Molekularbiologische Methoden

3.2.1. Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Molekülgröße erfolgte mit Hilfe der Horizontal-Agarose-Gelelektrophorese. Je nach Trennungsbereich wurden Gele mit Konzentrationen von 0,8 bis 1,5 % (w/v) in TBE-Puffer verwendet. Die DNA-Proben wurden mit 1/10 Vol. DNA-Probenpuffer versetzt und nach Applikation in die Geltaschen bei einer konstanten Spannung von 100 V und mit TBE als Laufpuffer aufgetrennt. Für die Analyse der DNA-Fragmente wurden am Anfang Agarose-Gele mit einer Ethidiumbromid-Konzentration von 1,0 μg ml^-1 verwendet. Später wurde als Detektionsmittel das Serva DNA Stain G verwendet (2 µl Färbemittel zu 100 ml Agarose-Gel). Die Nukleinsäure-Moleküle wurden unter UV-Licht mit Hilfe einer UV-Handlampe oder eines Transilluminators sichtbar gemacht. Die Dokumentation der aufgetrennten und detektierten Fragmente wurde mit einem E.A.S.Y.-plus Imaging System (Herolab) vorgenommen. Als DNA-Größenmarker dienten Lambda-DNA, welche zuvor mit dem Restriktionsenzym PstI vollständig verdaut wurde.

3.2.2. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen erfolgte mit dem Jetsorb-Kit von Genomed.

3. Methoden

43 3.2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Die PCR Amplifizierungen von Genen oder nichtkodierenden Bereichen des Actinomycin-Biosynthese Genclusters wurden mit 1 μM Primer (je Primer), 300 μM dNTPs (je Nucleotid), 1...50 ng Template und 2,5 units Polymerase in 50 μl Reaktionspuffer durchgeführt. Die jeweiligen Reaktionsbedingungen sind in den Abschnitten 3.2.7 bis 3.2.12 angegeben.

3.2.4. Isolierung chromosomaler DNA aus Streptomyceten

Präparation von chromosomaler DNA aus Streptomyceten erfolgte zum einen nach einer modifizierten Methode nach Altenbuchner und Cullum (1984) oder mit Hile des Wizard Genomic Purification Kit von Promega nach Angaben des Herstellers. Nach der Kultivierung des jeweiligen Strepomyceten-Stammes (siehe Abschnitt 3.1.1) wurde Myzel (Feuchtgewicht von ca. 250 mg) in 800 µl TES-Puffer mit Lysozym (10 mg ml^-1) resuspendiert und über einen Zeitraum von 30 bis 60 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zusatz von 10 % SDS (5 % f.c.) und vorsichtigem Vermischen erfolgte die weitere Inkubation bei 60 °C für 10 min. Das erhaltene Lysat wurde nach Abkühlen zweimal durch Zugabe von 2/5 Vol. Phenol/Chloroform vorsichtig invertiert und bei 14.000 rpm (Tischzentrifuge Eppendorf 5436) für 15 Min zentrifugiert bis eine Phasentrennung erreicht war. Die Oberphase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 1/10 Vol. Natriumacetat (3 M, pH 8.0) und 1 Vol. kaltem Isopropanol gefällt. Nach der Zentrifugation bei 14.000 rpm (Tischzentrifuge Eppendorf 5436) für 30 min bei 4 °C wurde das Pellet mit 70 % Ethanol (-20 °C) gewaschen, anschließend bei 37 °C getrocknet und in 100 µl TE-Puffer gelöst.

3.2.5. Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

Für die Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli wurden 3 ml LB-Medium (mit Selektionsmarker) beimpft und für 16 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation geerntet (2 min, 10.000 rpm). Die Lyse der E. coli-Zellen sowie die Präparation der Plasmid-DNA wurden nach einem Protokoll von Sambrook (1989) durchgeführt, welches ein modifiziertes Protokoll von Birnboim & Doly (1979) und Ish-Horowicz & Burke (1981) ist. Die präparierte Plasmid-DNA wurde dann in TE-Puffer oder H2O aufgenommen. Für die Lagerung wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert, das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, anschließend getrocknet und bei -20 °C eingefroren.

3.2.6. Plasmidkonstruktionen

In den folgenden Abschnitten werden die Konstruktionen der verwendeten Expressionsplasmide beschrieben. Am Anfang wurde für die Klonierung von PCR-Fragmenten das TOPO-TA-Cloning Kit verwendet. Später erfolgten solche Klonierungen in den pJET1.2 Vektor mit dem CloneJET™ PCR Cloning Kit. Beide Verfahren wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

3.2.7. Klonierung von pICacmI_pQ30

Das Gen acmI wurde von chromosomaler DNA von S. chrysomallus Sc1 mit Primern F_acmI und R_acmI amplifiziert. Für die PCR wurden folgende Bedingungen gewählt: 1 min 95 °C, 1 min 60 °C,

3. Methoden

44

1 min 72 °C mit 30 Zyklen. Das Fragment wurde nach der Isolation vom Gel in den pCR4-TOPO-Vektor kloniert (Plasmid pICacmI_TOPO). Nach Sequenzierung von 10 unabhängig voneinander gepickten rekombinanten Klonen stellte sich bei allen heraus, dass diese an unterschiedlichen Stellen der Sequenz Fehler aufwiesen. Aus einer Klon-DNA, welche einen Lesefehler in der 3’-Hälfte des Gens aufwies, wurde das fehlerfreie Gen-Fragment mit den durch die Wahl der Primer definierten Restriktionsstellen KpnI und einer natürlichen Schnittstelle SphI ausgeschnitten. Das Fragment wurde in den mit den gleichen Restriktionsschnittstellen geschnittenen Übergangsvektor pTZ18 kloniert und in E. coli DH5 transformiert. Das resultierende Plasmid pICacmI_pTZ18(Halb) wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt.

Um das zweite fehlerfreie Gen-Fragement zu erhalten, wurde aus einer zweiten Klon-DNA, welche einen Lesefehler in der 5’-Hälfte des Gens aufwies, das Gen-Fragment mit den Restriktionsenzymen SphI und HindIII ausgeschnitten und in den mit den gleichen Restriktionsschnittstellen geschnittenen Vektor pICacmI_pTZ18(Halb) kloniert und in E. coli DH5 transformiert. Das resultierende Plasmid pICacmI_pTZ18 wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt. Anschließend wurde das acmI-Gen als Fragment aus dem Plasmid pICacmI_pTZ18 ausgeschnitten und in KpnI/HindIII-geschnittenen pQE30-Vektor kloniert und in E. coli DH5 transformiert (Abb. 15). Das erhaltene Plasmid pICacmI_pQE30 wurde dann für die Expression des acmI-Gens in E. coli M15 transformiert.

Nach Transformation konnte ein pICacmI_pQE30 Plasmid erhalten werden, das sich nach der Sequenzierung als fehlerlos erwies.

Abbildung 15: Klonierungsstrategie für den Vektor pICacmI_pQE30. Das Gen acmI ist in gelb dargestellt. Abkürzungen:

amp^R = Ampicillin Resistenz, kan^R = Kanamycin Resistenz, colE1 = Origin of Replication.

Aus der Konstruktion des Gens resultierte folgende Aminosäuresequenz für das rekombinante Protein:

AcmI: MADVRPFGTEDLVRILF...HGVISAVK pICacmI_pQE30: MRGSHHHHHHGSACELGTMADVRPFGTEDLVRILF...HGVISAVK Hexa-His-Tag

3. Methoden

45 3.2.8. Klonierung von pICacmL_pQ30

Das Gen acmL wurde von chromosomaler DNA von S. chrysomallus Sc1 mit Primern F_acmL und R_acmL amplifiziert. Für die PCR wurden folgende Bedingungen gewählt: 1 min 95 °C, 1 min 60 °C, 1 min 72 °C mit 30 Zyklen. Das Fragment wurde nach Isolation vom Gel in den pCR4-TOPO-Vektor kloniert und in E. coli DH5 transformiert. Nach Transformation konnte ein Plasmid pICacmL_TOPO erhalten werden, das sich nach der Sequenzierung als fehlerlos erwies. Anschließend wurde das acmL-Gen als KpnI/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pICacmL_TOPO ausgeschnitten und in KpnI/HindIII-geschnittenen pQE30-Vektor ligiert und in E. coli DH5 transformiert. Das erhaltene Plasmid pICacmL_pQE30 wurde dann für die Expression des acmL-Gens in E. coli M15 transformiert.

Nach Transformation konnte ein pICacmL_pQE30 Plasmid erhalten werden, das sich nach der Sequenzierung als fehlerlos erwies.

Aus der Konstruktion des Gens resultierte folgende Aminosäuresequenz für das rekombinante Protein:

AcmL: MPHASPLTTDGLVQILF...HGVISAVK pICacmL_pQE30: MRGSHHHHHHGSACELGTMPHASPLTTDGLVQILF...HGVISAVK Hexa-His-Tag

3.2.9. Klonierung von pICacmI_pQ50 und pICacmL_pQ50

Für die Expression der acmL und acmI Gene ohne die aminoterminalen His6-Sequenzen wurden die beiden Gene als KpnI/HindIII-Fragmente aus den Plasmiden pICacmI_pQE30 und pICacmL_pQE30 ausgeschnitten und in den KpnI/HindIII-geschnittenen Vektor pQE50 kloniert und in E. coli M15 transformiert Nach Transformation konnten die beiden Plasmide pICacmI_pQE50 und pICacmL_pQE50 erhalten werden.

Aus den Konstruktionen der Gene resultierten folgende Aminosäuresequenzen für die rekombinanten Proteine:

AcmI: MADVRPFGTEDLVRILF...HGVISAVK pICacmI_pQE30: MRGSSACELGTMADVRPFGTEDLVRILF...HGVISAVK

AcmL: MPHASPLTTDGLVQILF...HGVISAVK pICacmL_pQE30: MRGSSACELGTMPHASPLTTDGLVQILF...HGVISAVK

3.2.10. Klonierung der Hygromycin-Resistenz-Kassette

Pfennig und Schauwecker hatten eine Hygromycin-Resistenz-Kassette in das E. coli Plasmid pIJ2925 (Janssen und Bibb, 1993) kloniert und nach Transformation von S. chrysomallus mit dem die Hygromycin-Resistenz-Kassette tragenden linearisierten Plasmid die Mutante Sc-white erhalten, bei der der mittlere Teil des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters durch double crossover elimiert war.

Die genaue Lage der Hygromycin-Resistenz-Kassette (Blondelet-Rouault et al., 1997) zwischen den

3. Methoden

46

Genen acmH und acmK im Actinomycin-Biosynthese-Gencluster musste durch PCR bestimmt werden. Hierzu wurden die Übergangsbereiche in Stamm Sc-white zwischen der Hygromycin-Resistenz-Kassette und acmK auf der einen und acmH auf der anderen Seite durch Wahl von Primern aus der Hygromycin-Resistenz Kassette bzw. von acmH oder acmK PCR-kloniert. Die Amplifizierung des hyg-acmH-Übergangs wurde mit den Primern Rew-Hyg/acmH-rev und des hyg-acmK-Übergangs mit den Primern RHyg/F_acmK2 durchgeführt.

Für die PCR wurden folgende Bedingungen gewählt:

acmH-Seite: 1 min 95 °C, 1 min 60 °C, 1 min 72 °C mit 30 Zyklen.

acmK-Seite: 1 min 95 °C, 1 min 58 °C, 1 min 72 °C mit 30 Zyklen.

Die Plasmide pJet1.2_Hyg_H und pCR4_Hyg_K wurden sequenziert und es resultierten folgende Sequenzen an welcher Stelle die Hygromycin Resistenzkassette eingebaut war:

acmH nt 407:

hyg-Gen PstI acmH Gen

pJet_1.2_Hyg_H : AAACGGTTTACAAGCATAAAGCTTGCATGCCTGCAGGGCCTGGCCGAGCAGCGCGGGC AcmH : ---CTGCAGGGCCTGGCCGAGCAGCGCGGGC

acmK nt 379

acmK-Gen PstI hyg-Gen

AcmK : ACCAGCCCCATACCGGCTGCCGCAGCCGGGACTGCAG--- pCR4_Hyg_K : ACCAGCCCCATACCGGCTGCCGCAGCCGGGACTGCAGCCAAGCTTTATGCTTGTAAACCGTT

3.2.11. Klonierung der acmN und acmM Sequenzen

Während der hier durchgeführten Sequenzanalyse des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters wurde festgestellt, dass die aus dem Cosmiden cosA1, cosP2 und 5a1 offensichtliche Sequenz von acmN für ein Ferredoxin-Gen viel zu lang war. Zudem wies die Präsenz eines Stoppcodons in der Mitte von acmM entweder auf einen Lesefehler oder auf die Nichtfunktionalität dieses Gens hin. Aus diesem Grund wurde der Bereich von acmN und acmM von chromosomaler DNA des S. chrysomallus Stamm Sc1 durch PCR amplifiziert und in den Vektor pJET1.2 kloniert. Die Amplifizierung erfolgte mit den Primern Cyp_Rew/Ferro_1. Für die PCR wurden folgende Bedingungen gewählt: 1 min 95 °C, 1 min 50 °C, 1 min 72 °C mit 30 Zyklen. Das einklonierte Fragment wurde durch Restriktionsverdau getestet und drei Klone, welche das Fragment enthielten, wurden sequenziert.

3.2.12. Klonierung von kynU aus S. chrysomallus

Für die PCR-Klonierung des Gens kynU der katabolischen Kynureninase aus S. chrysomallus wurde folgende Vorgehensweise verfolgt. Für die Gewinnung der 5’- und 3´-Sequenzen von kynU wurden Alignments sechs verschiedener Streptomyces kynU Sequenzen (S. avermitilis, S. coelicolor, S. griseus subsp. griseus, S. scabiei, S. clavuligerus, S. sviceus) und Alignments der sie flankierenden kynA (Tryptophandioxygenase) und kynB (Kynureninformamidase) Sequenzen aufgestellt. Aus den höchst

3. Methoden

47 konservierten Sequenzen des 5’- und des 3’-Bereichs der kynU Gens und aus den höchstkonservierten Sequenzen im 3´-Bereich von kynA und im 5´-Bereichs von kynB wurden Primer abgeleitet, mit deren Hilfe das gesamt kynU-Gen zwischen seinem 5´- und 3’-Ende mit der DNA aus dem Stamm S. chrysomallus Sc-white durch PCR amplifiziert und in den pJET1.2 Vektor kloniert wurde (Abb. 16). Die Amplifizierung erfolgte mit den Primern kynA_F/kynB_R. Für die PCR wurden folgende Bedingungen gewählt: 1 min 95 °C, 1 min 60 °C, 1 min 72 °C mit 30 Zyklen. Das einklonierte Fragment wurde durch Restriktionsverdau getestet und drei Klone, welche das Fragment enthielten, wurden sequenziert.

Abbildung 16: Schema der Klonierung der kynU-Sequenz. Unter der Annahme, dass die Reihenfolge des Tryptophan-Operons in S. chrysomallus gleich ist wie z. B. beim S. griseus, wurden Primer von vergleichen homologer Sequenzen erstellt. Anschließend erfolgte die Amplifizierung von kynU durch PCR.

3.2.13. Ligation

Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde in einem Gesamtvolumen von 20 μl über Nacht bei 16 °C durchgeführt. Die Ligation erfolgte mit 1 Unit T4-DNA-Ligase unter Verwendung des Ligasepuffers des Herstellers.