3 Eigene Untersuchungen
T- Lymphozyten und ihrer Subpopulationen (CD3, CD4 und CD8)
3.2.2.2.5 Nachweis von MHCII - positiven Zellen am Paraffin- und Kryostat- Kryostat-schnitt
In Abbildung 23 werden die Ergebnisse der quantitativen Auswertung im Tier-gruppenvergleich graphisch dargestellt.
Die Synovialdeckzellschicht ist zu 0-60% in den Paraffinschnitten und zu 35% bis 100% bei den Kryostatschnitten positiv. In der Mehrzahl der Fälle zeigt die Deckzellschicht über ihre gesamte Länge eine gleichbleibende Reaktionsintensität.
Es ist festzustellen, daß die Intensität der Deckzellfärbung mit der Intensität an positiven Zellen in der Subsynovialis positiv korreliert (siehe Abbildung 24 und 25).
1,06
0,55 0,68
0,32 4,42
3,77
2,44
3,02 5,44
4,38
5,6
8,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
MAC387 P Lysozym P MAC387 K Lysozym K
arithmetisches Mittel positiver Zellen
VT KBR cP
Im subsynovialen Gewebe variiert die Anzahl positiver Zellen mit dem Grad der Infiltration durch Entzündungszellen.
Man findet verschiedene Formen an positiven Zellen. Zu unterscheiden sind viele runde Zellen (Lymphozyten und Makrophagen), wenige bipolar langgestreckte Zellen (fibrozytäre Zellen) und Zellen mit dendritischer Morphologie (siehe Abbildung 26 und 27). Die Intensität der Färbung ist bei den einzelnen Zellen unterschiedlich. Zellen mit dendritischer Morphologie liegen in der unmittelbaren Umgebung von Gefäßen, wo sie ringförmig um den Gefäßanschnitt herum angeordnet sind. Ihre Anzahl nimmt zu, wenn direkt subsynovial viele Kapillaranschnitte und viele MHCII-positive Lymphozyten und Makrophagen zu finden sind (Abbildung 28 und 29).
Sowohl in den Paraffin- wie in den Kryostatschnitten ist ein signifikanter Anstieg der Anzahl der subsynovial gelegenen positiven Zellen festzustellen (bei beiden Reaktionen p= 0,00001). Auch bei den Tieren der Gruppe II kann man im Kryostatmaterial eine höhere Anzahl an positiven Zellen feststellen.
Abbildung 23: Anzahl der MHCII-positiven Zellen subsynovial:
Vergleich der verschiedenen Tiergruppen
Abkürzungen:
cP=chronische Polyarthritis-Tiergruppe; K=Kryostatschnitt; KBR=Kreuzbandriß-Tiergruppe; MHCII=Haupthistokompatibilitätskomplex; P=Paraffinschnitt;
2 , 7 9
6 , 5 3 2 6
3 1 , 5
2 1 , 9 1
6 4 , 2
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0
M H C I I P M H C I I K
arithmetisches Mittel positiver subsynovialer Zellen
V T K B R c P
Abbildung 24 (links):
MHCII Immunreaktivität in unveränderter kaniner Synovialis; einzelne Deckzellen positiv, subsynovial MHCII-positive Zellen mit runder und dendritischer Morphologie;
Fall Nr. 3; MHCII-Marker DOG 26; 550fache Vergrößerung;
Abbildung 25 (rechts):
MHCII Immunreaktivität in entzündlich veränderter Synovialis; starke Aufregelung der MHCII Expression; kräftige Anfärbung der Synovialdeckzellen; subsynovial vermehrt positive Zellen unterschiedlicher Morphologie;
Fall Nr. 13; MHCII-Marker DOG 26; 550fache Vergrößerung;
Abbildung 26:
MHCII Immunreaktivität in entzündlich veränderter Synovialis; subsynovial MHCII-positive Zellen mit runder und dendritischer Morphologie in Gefäßnähe;
Fall Nr. 13; MHCII-Marker DOG 26; 550fache Vergrößerung;
Abbildung 27:
MHCII Immunreaktivität in entzündlich veränderter Subsynovialis; zahlreiche Zellen mit dendritischer Morphologie in regelmäßiger Verteilung;
Abbildung 28 (links):
MHCII Immunreaktivität in entzündlich veränderten tiefen Subsynovialschichten;
viele Zellen mit dendritischer Morphologie; einzelne runde lymphozytäre Zellen;
Fall Nr. 12; MHCII-Marker DOG 26; 350fache Vergrößerung;
Abbildung 29 (rechts):
MHCII Immunreaktivität in entzündlich veränderter Subsynovialis; Zelle mit dendritischer Morphologie; deutliche Zellausläufer in alle Richtungen;
Fall Nr. 13; MHCII-Marker DOG26; 550fache Vergrößerung;
3.2.2.2.6 Nachweis von CD1a - positiven Zellen am Kryostatschnitt
Nur bei drei Fällen sind vereinzelt positive Zellen vorhanden. Die dunkelbraun gefärbten Zellen liegen perivaskulär und zeigen keine erkennbaren Fortsätze. Der Zellkern ist klein und überwiegend rundlich.
3.2.2.2.7 Nachweis von CD1c - positiven Zellen am Kryostatschnitt
Im Vergleich zu den Tieren der Gruppe I ist eine signifikante Erhöhung der Anzahl positiver Zellen festzustellen (p=0,0000) (siehe Abbildung 30).
Die Färbung ist zytoplasmatisch lokalisiert. Synovialdeckzellen sind nur hellbraun gefärbt, wenn direkt darunter viele positive Zellen liegen. In diesen Fällen sind bis zu 80% der Deckzellen gefärbt.
CD1c-positive Zellen sind im subsynovialen Gewebe regelmäßig verteilt, wobei ihre Anzahl in tieferen Schichten geringgradig abnimmt. Die positiven Zellen haben einen runden Zellkern und es sind andeutungsweise unterschiedlich lange Fortsätze zu erkennen (siehe Abbildung 31). Vor allem in Gefäßnähe ist festzustellen, daß mehrere Zellen den Gefäßanschnitt umgeben bzw. dicht beieinander liegen.
Abbildung 30: CD1a- und CD1c-positive Zellen:
Vergleich der arithmetischen Mittelwerte der Tiergruppen I und II
Abkürzungen:
CD=Cluster of Differentiation; cP=chronische Polyarthritis-Tiergruppe;
0 , 5
2 , 2 1
0 , 1 1
1 5 , 9 2
0 , 2
1 7 , 8
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0
C D 1 a C D 1 c
arithmetisches Mittel positiver Zellen
V T K B R c P
Abbildung 31:
CD1c Immunreaktivität; positive Zellen mit dendritischer Morphologie in geringgradig entzündlich veränderter, oberflächlicher Synovialisschicht;
Fall Nr. 13; CD1c-Marker; 550fache Vergrößerung;
3.2.2.2.8 Darstellung der Expression verschiedener Adhäsionsmoleküle (CD11a, CD11c, CD18)
Die einzelnen Werte der Tiergruppen werden in Abbildung 32 graphisch dargestellt.
Lokalisierung der Färbung und Intensität der Reaktion zur Darstellung von CD11a entsprechen derjenigen bei den Vergleichstieren.
Ca. 80 bis 90% der Synovialdeckzellen sind positiv gefärbt. Je mehr positive Zellen in der Deckzellschicht vorhanden sind, desto mehr Zellen sind auch im subsynovialen Stroma positiv. Allerdings sind im subsynovialen Gewebe, das sich direkt unterhalb der Deckzellschicht befindet, wesentlich mehr positive Zellen zu finden als in tieferen Schichten. In tieferen Schichten der Subsynovialis sind nur vereinzelt positive Zellen um Gefäßanschnitte zu erkennen. Im Vergleich zu Gruppe I ist eine signifikant erhöhte Expression dieses Adhäsionsmoleküls zu beobachten (p=0,00013). Wie bei den Vergleichstieren kann man unterschiedliche Zellformen unterscheiden. In der Mehrzahl der untersuchten Schnitte ist die Färbung so schwach oder die Zelldichte so hoch, daß eine eindeutige Abgrenzung der Einzelzellen kaum möglich ist. Es sind aber auch runde bis rund-ovale Zellen vorhanden, die disseminiert liegen und einen runden, zentralen Kern haben.
Daneben gibt es längliche Zellen mit spindelförmigem Kern und bipolarer Ausdehnung, die Fibrozyten ähneln. Im subsynovialen Gewebe sind nur sehr wenige dieser spindelförmigen Zellen positiv. In Gefäßnähe gibt es jedoch stets mehr positive Zellen mit dendritischer Morphologie als inmitten von Binde- oder Fettgewebe. Zwischen Fettzellen ist die Anzahl an positiven Zellen unabhängig von der Form am niedrigsten.
Bei der Reaktion zum Nachweis von CD11c sind 70 bis 100% der Synovial-deckzellen positiv. In lokalen Anhäufungen von lymphoiden Zellen sind einzelne Zellen mit weiter Kern-Plasma-Relation und großem Zelleib zu finden, deren Zellausläufer zwischen den Lymphozyten liegen. Sie gehören zu den Zellen mit dendritischer Morphologie. Vereinzelt sind runde Zellen unmittelbar unterhalb der Synovialdeckzellschicht befindlichen Zone zu beobachten, wobei sie vorzugsweise in Gefäßnähe liegen. Fibrozytär aussehende Zellen sind nicht positiv markiert. In tieferen Schichten sind keine immunreaktiven Zellen nachweisbar. Im Vergleich zu den Tieren der Gruppe I sind signifikant mehr positive Zellen zu finden (p=0,00013).
Die Färbung bei der Reaktion zur Darstellung von CD18 ist von deutlich stärkerer Intensität. In manchen Fällen, vor allem bei hochgradiger Infiltration mit lymphoiden Zellen oder bei hochgradiger Synovialdeckzellhyperplasie, sind bis zu 90% der
Expression von Cd18 festzustellen (p=0,00001) (siehe Abbildung 33 und 34).
Darunter und bis in tiefere subsynoviale Schichten reichend sind Zellen unterschiedlicher Morphologie CD18-positiv. Es überwiegen runde Zellen mit zentralem runden Kern und relativ geringer Kern-Plasma-Relation. Zudem liegen im Bindegewebe spindelförmige Zellen mit länglichem Kern. Desweiteren sind positive Zellen mit länglichen Fortsätzen zu sehen, die vor allem in Gefäßnähe liegen (siehe 3.2.2.2.5).
Abbildung 32: Adhäsionsmoleküle CD11a, CD11c, CD18:
Vergleich der arithmetischen Mittelwerte der Tiergruppen
Abkürzungen:
CD=Cluster of Differentiation; cP=chronische Polyarthritis-Tiergruppe;
KBR=Kreuzbandriß-Tiergruppe; VT=Vergleichstiergruppe;
4,93
1,66
7,32 17,28
20,24
29,03 27
50,2
18,8
0 10 20 30 40 50 60
CD11a CD11c CD18
arithmetisches Mittel positiver Zellen
VT KBR cP
Abbildung 33 (links):
CD18 Marker: unveränderte kanine Synovialis; CD18-positive Deckzellen;
subsynovial CD18-positive Zellen perivaskulär; schwache Färbungsintensität;
Fall Nr. 3; CD18-Marker; 350fache Vergrößerung;
Abbildung 34 (rechts):
CD18 Marker: hochgradige Aufregulierung der CD18 Expression in entzündlich veränderter Synovialis; stärkere Färbungsintensität als bei unverändertem Gewebe;
hochgradige Infiltration mit Entzündungszellen subsynovial;
3.2.3 Histologische und immunhistologische Untersuchungen