Experimentelle Vorschriften zu Unterkapitel 4.4

Die in diesem Kapitel beschriebenen Arbeiten wurden zusammen mit Olaf Fuchs im Rahmen seiner Bachelorarbeit mit dem Titel: „Optimierung der selbstreinigenden Syn-these von α-Peptidthioestern, zur Generierung Phosphotyrosin-haltiger SH3-Domä-nen.“ durchgeführt.

6.7.1 Optimierung der Erstbeladung von Sulfonamid-PEG-Harzen

Die Optimierungsversuche wurden mit einem Rinkamid-ChemMatrix-Harz durch-geführt. Das Harz wurde nach dem Protokoll (Abschnitt 6.3.1, Seite 143) in einem

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50 µmol-Ansatz mit Glu und Tyr beladen. Entsprechend dem Protokoll für die Harz-synthese der selbstreinigenden PeptidthioesterHarz-synthese (Abschnitt 6.4.1, Seite 144), wurde das Harz mit 3-Carboxypropansulfonamid beladen (200 µmol, 4 Äq.) wobei das N-Sulfonamid-Dipeptid beladene Harz 173 erhalten wurde.

Optimierungsversuche zur Erstbeladung auf das Sulfonamid-Harz 173: Es wurden je ca. 2 µmol Aliquote des Harzes 173 für die Optimierungsversuche verwendet. Die entsprechende Menge an getrocknetem Harz wurde in einem Spritzenreaktor vorgelegt und 15 Minuten in Chloroform gequollen. Nach dem Abfiltrieren des Überstandes wur-den die Kupplungskonditionen zur Beladung von Fmoc-Phe-OH verwendet die in Ta-belle 4.3 und TaTa-belle 4.5 auf Seite 76, 77 aufgeführt sind. Die Ausbeuten wurden mittels Absorption der Fmoc-Abspaltungslösung, wie in Abschnitt 6.1 auf Seite 139 beschrie-ben, bestimmt. Anschließend wurde Glu gekuppelt, um eine Trennung der Diastereo-mere wahrscheinlicher zu machen. Fmoc wurde nicht abgespalten. Dann wurde das N-Fmoc-Peptid vom polymeren Träger gelöst. Die Epimerisierungswerte wurden mittels UPLC-MS bestimmt. Es wurde davon ausgegangen, dass es sich bei dem intensivsten Signal also bei dem Hauptprodukt um das (L)Phe-Diastereomer 174 handelt. Ein zwei-tes weniger intensives Signal mit dem gleichen Massenspektrum wurde als -(D )Phe-Diastereomer 174‘ angenommen. Die beiden Signale waren Basislinien-getrennt (siehe unten). Zur Quantifizierung wurden das Integral des EIC-Peaks bei der Retentionszeit des (D) und des (L)-Diastereomers verwendet.

Optimierte Erstbeladungsbedingung: Die Reaktionsbedingung welche die höchste Ausbeute und die niedrigste Epimerisierung zeigten sind im Folgenden beschrieben (be-zogen auf 2 µmol Sulfonamid-Harz 173).

Fmoc-Phe-OH

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Erst wurde das Harz 15 min in CHCl3 in einem Spritzenreaktor gequollen. Anschlie-ßend wurden 4.2 mg PyBOP (8 µmol, 4 Äq.) in 10 µl CHCl3 (1.2 M) sowie 4 Äq. der Fmoc-geschützten Aminosäure in 110 µl CHCl3/DIEA (7:3) gelöst. Die Lösungen und der Spritzenreaktor wurden mindestens 10 Minuten auf -25°C gekühlt. Anschließend wurden möglichst schnell beide Lösungen vermischt und auf das Harz gegeben. Der Spritzenreaktor wurde zwei Stunden wieder in eine -25°C-Umgebung (Tiefkühler) ge-bracht und alle 15 Minuten kurz geschüttelt. Diese Prozedur wurde einmal wiederholt.

Das Harz wurde fünfmal mit DMF gewaschen und 5 min nach Standardprotokoll blo-ckiert.

Ausbeuten und Epimerisierungswerte bei optimaler Kupplung aller proteinogenen Aminosäuren: Die Kupplung auf das Sulfonamid-Harz 173 erfolgte wie oben bei „Op-timierte Erstbeladungsbedingung“ beschrieben mit allen 20 proteinogenen Aminosäu-ren (auch erneut mit Fmoc-Phe-OH). Die Fmoc-Ausbeuten wurden ebenfalls wie oben beschrieben bestimmt (Tabelle 4.5, Seite 78). Zusätzlich wurden die Ausbeuten aus den erhaltenen UPLC-Messungen überprüft, indem die Nebenprodukte mittels EIC gesucht und quantifiziert wurden. Im Vergleich mit dem Hauptprodukt entsprachen die EIC-Ausbeuten den Fmoc-EIC-Ausbeuten. Die Epimerisierungswerte wurden ebenfalls wie oben für Phe beschrieben ermittelt. Bei den Experimenten die mit Werten von <0.1% ange-geben sind, wurde ein Massensignal der entsprechenden Diastereomerenmasse bei einer anderen Retentionszeit als dem Hauptpeak gefunden. Das EIC-Signal war allerdings zu gering für eine Integration. Die Chromatogramme sind im Anhang im Unterkapitel 10.1 ab Seite 218 zu finden.

6.7.2 Optimierte selbstreinigende Peptidthioestersynthese auf PEG-AM-Harz Die Thioester wurden nach dem Protokoll für die selbstreinigende Thioester Syn-these im Abschnitt 6.4.1 (Seite 144) synthetisiert und gereinigt. Durch die Verwendung des PEG-AM-Harzes ergaben sich allerdings Abweichungen vom Protokoll, die hier im Folgenden aufgeführt sind: Der Bromphenolblau-Test kann bei der Synthese des 4-Sulfamylbutyryl-(PhiPr)glutamyl-Glycin-Polyethylengylcol-Harzes 47 nicht angewen-det werden, da Bromphenolblau unspezifisch gebunden im Harz verbleibt. Darüber wird von dem Polyethylenglycol-Harz im Vergleich zum Polystyrol-Harz mehr Wasser gebunden. Vor Reaktionsschritten, bei denen Wasser stören könnte, muss das Harz daher intensiv getrocknet werden. Diese Schritte sind: die Kupplung des Zyklisierungs-linkers 48, die Mmt- und PhiPr-Abspaltung und die Aktivierung des Sulfonamids. Für die intensive Trocknung wird das Harz gewaschen (5x DMF, 5x trockenes THF, 5x

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trockenes DCM) und anschließend am Feinvakuum (P < 0.1 mbar) für mindestens 30 min getrocknet, so dass das Harz keine gelartige Struktur mehr hat.

Verbesserte selbstreinigende Synthese der Abl- und Arg-Peptidthioester

Die Abl- und Arg-Peptidthioester wurden nach dem optimierten Protokoll für die selbstreinigende Peptidthioestersynthese (6.7.2) hergestellt. Die erste und letzte Ami-nosäure wurde manuell gekuppelt. Ebenso wurde das Pseudoprolin-Dipeptid Fmoc-Leu-Ser(Ψ(Me,Me)Pro)-OH manuell an der LS-Position eingebaut. Die restlichen Ami-nosäuren wurden automatisiert gekuppelt (Abschnitt 6.3.2, Seite 144). Die Peptide wurden ohne zusätzliche Aufreinigung nach der TFA-Abspaltung vom polymeren Trä-ger verwendet.

K^(Bt)NLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEW-SBzl (177)

Das Peptid wurde im 10 µmol-Maßstab synthetisiert. Ausbeute: Abs.278 = 0.200 (2 ml, 0.48 µmol, 5%, ε278= 8‘400 l·mol^-1·cm^-1). UPLC: tR= 1.35 min (Gradient: 10-90% B in 4 min). ReinheitUPLC278nm = 92%. ESI-MS: 4502.67 m/z (dekonv.), MALDI/

TOF-MS: 4503.2 m/z ([M+H]⁺) (C207H310N57O57S2, berechnet: 4503.12 g·mol^-1).

H-K^(Bt)NLFVALpYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEW-SBzl (178)

Das Peptid wurde im 10 µmol-Maßstab synthetisiert. Ausbeute: Abs.278 = 0.163 (3 ml, 0.65 µmol, 7%, ε278= 7‘560 l·mol^-1·cm^-1). UPLC: tR= 2.88 min (Gradient: 3-90% B in 4 min). ReinheitUPLC278nm = 80%. ESI-MS: 4583.8 m/z (dekonv.), MALDI/

TOF-MS: 4582.4 m/z ([M+H]⁺) (C207H311N52O60S2P, berechnet: 4583.10 g·mol^-1).

H-K^(Bt)NLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGpYNHNGEW-SBzl (179)

Das Peptid wurde im 10 µmol-Maßstab synthetisiert. Ausbeute: Abs.278 = 0.235 (3 ml, 0.62 µmol, 6%, ε278= 7‘560 l·mol^-1·cm^-1). UPLC: tR= 3.03 min (Gradient: 3-90% B in 4 min). ReinheitUPLC278nm = 91%. ESI-MS: 4582.84 m/z (dekonv.), MALDI/

TOF-MS: 4583.7 m/z ([M+H]⁺) (C207H311N52O60S2P, berechnet: 4583.10 g·mol^-1).

H-K^(Bt)NLFVALpYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGpYNHNGEW-SBzl (180)

Das Peptid wurde im 10 µmol-Maßstab synthetisiert. Ausbeute: Abs.278 = 0.133 (3 ml, 0.48 µmol, 5%, ε278= 6‘920 l·mol^-1·cm^-1). UPLC: tR= 1.35 min (Gradient: 10-90% B in 4 min). ReinheitUPLC278nm = 90%. ESI-MS: 4662.55 m/z (dekonv.), MALDI/

TOF-MS: 4664.0 m/z ([M+H]⁺) (C207H312N52O63S2P2, berechnet: 4663.08 g·mol^-1).

K^(Bt)NLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLR-SBzl (193)

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Das Peptid wurde im 10 µmol-Maßstab synthetisiert. Ausbeute: Abs.278 = 0.273 (1 ml, 1.95 µmol, 20%, ε278= 1‘400 l·mol^-1·cm^-1). UPLC: tR= 2.81 min (Gradient: 3-90% B in 4 min). ReinheitUPLC278nm = 98%. ESI-MS: 3333.27 m/z (dekonv.), MALDI/

TOF-MS: 3332.6 m/z ([M+H]⁺) (C153H239N37O42S2, berechnet: 3332.89 g·mol^-1).

K^(Bt)NLFVALpYDFVASGDNTLSITKGEKLR-SBzl (194)

Das Peptid wurde im 10 µmol-Maßstab synthetisiert. Ausbeute: Abs.278 = 0.250 (1 ml, 3.78 µmol, 38%, ε278= 1‘400 l·mol^-1·cm^-1). UPLC: tR= 2.81 min (Gradient: 3-90% B in 4 min). ReinheitUPLC278nm = 94%. ESI-MS: 3412.60 m/z (dekonv.), MALDI/

TOF-MS: 3414.0 m/z ([M+H]⁺) (C153H240N37O45S2P, berechnet: 3412.87 g·mol^-1).