden Enzyms Glutamatdecarboxylase, sowie der GABA-Level in der SN gekindelter Ratten signifikant reduziert ist (LÖSCHER u. SCHWARK 1985, 1987). Des Weiteren konnte pharmakologisch eine antikonvulsive Wirkung durch lokale Hemmung der anterioren oder posterioren SNr beobachtet werden (SHEHAB et al. 1996; VELíSKOVÁ et al. 1998). GERNERT et al. (2004) konnten durch
