Oberflächen-Fluoreszenzsättigungsanalyse mit SH3-Domänen von Hefe

jede Vertiefung mit 100 µl PBS-Puffer und 0.1 ma.% RBR versetzt. Die Titerplatte wurde 1 h geschüttelt. Der Nullwert der Fluoreszenz in diesem Platten wurde bestimmt.

Anschließend wurde das FAM-markierte Peptid in Konzentrationen von 0.02 µM, 0.05 µM, 0.1 µM und 0.2 µM im Puffer (0.1 ma.% RBR in PBS) zu je vier Vertiefungen hinzugefügt. Nach 30 min Inkubation mit den FAM-Peptiden, wurde der Puffer aus den Vertiefungen durch Schleudern der Platte entfernt. Danach wurden die Wells 3×

mit PBS-Puffer gewaschen (100 µl pro Vertiefung). Zum Waschen wurde die Titerplatte mit einer Frequenz von 600 rpm über 5-10 sec geschüttelt. Schließlich wurden 100 µl PBS in jede Vertiefung gegeben, und die Fluoreszenz wurde mit einem Plattenlesegerät gemessen (1s Zeitzählung pro Vertiefung, 485 nm Anregungswellenlänge mit normaler Öffnung 4 mm, 535 nm Emissionswellenlängenfilter mit kleinen Öffnung 4 mm). Danach wurden die Vertiefungen mit neuen Konzentrationen 0.39 µM, 0.78 µM, 1.56 µM bzw.

3.13 µM desselben FAM-Peptids (0.1 ma.% RBR in PBS) versetzt. Nach 30 min Inku-bation, Waschen und Fluoreszenzmessungen wurde das Verfahren mit Konzentrationen von 6.25 µM, 12.5 µM, 25 µM oder 50 µM des FAM markierten Peptids wiederholt. Die Messungen wurden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt. Das Waschen mit Millip-ore-HQ-Wasser löste gebundene und ungebundene Liganden (unspezifische Bindung) von der Platte ab. Fluoreszenzmessung nach mehrmaligem Waschen mit Wasser zeigte

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kein gebundenes Peptid mehr in den Platten. Die erneute Bestimmung der Stoffmenge von oberflächengebundenen SH3-Domänen mittels HRP-SA-Assay (Abschnitt 6.4.3, Seite 148) bestätigte allerdings, dass die Domänen sich noch auf der Oberfläche befan-den. Die Platte konnte somit für andere Bindungstest mit anderen Liganden verwendet werden. Für die Messung des 3PB1 (203) und des ID-Peptids (206) wurden die Kon-zentration in jedem Titrationsschritt verdoppelt.

Die Daten wurden unter Verwendung von Prism 5.03 für Windows (GraphPad Soft-ware, Inc., San Diego, CA, USA) analysiert. Die Messungen von vier Vertiefungen mit identischen Konzentrationen von FAM-Peptid repräsentieren einen Datenpunkt. Die vier Werte jeder Vertiefung wurden verwendet um Mittelwerte und Standardabwei-chung (SD) von diesem Datenpunkt zu berechnen (SD wurde für Fehlerbalken verwen-det). Die vier letzten Datenpunkte wurden verwendet, um den linearen Anteil unspe-zifischer Adsorption an der Platte zu subtrahieren. Die Steigung dieser vier Datenpunkte wurde mittels linearer Regression bestimmt und 70% der Steigung von allen Werten abgezogen. Der Prozentsatz von 70% wurde als der beste ermittelt, um Literaturbekannte oder über andere Methoden ermittelte KD-Werte zu reproduzieren (Fluoreszenzpolarisation, Tryptophan Fluoreszenz). Dieses Verfahren war notwendig, da manche Messungen einen hohen Anteil an unspezifischer Bindung des FAM-Peptids vermuten ließen. Die unspezifische Adsorption würde bei Proteinen mit niedriger Affi-nität verhältnismäßig hohe Mengen gebundener Liganden vortäuschen. Die berechneten KD-Werte wären zu klein, womit die Affinität überschätzt wird. Bei vielen Messungen hatte die Substitution keinen Einfluss auf das Ergebnis. Zwei Beispiele für eine Regres-sion mit und ohne Berücksichtigung von nicht-spezifische Adsorption sind unten ge-zeigt. Bei geringer unspezifischer Adsorption des Peptids und hoher Affinität zu der SH3-Domäne war der erhaltene KD-Wert vor und nach der Hintergrundkorrektur iden-tisch (Abbildung 6.5 links). Bei Peptiden die eine hohe Tendenz zur Adsorption an der Platte sowie eine geringe Affinität zur Domäne hatten war das Vorgehen notwendig (Abbildung 6.5 rechts).

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Abbildung 6.5 Beispiele für die Durchführung einer Hintergrundkorrektur der bei der Oberflächen-Fluoreszenzsät-tigungsanalyse erhaltenen Daten. Links ist die Korrektur für eine Affinätsmessung gezeigt, bei der die Hintergrund-korrektur keine Änderung der berechneten Affinität ergab. Rechts ist eine Analyse dargestellt, bei der ohne Hinter-grundkorrektur keine Affinität berechnet werden.

In jeden Fall wurde der lineare Anteil, der durch Regression der letzten vier Daten-punkte ermittelt wurde, von den erhalten MessDaten-punkten subtrahiert und danach wurden mit diesen Hintergrund-korrigierten Datenpunkten die hyperbole Regressionen nach Gl.

2 (Seite 68) mit GraphPad Prism durchgeführt. Alle ermittelten Datenpunkte mit zu-gehörigen Bindungsisothermen sind im Anhang zu finden.

0 20 40

lineare Regression der letzten 4 Datenpunkte

[Peptid] / µM

lineare Regression der letzten 4 Datenpunkte

[Peptid] / µM

Beispiel für die Hintergrundkorrektur bei der Oberflächen-Fluoreszenzsättigungs-Analyse YSC84-SH3-Domäne mit ACF2-Peptid pY³⁰-Abl-SH3-Domäne mit 3BP1-Peptid

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Die Software zeigte „interrupted“ oder „ambiguous“, wenn die Regression mit den eingegebenen Datenpunkten nicht erfolgreich oder unklar war. In einigen Fällen glückte die Regression, dennoch waren die Fehler der KD-Werte größer als die KD-Werte. Die Bindungsanalysen bei denen diese drei Arten von Regressionensergebnissen auftraten wurden als „keine Affinität bestimmbar“ (kAb) klassifiziert. Zum Vergleich der Mes-sungen und Regressionen von leeren Kavitäten und Platten mit Domänen die nach der oben genannten Definition keine bestimmbaren Affinitäten zu den getesteten Bindern hatten, sind unten gezeigt.

0 50 100

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Expression und Reinigung des YSC84 SH3-GST-Fusionsproteins

Die Expression des GST-SH3-Domäne (YSC84) Fusionsproteins wurde von Cesareni et al. beschrieben.^[275] Ein geeigneter Expressionsvektor pGEX-2TK wurde von Prof.

Gianni Cesareni (Institut für Biologie, Universität Rom Tor Vergata, Rom, Italien) gestiftet, in DH5α-Zellen amplifiziert und für die Transformation von BL21(D3)-E-scherichia coli-Zellen verwendet. Das überexprimierte GST-Fusionsprotein wurde durch Glutathion-Sepharose-Affinitätschromatographie über eine 5 ml GST-Trap-MHP-Säule von General Electric mittels FPLC gereinigt. Die Reinheit sowie eine Massenzuordnung wurde durch SDS-PAGE, MALDI-MS-Analyse und HPLC-MS (siehe unten) bestimmt.

Die gereinigte Proteinlösung wurde in dem Puffer aliquotiert und bei -25°C aufbewahrt.

Die Proteinkonzentration wurde über die Absorption bei 278 nm (ε278 = 56‘000 l·mol

-1·cm^-1) bestimmt.

Charakterisierung der rekombinanten YSC84 SH3-Domäne mit GST fusioniert. Oben links: HPLC-Spur von FPLC-Fraktion 1. Oben rechts: ESI-MS-Spektren von Peak bei 13.84 min in der HPLC. Unten links: MALDI-TOF-Spektren von FPLC-Fraktion 1. Unten rechts: SDS-PAGE (5% Stacking und 10% Laufgel, Färbung: Coomassie), M: Marker, 1:

nicht induzierten Zellen, 2: induzierten Zellen, 3: Gesamt Zelllysat vor der Reinigung, Fr .: Fraktion von FPLC Reini-gung, dil .= verdünnte Fr.1

20000 30000 40000 50000

Int.

m / z MALDI/TOF (Shimadzu)

34.3 kDa

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 20000 20

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Synthese der A21C-Mutante der YSC84-SH3-Domäne (93) durch NCL in Lösung Der Peptidthioester 54 (400 nmol) und das Cysteinylpeptid 71 (440 nmol) wurden bei 1.0 mM Konzentration im Puffer (0,1 M NaH2PO4, 6 M GdmCl, 50 mM NaAsc, 20 mM TCEP, 1 vol.% PhSH, pH 7.5) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage ge-schüttelt. HPLC-Reinigung ergab 36% des gewünschten Produkts. Ausbeute: Abs.278 = 0.223 (1 ml, 145 nmol, 36%, ε278 = 15‘400 l·mol-1·cm-1). UPLC: tR= 1.39 min (Gra-dient: 3-90% B in 4 min). ReinheitUPLC278nm = 98%. ESI-MS: 7740.74 m/z (dekonv.), MALDI/ TOF-MS: 7763.0 m/z ([M+H]⁺) (C346H520N102O98S2, berechnet: 7740.58 g·mol

-1).