Oberflächen-Ligation und -Entschwefelung

Daraufhin wurde eine simultane CuAAC-Immobilisierung und Ligation untersucht.

Es wurden zwei Äquivalente Thioester 88 mit dem Cysteinylpeptid 106 auf einer Azido-funktionalisierten Platte 100 im HEPES-Puffer umgesetzt (Abbildung 4.9 A). In der Bachelorarbeit von Michael Krumrey wurde gezeigt, dass bei einer Kupfersulfat-Kon-zentration von über 1 µM die NCL inhibiert wird (Abbildung 6.2, Seite 156).^[212] Diese Beobachtung kann durch Koordination des Cysteinlypeptids mit dem Kupferzentrum erklärt werden. Cysteinylpeptide sind bekannte Liganden für Cu⁺/Cu²⁺.^[213] Bei Verwen-dung von 0.5 µM CuSO4 und 1 µM THPTA im Puffer mit 200 µM Thioester 88 und 100 µM Cysteinylpeptid 106 war die simultane Ligation und Immobilisierung, mit einer nach Gl. 1 berechneten Stoffmenge von 69 pmol/Kavität und einer Ausbeute von 46%

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erfolgreich (Abbildung 4.9 B). Anschließende Behandlung mit dem Entschwefelungs-puffer (3 M GdmCl, 0.1 M NaH2PO4, 200 mM VA-044, 250 mM TCEP, 80mM tBuSH, pH 6.8, 16 h bei 40°C) und Bestimmung des oberflächengebundenen Biotins offenbarte, dass etwa 15 pmol Ligationsprodukt 107 während der Entschwefelung von der Oberflä-che verdrängt wurden.

88

106 100

107

108

Abbildung 4.9 A: Simultane CuAAC-Immobilisierung und NCL mit anschließender Entschwefelung auf der Oberflä-che. B: Nach CuAAC/NCL sowie nach der Entschweflung bestimmte Ausbeuten mittels HRP-SA-Assay.

Die Ligation und Entschwefelung ist demnach gelungen, allerdings verwundert der Ver-lust an Ligationsprodukt während der Entschwefelung. Vermutlich fand die NCL auch mit dem unspezifisch gebundenen Peptid 106 statt oder ein gebildetes Ligationsprodukt wurde unspezifisch adsorbiert. Diese unspezifische Bindung könnte durch die harschen Entschwefelungsbedigungen abgelöst worden sein. Trotzdem wäre die Stoffmenge von 55 pmol pro Kavität (37% Ausbeute) für anschließende Bindungsmessungen noch aus-reichend hoch. Die Ni-NTA-Platten haben ein maximale Beladung von 9 pmol/Kavität, die GSH-Platten eine von 0.3 pmol/Kavität).^[210]

Mit diesen Resultaten wurde die Übertragung der Methode auf die Synthese der SH3-Domäne des YSC84 Proteins vorgenommen. Das C-terminal Propargylglycin funk-tionalisierte Cysteinylpeptid 109 wurde mittels Fmoc-SPPS am Rinkamid-Harz synthe-tisiert. Es wurde 109 (100 µM in 12 Kavitäten) simultan mit dem Thioester 54 (200 µM) über eine NCL umgesetzt. Simultan wurde der C-Terminus mit der Azido-Platte via CuAAC verbunden (Abbildung 4.10 A). Drei benachbarte Kavitäten wurden als Gruppe zusammengefasst (NCL1-4). Bei der Ausbeutebestimmung nach NCL und Ent-schweflung mittels HRP-SA-Analyse präsentierte sich eine breite Verteilung der Stoff-menge zwischen den Kavitäten und Gruppen. Die Ausbeute für das Produkt 111 schwankte zwischen 14 ± 6.9 pmol (9% Ausbeute) und 106 ± 5.8 pmol (71%). Die

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Verteilung innerhalb einer Gruppe kann an Hand der relativ großen Fehlerbalken ab-geschätzt werden (Abbildung 4.10 B). Dieses Ergebnis ist verwunderlich, da alle Kavi-täten gleichbehandelt wurden. Die großen Unterschiede in den Produktausbeuten tra-ten auch bei wiederholter Durchführung auf.

54 100

109 110 111

⁹⁹ 112

113 113

114 100 CuSO4 115

Abbildung 4.10 A: Oberflächenimmobilisierung und NCL, sowie anschließende Entschwefelung der SH3-Domäne des YSC84 Proteins. B: Mittels HRP-SA und Gl.1 berechneten Stoffmengen pro Kavität nach NCL und Entschwefe-lung. NCL1-4 wurden alle unter den gleichen Bedingungen zeitgleich in der gleichen Mikrotiterplatte durchgeführt.

C: Beobachtete Dimerisierung des Linkermoleküls 99, wobei eine Azidofunktion zum Amin reduziert wird. Diese lässt sich mit dem Azid 113 wieder zu der Linkervorstufe 114 umsetzen. D: Mögliche Reduktion des Azids auf der Oberfläche durch TCEP und Thiole, sowie mögliche Regenerierung mittels Azid 113.

Um festzustellen was zu diesen unterschiedlichen Ausbeuten führte, wurde der Azidothiol-Linker analysiert. Nach einem Monat Lagerung wurde dieser mittels NMR-Spektroskopie und HPLC-MS untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine quantitative Um-wandlung zu dem Disulfid 112 stattgefunden hatte (Abbildung 4.10 C). Das Massen-spektrum (Abbildung 6.1, Seite 153) und das ¹H-NMR Spektrum offenbarte (Abbildung 10.1, Seite 225), dass ein Azid zum Amin reduziert wurde. Ein weiterer indirekter Strukturbeweis dafür wurde dadurch erbracht, dass durch die Behandlung von 112 mit 1H-Imidazol-1-sulfonyl-Azid 113 und katalytischen Mengen CuSO4, die Diazido-Verbin-dung 114 massenspektroskopisch nachgewiesen wurde. Dieser Reaktionsverlauf (Abbil-dung 4.10 C) kann durch Stickstoffeliminierung bei gleichzeitiger Oxidation zweier Thi-ole zum Disulfid erklärt werden. Die Oxidationsstufen der ThiThi-ole ändert sich dabei von -2 auf -1 und die des Alkan-gebundenen Stickstoffs von -1 auf -3. Die Reduktion von Aziden zu Aminen unter Oxidation von Thiolen ist in der Literatur bekannt. A-rylazide werden quantitativ bei physiologischen pH-Wert von Dithiolen z.B. Dithioth-reitol (DTT), aber auch langsamer von Monothiolen (2-Mercaptoethanol und GSH)

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reduziert.^[214] Darüber hinaus ist auch bekannt, dass Phosphine allgemein Azide redu-zieren. Diese Reaktion wird als Staudinger-Reduktion bezeichnet.^[215] Es ist darüber hinaus beschrieben worden, dass TCEP im Speziellen ebenfalls Azide reduziert.^[216] So-mit können das verwendete 2-Mercaptoethanol oder TCEP (während der Blockierung der Platten, der Azido-Funktionalisierung oder NCL/Immobilisierung) bestehende Azidogruppen in Amine reduziert haben (Abbildung 4.10 D). Nach Behandlung mit Azidothiol-Linker 99 und anschließender Blockierung mit 20 mM 2-Mercaptoethanol (0.1 M NaH2PO4, 20 mM Na(CN)BH3, 1 mM TCEP, pH 8) wurden je drei Kavitäten mit dem Azid-erzeugenden Reagenz 113 behandelt. Danach wurde eine CuAAC mit Peptid 101 in allen sechs Kavitäten durchgeführt. Die drei Kavitäten, welche vorher mit Azid 113 behandelt wurden, zeigten eine 2.9-fach höhere Stoffmenge 87 ± 11 pmol (58% Ausbeute) im Vergleich zu den drei Kavitäten ohne Azid-Reaktivierung mit 29 ± 1 pmol (19%) (Abbildung 6.3, Seite 157). Dies bestätigt indirekt, dass während der Funktionalisierung und/oder Blockierung, die Azido-Funktionen an der Oberfläche zu Aminen reduziert wurden.

4.2.3 Diskussion und Fazit

Die Oberflächenimmobilisierung von C-terminalen Peptid-Alkinen durch CuAAC mit Azido-funktionalisierten Mikrotiterplatten ist prinzipiell gelungen. Die Azidogrup-pen waren anfällig gegenüber einer Reduktion zum Amin auf den Platten 100 und auch bei der Lagerung des Linkers 99. Dieser Sachverhalt zusammen mit der geringen Re-produzierbarkeit, bzw. großen Differenz zwischen einzelnen Kavitäten bei der NCL, ließ die Methode der CuAAC-Immobilisierung als ungeeignet erscheinen. Eine Oberflächen-synthese die eine uniforme Verteilung von Protein-Domänen liefert ist notwendig für die folgenden Bindungsmessungen, da gleiche Domänenkonzentrationen für die Ober-flächen-Fluoreszenzsättigungsanalyse nötig sind. Eine alternative Immobilisierungsme-thode die kovalent und verlässlich ist, wurde daher gesucht.

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4.3 Oberflächensynthese und -analyse von Hefe-SH3-Domänen via