Genetische und enzymatische Charakterisierung
der Biosynthese des Actinomycins in
Streptomyces
vorgelegt von
Diplom Chemikerin
Ivana Crnovčić
aus Zenica
von der Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
-Dr. rer. nat.-
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schomäcker
Berichter/ Gutachter: PD Dr. rer. nat. Ullrich Keller
Berichter/ Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Roderich Süssmuth
Berichter/ Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Hildgund Schrempf
Tag der wissenschaftlicen Aussprache: 19. April 2013
Berlin 2013
D 83
Zusammenfassung
3
Zusammenfassung
Die Actinomycine, eine Gruppe cytostatisch wirksamer Chromopeptide, werden von verschiedenen Streptomyces Stämmen gebildet. Ihre Struktur ist geprägt durch eine Dimethyl-Phenoxazinon-Dicarbonsäure, welche in Amidbindungen mit zwei Pentapeptidlactonringen verknüpft ist. Die Bildung des Phenoxazinon-Chromophors findet im letzten Schritt der Actinomycin-Biosynthese statt, wenn zwei 3-Hydroxy-4-methylanthraniloyl-(4-MHA)-Pentapeptidlacton-Zwischenstufen oxidativ miteinander kondensiert werden. Enzymatische und genetische Arbeiten in Streptomyces chrysomallus haben die Schritte des Aufbaus der 4-MHA Pentapeptidlactone an den multifunktionellen Actinomycin Synthetasen aus den Pentapeptidlactonring-Aminosäuren und 4-MHA geklärt. Dagegen waren die Schritte der Biosynthese der 4-4-MHA nur teilweise auf enzymatischer Ebene charakterisiert und die verantwortlichen Gene unbekannt. Die Sequenzanalyse des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters von S. chrysomallus führte zur Auffindung von 4-MHA Biosynthese Genen wie für Tryptophandioxygenase (acmG), Kynureninformamidase (acmF) und Hydroxykynureninase (acmH). Die betreffenden Enzymaktivitäten konnten durch vergleichende enzymatische Analysen von Zellextrakten des Actinomycin-produzierenden Wildtyp-Stamms und einer Actinomycin-negativen Mutante, in der diese Gene deletiert waren, identifiziert und von den entsprechenden katabolischen Enzymen des Primärstoffwechsels funktionell unterschieden werden. Weitere als Methyltransferase Gene annotierte Gene (acmI und acmL) wurden heterolog in E. coli exprimiert. Testung von AcmI und AcmL ergab, dass sie 3-Hydroxykynurenin (3-HK) zu 3-Hydroxy-4-methylkynurenin (4-MHK) aber nicht die 3-Hydroxyanthranilsäure (3-HA) zu 4-MHA - wie Daten früherer Arbeiten eigentlich voraussagten - methylieren. Demgemäß resultierte Zugabe von überschüssiger 3-HA zu S. chrysomallus und Streptomyces parvulus als auch zu Streptomyces antibioticus keine Stimulierung der Actinomycinsynthese. Stattdessen wurde die im Überschuss vorliegende 3-HA aufgrund ihrer strukturellen Homologie anstelle der intrazellulären 4-MHA in den Phenoxazinon-Chromophor neuer Actinomycine, der C-Demethylactinomycine, eingebaut. Darüber hinaus induzierte die 3-HA in S. antibioticus zusätzlich die Bildung von neuen C-Demethyl-hemi-Actinomycinen, die nur einen statt zwei Pentapeptidlactonringen am Phenoxazinonchromophor tragen. Entsprechend resultierte die Fütterung von S. antibioticus mit überschüssiger 4-MHA in der Bildung von Hemiactinomycinen. Letztere und die Demethyl-hemi-Actinomycine entstehen durch oxidative Kondensation im Überschuss präsenter 3-HA oder 4-MHA mit vorgebildeten Actinomycinhälften. Diese Reaktionen werden offensichtlich von der Phenoxazinon Synthase (PHS) in S. antibioticus katalysiert, die in S. chrysomallus oder S. parvulus nicht vorkommt. Weitere enzymatische und kinetische Charakterisierungen von AcmI und AcmL zeigten, dass sie neben ihrem eigentlichen Substrat, 3-Hydroxy-D-Kynurenin, auch andere phenolische Aminosäuren mit neuartiger antipodaler Stereospezifität am aromatischen Kern methylieren. Diese wird bestimmt von der optischen Konfiguration am -C und gleichzeitig der unterschiedlichen Länge der aliphatischen Aminosäureseitenkette. Wildtyp AcmI/AcmL wurden auch in Zellextrakten von S. chrysomallus nachgewiesen, in welchen sie zusammen mit Hydroxykynureninase die Konversion von 3-HK (über 4-MHK) in 4-MHA katalysierten. Die in geringem Ausmaß stattfindende vorzeitige Spaltung von 3-HK in 3-HA durch Hydroxykynureninase ist Grund für das Vorkommen von Spuren von C-Demethylactinomycinen in natürlichen Actinomycingemischen.
Inhaltsverzeichnis 5
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ... 3 Inhaltsverzeichnis ... 5 Abkürzungsverzeichnis ... 9 1. Einleitung ... 111.1. Biologie der Streptomyceten ... 11
1.2. Entdeckung, Struktur und Funktion des Actinomycin ... 15
1.3. Wirkungsmechanismus des Actinomycin ... 18
1.4. Die Biosynthese des Actinomycin ... 20
1.5. Phenoxazine als Bestandteile von Naturstoffen ... 21
1.6. Enzymatische Untersuchung der Actinomycin Synthese ... 24
1.7. Biochemische Untersuchungen zum Aufbau der Peptidketten des Actinomycins ... 25
1.8. Klonierung des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters ... 29
1.9. Zielsetzung ... 30 2. Materialien ... 31 2.1. Chemikalien ... 31 2.2. Radiochemikalien ... 31 2.3. Reagentien... 32 2.4. Enzyme ... 33 2.5. Kits ... 33 2.6. Mikroorganismen ... 33
2.7. Vektoren und Plasmide ... 33
2.8. PCR-Primer ... 34 2.9. Puffer ... 34 2.9.1. Proteinpräparationspuffer ... 34 2.9.2. Ni-NTA Affinitätschromatographiepuffer ... 35 2.10. Lösungen ... 35 2.11. Medien ... 36 2.12. Chromatographiematerialien ... 37 2.13. Laufmittel ... 38 2.14. Weitere Materialien ... 38 2.15. Geräte ... 38
Inhaltsverzeichnis
6
2.16. Software ... 39
3. Methoden ... 41
3.1. Kultivierung von Mikroorganismen ... 41
3.1.1. Kultivierung von Streptomyces sp. ... 41
3.1.2. Kultivierung von E. coli ... 41
3.2. Molekularbiologische Methoden ... 42
3.2.1. Agarose-Gelelektrophorese ... 42
3.2.2. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ... 42
3.2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 43
3.2.4. Isolierung chromosomaler DNA aus Streptomyceten ... 43
3.2.5. Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli ... 43
3.2.6. Plasmidkonstruktionen ... 43
3.2.7. Klonierung von pICacmI_pQ30 ... 43
3.2.8. Klonierung von pICacmL_pQ30 ... 45
3.2.9. Klonierung von pICacmI_pQ50 und pICacmL_pQ50 ... 45
3.2.10. Klonierung der Hygromycin-Resistenz-Kassette ... 45
3.2.11. Klonierung der acmN und acmM Sequenzen ... 46
3.2.12. Klonierung von kynU aus S. chrysomallus ... 46
3.2.13. Ligation ... 47
3.3. Biochemische Methoden... 47
3.3.1. SDS-PAGE nach Laemmli ... 47
3.3.2. Proteinbestimmung nach Bradford ... 48
3.3.3. Western-Blot und Immunodetektion ... 48
3.3.4. Proteinpräparationen ... 48
3.3.5. Herstellung von Zellextrakten ... 48
3.3.6. Durchgeführte Reinigungsgänge ... 49
3.4. Chromatographische Methoden ... 49
3.4.1. Ni-NTA-Affinitätschromatographie ... 49
3.4.2. Gelfiltrationschromatographie ... 50
3.4.3. AcmI und AcmL aus E. coli (pICacmI_pQE30 und pICacmL_pQE30) ... 50
3.4.4. AcmL aus E. coli (Expressionsplasmid pICacmL_pQE50) ... 51
3.4.5. Kynureninase/ Hydroxykynureninase (Wildtyp/S. chrysomallus) ... 52
3.4.6. Untersuchungen in partiell entsalzten Zellextrakten ... 53
Inhaltsverzeichnis
7
3.5.1. Testung von Kynureninformamidase- und Kynureninase-Aktivität ... 53
3.5.2. Testung der Methyltransferasen AcmI und AcmL ... 53
3.5.3. Darstellung von Actinomycinen und Actinomycinderivaten ... 55
3.6. Analytische Methoden ... 56
3.6.1. HPLC Trennungen ... 56
3.6.2. LC-ESI-MS Messungen ... 56
3.6.3. Matrix-assisted laser Desorption Ionisation (MALDI-) TOF-MS ... 56
3.7. Synthese ... 57
3.7.1. Darstellung von 3-Hydroxy-4-Methylanthranilsäure (4-MHA) ... 57
3.7.2. Darstellung von 3-Hydroxy-L- und 3-Hydroxy-D-Kynurenin ... 57
4. Ergebnisse und Diskussion ... 59
4.1. Organisation des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters von S. chrysomallus ... 59
4.2. Gene der Actinomycin Synthetasen und ihrer Nachbarn... 62
4.3. Gene der 4-MHA Biosynthese im Actinomycin-Biosynthese-Gencluster... 63
4.4. Regulatorische Gene des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters ... 66
4.5. Resistenzgene des Actinomycin-Biosynthese-Gencluster ... 67
4.6. Biochemische Untersuchungen der Gene des 4-MHA Biosynthese Operons ... 69
4.6.1. Rolle der Kynureninase-Gene acmH und acmK... 69
4.6.2. Enzymatische Bestimmung von Kynureninase Aktivitäten ... 73
4.6.3. Enzymatische Analyse von Kynureninformamidase-Aktivitäten ... 80
4.6.4. Rolle von Tryptophan-2,3-dioxygenase in der Actinomycin-Synthese ... 82
4.6.5. Analyse der Methyltransferase-Gene acmI und acmL ... 84
4.6.6. Heterologe Expression von AcmI und AcmL in E. coli ... 85
4.6.7. Enzymatische Konversion von 3-HK zu 4-MHK ... 86
4.6.8. Reinigung und Charakterisierung von AcmI und AcmL ... 88
4.6.9. Sequenzanalyse ... 89
4.6.10. Substratspezifitäten von AcmI und AcmL... 91
4.6.11. Stereospezifität von AcmI und AcmL... 95
4.6.12. Kinetische Charakterisierung von AcmI und AcmL ... 96
4.6.13. Phylogenetische Analyse von AcmI und AcmL ... 98
4.6.14. Natürliche Präsenz von AcmI und AcmL in S. chrysomallus ... 100
4.7. Demethylactinomycine in S. chrysomallus und S. parvulus ... 101
4.7.1. Identifizierung neuer Substanzen in Streptomyces chrysomallus ... 101
Inhaltsverzeichnis
8
4.7.3. Identifizierung der C-Demethylactinomycine D durch MALDI-TOF-MS ... 106
4.7.4. 3-HA ist ein schwacher biosynthetischer Konkurrent von 4-MHA ... 109
4.7.5. Produktion von C-Demethylactinomycinen unter natürlichen Bedingungen ... 111
4.7.6. Biosynthetischer Ursprung der 3-HA ... 111
4.7.7. Bestimmung intrazellulärer 4-MHA und 3-HA durch Radiomarkierung ... 112
4.7.8. Regiospezifität der Demethylphenoxazinon (Demethylactinocin) Bildung ... 113
4.8. Biosynthese von Hemiactionomycinen in Streptomyces antibioticus ... 115
4.8.1. Produktion von Demethylactinomycinen in S. antibioticus ... 115
4.8.2. Analyse der Hemiactinomycine ... 119
4.8.3. Strukturaufklärung von Hemiactinomycinen durch MALDI-TOF-MS ... 122
4.8.4. Regioselektiver Einbau von 3-HA in Demethylhemiactinomycine ... 125
4.8.5. Analyse von intrazellulärer 3-HA oder 4-MHA in S. antibioticus. ... 126
4.8.6. Klonierung des AcmI/L Gens aus S. antibioticus ... 127
5. Resumé ... 129
6. Literaturverzeichnis ... 141
Abkürzungsverzeichnis 9
Abkürzungsverzeichnis
ACMS Actinomycin-Synthetase ACP Acyl-Carrier-Protein AdoMet S-Adenosyl-L-Methionin AS AminosäureATCC American Type Culture Collection
BCIP 5-Brom-4-chlorindolyl-phosphat BSA Rinderserumalbumin Ci Curie (1 Ci = 3.7⋅1010 Bq) DC Dünnschichtchromatographie dest. destilliert DTE 1,4-Dithioerythrit EtOAc Essigsäureethylester EDTA Ethylendiamintetraessigsäure f.c. finale Konzentration 3-HA 3-Hydroxyanthranilsäure 3-HK 3-Hydroxykynurenin IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid kDa Kilodalton Konz. Konzentration Lsg. Lösung 4-MHA 3-Hydroxy-4-methylanthanilsäure 4-MHK 3-Hydroxy-4-methylkynurenin min Minute NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
Ni-NTA Nickel-nitrilo-tri-acetic acid
NRPS Nichtribosomale Peptidsynthetase
ORF open reading frames (offene Leserahmen)
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid (Benzylsulfonylfluorid)
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat TCA Trichloressigsäure TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin TFA Trifluoressigsäure Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Vol. Volumen Ve Elutionsvolumen
Abkürzungsverzeichnis
10
Aminosäuren:
Aminosäuren Einbuchstabencode Dreibuchstabencode
Alanin A Ala Arginin R Arg Asparagin N Asn Asparaginsäure D Asp Cystein C Cys Glutamin Q Gln Glutaminsäure E Glu Glycin G Gly Histidin H His Isoleucin I Ile Leucin L Leu Lysin K Lys Methionin M Met Phenylalanin F Phe Prolin P Pro Serin S Ser Threonin T Thr Tryptophan W Trp Tyrosin Y Tyr Valin V Val Nucleotide: Adenin A Cytosin C Guanin G Thymin T Uracil U
1. Einleitung
11
1. Einleitung
1.1. Biologie der Streptomyceten
Streptomyceten sind filamentöse gram-positive Bakterien, die zur Familie der Actinobakterien gehören (Waksman und Henrici, 1943). Bisher wurden ungefähr 500 Arten beschrieben. Actinobakterien besitzen einen hohen G + C-Gehalt in ihrer DNA, der bei den Streptomyceten zwischen 71 - 74 Mol % schwankt (Stackebrand und Woese, 1981; Wright und Bibb, 1992). Sie kommen bevorzugt im Boden vor und zeichnen sich durch einen komplexen Lebenszyklus aus. Dieser ist charakterisiert durch die Bildung eines Substratmyzeliums während der vegetativen Wachstumsphase. Durch beginnende Limitierung des Nährstoffangebots beginnt eine Phase der Luftmyzelbildung, in der sich neue Hyphenstrukturen mit partiell hydrophobem Charakter räumlich vom Substratmyzelium weg entwickeln. Hierbei und durch diese Transition selbst werden neue charakteristische metabolische Vorgänge induziert, die durch den Beginn der Sekundärstoffbildung und die morphologischen Differenzierung gekennzeichnet sind. Das Luftmyzelium, welches während seiner frühen Entwicklung den Kolonien eine weiße Farbe verleiht, erfährt weitere Veränderungen in der Morphologie wie z. B. Spiralisierung, Septation und Pigmentierung und mündet in die Bildung von Sporenketten. Diese können durch mechanischen Stress zerbrechen und Einzelsporen freisetzen, welche nach ihrer Freisetzung einen neuen Lebenszyklus eintreten können (Chater und Merrick, 1979) (Abb. 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der morphologischen Differenzierung von Streptomyceten. Anhand des
Entwicklungszyklus nach Chater und Merrick, 1979.
Die verschiedenen Streptomyceten-Arten besitzen eine Vielzahl von Sekundärstoffwechselwegen, die es ihnen ermöglicht zahlreiche Antibiotika und andere niedermolekulare Verbindungen mit
1. Einleitung
12
bioaktivem Potential zu bilden. Z. Zt. sind über 7500 solcher Verbindungen bekannt, davon sind ca. 70 % der Verbindungen antibiotisch (Bérdy, 2005, 2012). Keine andere Organismengruppe produziert ähnlich viele Sekundärstoffe wie die Streptomyceten (Bérdy, 2005, 2012). Die Tatsache, dass ca. 90 % aller kommerziell genutzter Antibiotika mit Anwendungen in der Medizin, Tiergesundheit Pflanzenschutz oder in der Biotechnologie von Streptomyceten produziert wird, unterstreicht die hohe Bedeutung dieser Organismengruppe. Neben ihrem Vermögen Antibiotika zu bilden, besitzen Streptomyceten auch Bedeutung als Mitglieder der Bodenflora. Sie sind Produzenten von Signalmolekülen, Odorantien und auch bedeutender extrazellulärer Enzyme, wie Cellulasen, Amylasen, Chitinasen usw., die für den Abbau abgestorbener Biomasse im Boden eine große Rolle spielen (Gilbert et al., 1995). Durch all diese Metaboliten und Enzymaktivitäten spielen Streptomyceten eine eminente Rolle in der Ökologie die sich in ihrer Interaktion mit Pilzen, Nematoden und Insekten wiederspiegelt (Schoenian et al., 2011).
Die Streptomyceten wurden im späten 19. Jahrhundert in verschiedenen Habitaten entdeckt. Zunächst im Zuge der auf die Entdeckung von Krankheitserregern fokussierten Bakteriologie wurden erste Streptomyceten (Actinomyceten) als Bewohner in der Mundhöhle des Menschen und im Verdauungstrakt von Tieren gefunden (Naeslund, 1925). Aufgrund ihres dem Myzelium von Pilzen ähnlichen Erscheinungsbildes wurden sie als Strahlenpilze (Actinomyces, später Streptomyces) bezeichnet (Cohn, 1875; Harz, 1877). Es wurde jedoch später klar, dass sie als Krankheitserreger beim Menschen eine kleinere Rolle spielen und ihr Haupthabitat der Boden und ihr Substrat saprophytischer Natur ist (Challis und Hopwood, 2003). Bis zum Ende der 50er Jahre des vorigen Jahrhunderts war es nicht geklärt, ob es sich bei den Streptomyceten um Pro- oder Eukaryoten handelte. Das allgemeine Interesse an den Streptomyceten, die bis in die vierziger Jahre des 20. Jahrhunderts auch als Actinomyceten bezeichnet wurden, war begrenzt, da das Hauptinteresse der Bakteriologie hauptsächlich Krankheitskeimen und unizellulären Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, Bazillen oder Kokken galt. Zwar bestand schon seit dem Beginn des 20. Jahrhunderts an ihnen großes Interesse als Teil der mikrobiellen Bodenflora, jedoch standen der Erforschung der Actinomyceten Hindernisse entgegen, wie u. a. die große Variabilität ihrer Erscheinungsformen, die eine Einteilung in Arten erschwerte (Kuznetsov, 1990).
Dass Actinomyceten antimikrobielle Stoffe bilden können, ist zuerst Lieske aufgefallen (Lieske, 1921; Kuchar, 1961), jedoch verfolgte er diesen Aspekt seiner umfänglichen Beschäftigung mit Streptomyceten nicht weiter. Erst nach der Entdeckung des Penicillins aus dem Schimmelpilz Penicillium sp. durch Fleming gerieten auch Bakterien als mögliche Bildner von Antibiotika stärker in den Fokus der mikrobiologischen Forschung. Ein Meilenstein war hierbei die Isolierung des gegen
1. Einleitung
13 Pneumokokken wirksamen Tyrothricins (Abb. 2) aus einer Kultur des Bodenbakteriums Brevibacterium brevis durch Dubos (1937). Dubos entwickelte hierauf Tyrothricin zum ersten kommerziell angewandten Antibiotikum überhaupt (Hotchkiss und Dubos, 1940), das im Weltkrieg weitverbreitet zur topicalen Behandlung von Wundverletzungen Anwendung fand. Der Erfolg des Tyrothricins verhalf der Entwicklung des bis dahin vernachlässigten Penicillins, welches Fleming 10 Jahre zuvor aus einem Schimmelpilz isoliert hatte, zu einem großen Aufschwung (Fleming, 1929; Diggins, 2003). Durch die aufrüttelnden Ergebnisse von Dubos und auch die Aufmerksamkeit, die das Penicillin erregte, stimuliert, begann Waksman ab 1939 sein Augenmerk auf das Vermögen von Actinomyceten zu richten, Antibiotika zu produzieren. Waksman war Bodenmikrobiologe und beschäftigte sich mit Actinomyceten seit 1917. Zusammen mit seinem Doktoranden Woodruff konnte er schon bald die Produktion von Antibiotika in Actinomyceten (später von ihm als Streptomyceten bezeichnet) zeigen.
Abbildung 2: Strukturen des Tyrothricin, Actinomycin D und Streptothricin. Die Annotation von Streptothricin erfolgt
anhand der Kettenlänge, n = 1 (F), 2 (E), 3 (D), 4 (C), Abkürzungen: Sar = Sarkosin, N-Methylglycin.
Als erstes Antibiotikum wurde schon bald darauf (1940) das Actinomycin entdeckt (Abb. 2), welches von Actinomyces antibioticus (später Streptomyces antibioticus) produziert wurde (Waksman und Woodruff, 1941). In der Folge gelang die Entdeckung weiterer Antibiotika, wie des Streptothricins (Waksman, 1943) (Abb. 2) und bedeutsamer Weise auch des Streptomycins aus Streptomyces griseus (1943) (Schatz et al., 1944; Waksman, 1952) oder des Neomycins aus Streptomyces fradiae (Waksman und Lechevalier, 1949). Streptomycin fand eine Zeitlang in der Humanmedizin Anwendung bei der Behandlung der Tuberkulose (A Medical Research Council Investigation, 1948).
1. Einleitung
14
Insgesamt entdeckten Waksman und seine Mitarbeiter bis zum Ende der 50er Jahre 27 verschiedene neue Antibiotika und läuteten damit die goldene Zeit der Antibiotikaforschung ein, die bis in die 80er Jahre andauerte und viele heutzutage nicht mehr aus der Hand des Arztes wegzudenkende Therapeutika zu Tage förderte (Kresge et al., 2004). Seitdem allerdings geht die Entdeckung wichtiger Leitstrukturen aus den Streptomyceten zurück. Möglicherweise werden andere Bakteriengruppen, wie die Myxobakterien ihren Platz als Quellen neuer Stoffe einnehmen (Gerth et al., 2003).
Eine der mit E. coli oder mit anderen Bakterien mit z. T. klinischer Bedeutung ähnliche biochemische oder genetische Erforschung der Streptomyceten begann grundlegend erst Mitte der 50er Jahre. Genetische Studien von Alikhanian, Sermonti, Bradley, Hopwood und anderen zeigten, dass Streptomyceten viele Gemeinsamkeiten mit anderen Bakterien haben, wie Mechanismen der Rekombination, Transformation und der Transduktion (Kaempfer, 2006). Arbeiten zur Biosynthese der Antibiotika bzw. der Physiologie und Induktion ihrer Bildung, insbesondere des Streptomycins, Tetracyclins und auch des Actinomycins begannen zu derselben Zeit in verschiedenen Laboratorien (Demain und Inamine, 1970; Hochstein et al., 1953; Waksman und Woodruff, 1941). Die Darstellung einer ersten chromosomalen Kopplungsgruppe gelangen Sermonti und Hopwood (Hopwood et al., 1963) auf der Basis von Mehrfaktorkreuzungen. Diese wurde in der Folge durch Hopwood zur Genkarte des am besten untersuchten Streptomyceten, Streptomyces coelicolor A (3) 2, fortentwickelt (Hopwood, 1965, 1967; Kieser et al., 1992). Ihm gelang letztendlich der Beweis, dass Streptomyceten nur ein einziges Chromosom besitzen und damit Bakterien sind.
Diese in den 60er und frühen 70er Jahren gewonnenen Ergebnisse ermöglichten dann die Anwendung zahlreicher bei E. coli entwickelter molekularbiologischer und molekulargenetischer Methoden, die in der Isolierung von Plasmiden (Schrempf et al., 1975), der Darstellung von Plasmid-basierten Transformationssystemen (Thompson et al., 1980) und der Klonierung und Expression von Genen (Chater et al. 1982) ihren Ausdruck fanden. Diese Arbeiten kulminierten in der Klonierung des ersten Antibiotikum-Biosynthese-Gencluster, dem Actinorhodin-Gencluster (Malpartida und Hopwood, 1984, 1986). In der jetzigen Zeit stellen Streptomyceten gut zugängliche Mikroorganismen für zahlreiche Anwendungen in der Molekularbiologie, Gentechnik und Biotechnologie dar. Durch die Sequenzierung ihrer Genome stellen sie ein unerschöpfliches Reservoir interessanter Gene und vor allem von Antibiotika-Biosynthese-Genclustern bereit.
1. Einleitung
15
1.2. Entdeckung, Struktur und Funktion des Actinomycin
Actinomycin war das erste Antibiotikum, welches 1940 von Selman H. Waksman und H. Boyd Woodruff aus einem Streptomyceten isoliert wurde (Waksman und Woodruff, 1941). Das Actinomycin A, eine gelblich-rote Substanz und eigentlich ein Gemisch verschiedener Substanzen mit sehr ähnlichen Strukturen, wurde aus der Kulturbrühe von Actinomyces antibioticus (später Streptomyces antibioticus) isoliert. Weitere von Actinomycin A unterschiedliche Actinomycine wurden in anderen Laboratorien bis Ende der 50er Jahre entdeckt (Katz, 1967). Hierdurch besitzen verschiedene chemisch eindeutige Actinomycine oft unterschiedliche Namen, da sie fast immer als Gemische (sog. Actinomycin-Komplexe) synthetisiert werden und darunter einzelne Mitglieder eines Komplexes mit Mitgliedern eines andernorts gefundenen und anders bezeichneten Komplexes identisch sind. Bekannte Actinomycin-Komplexe sind in Tabelle 1 angegeben (nach Katz, 1967 und Bitzer et al., 2009).
Insgesamt sind mehr als über 30 verschiedene natürliche Actinomycine bekannt (Bitzer et al., 2009). Durch gezielte Fütterung mit künstlichen Aminosäure-Homologen lässt sich die Zahl der Actinomycine aber weiter erhöhen (Formica et al., 1968; Formica und Katz, 1973). Die Fähigkeit zur Actinomycin-Bildung ist unter Streptomyceten weit verbreitet (Katz, 1967; Atherton und Meienhofer, 1973). Auch einige Micromonospora Arten sind zur Actinomycin-Bildung befähigt (Fischer et al., 1951).
Actinomycine besitzen Aktivität als Antibiotika. Jedoch zeigte die schon früh erkannte Toxizität des Actinomycins beim Tier (Waksman und Tischler, 1942), dass es als Antibiotikum nicht verwendbar ist. Später anfangs der 50er Jahre wurde erkannt, dass Actinomycin Aktivität gegen maligne Zellen besitzt, die zur Anwendung als antineoplastisches Agens bei verschiedenen Tumorarten führte (Hackmann, 1956). Die darauf einsetzende intensive Forschung am Mechanismus des Actinomycins ergab, dass Actinomycine Inhibitoren der Transkription sind (Reich, 1964) und an DNA binden. Ihr Wirkungsmechanismus betrifft gleichermaßen die pro- und eukaryotische Transkription (Reich und Goldberg, 1964). Wegen ihrer zu hohen Toxizität kommen die Actinomycine auch als Chemotherapeutika nur noch bei bestimmten Krebsarten zum Einsatz. Zum Beispiel in Verbindung mit anderen Chemotherapeutika zur Behandlung von Nierentumoren oder Weichteilsarkomen (Turan et al., 2006; Khatua et al., 2004) und dem Ewing Sarkom bei Kindern (Abd El-Aal et al., 2005).
1. Einleitung
16
-Ring -Ring
(1) Actinomycin D als Grundstruktur
Actinomycin D Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal
(2) N-Demethyl Actinomycine
Actinomycin D0 Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-Val-Pro-Gly-MeVal N,N'-Didemethylactinomycin D Thr-D-Val-Pro-Gly-MeVal Thr-D-Val-Pro-Gly-MeVal
(3) C-Actinomycine
Actinomycin C2 Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-aIle-Pro-Sar-MeVal Actinomycin C2 Thr-D-aIle-Pro-Sar-MeVal Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Actinomycin C2β Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-aIle-Pro-Sar-MeVal Actinomycin C3 Thr-D-aIle-Pro-Sar-MeVal Thr-D-aIle-Pro-Sar-MeVal
(4) F-Actinomycine
Actinomycin F8 Thr-D-Val-Sar-Sar-MeVal Thr-D-Val-Sar-Sar-MeVal Actinomycin F9 Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal
Thr-D-Val-Sar-Sar-MeVal
Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-Val-Sar-Sar-MeVal
(5) X-Actinomycine
Actinomycin X0α Thr-D-Val-Sar-Sar-MeVal Thr-D-Val--Sar-MeVal Actinomycin X0β Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-Val-Hyp-Sar-MeVal Actinomycin X0δ Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-Val-aHyp-Sar-MeVal Actinomycin X1a Thr-D-Val-Sar-Sar-MeVal Thr-D-Val-OPro-Sar-MeVal Actinomycin X2 Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal Thr-D-Val-OPro-Sar-MeVal
(6) Z-Actinomycine
Actinomycin Z1 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal HThr-D-Val-MOPro-Sar-MeAla
Actinomycin Z2 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal Thr-D-Val-MOPro-Sar-MeAla Actinomycin Z3 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal ClThr-D-Val-MOPro-Sar-MeAla
Actinomycin Z4 Thr-D-Val-MPro-Sar-MeVal Thr-D-Val-MOPro-Sar-MeAla Actinomycin Z5 Thr-D-Val-MPro-Sar-MeVal ClThr-D-Val-MOPro-Sar-MeAla
Actinomycin ZP Thr-D-Val-MPro-Sar-MeVal Thr-D-Val-MPro-Sar-MeVal
(7) G-Actinomycine
Actinomycin G1 Thr-D-Val-Pro-Sar-MeVal HThr-D-Val-HMPro-Sar-MeAla
Actinomycin G2 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal ClThr-D-Val-Pro-Sar-MeAla
Actinomycin G3 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal HThr-D-Val-Pro-Sar-MeAla
Actinomycin G4 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal Thr-D-Val-Pro-Sar-MeAla Actinomycin G5 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal cHThr-D-Val-Pro-Sar-MeAla
Actinomycin G6 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal rHThr-D-Val-Pro-Sar-MeAla (8) Y-Actinomycine
Actinomycin Y1 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal ClThr-D-Val-OPro-Sar-MeAla
Actinomycin Y2 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal ClThr-D-Val-Hyp-Sar-MeAla
Actinomycin Y3 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal rHThr-D-Val-OPro-Sar-MeAla
Actinomycin Y4 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal rHThr-D-Val-Hyp-Sar-MeAla
Actinomycin Y5 Thr-D-Val-HMPro-Sar-MeVal cThr-D-Val-OPro-Sar-MeAla
Tabelle 1: Überblick über natürlich vorkommende Actinomycine nach Bitzer et al. 2009 und Katz, 1967. Unterschiede zu
Actinomycin D sind in fett gekennzeichnet. Abkürzungen: MeVal = N-Methylvalin, MeAla = N-Methyl-L-Alanin, aIle = allo-Isoleucin, Sar = Sarkosin (N-Methylglycin),MPro = cis-5-Methylprolin, HMPro = trans-3-Hydroxy-cis-5-Methylprolin, Hyp =
trans-Hydroxyprolin, OPro = Oxoprolin, MOPro= cis-5-Methyl-Oxoprolin, aHyp = cis-Hydroxyprolin, HThr =
4-Hydroxythreonin, ClThr = 4-Chlorothreonin, cThr/rHThr = cyclisches Thr oder HThr.
Die Strukturaufklärung der Actinomycine ist hauptsächlich das Verdienst von H. Brockmann. Seine Arbeiten mündeten 1964 in der Veröffentlichung der Struktur von Actinomycin C3, eines Bestandteils des Actinomycin C Komplexes aus Streptomyces chrysomallus (Brockmann und Grubhofer, 1949, 1950; Brockmann et al., 1951; Brockmann und Lackner, 1960). Diese Arbeiten ergaben, dass sie
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17 Chromopentapeptidlactone sind, in denen zwei Pentapeptidlactonringe amidartig mit den Carboxylgruppen einer Phenoxazinon-Dicarbonsäure (2-Amino-4,6-dimethylphenoxazine-3-one-1,9-dicarbonsäure) verknüpft sind (Abb. 3). Letztere wird auch als Actinocin bezeichnet (Brockmann und Muxfeldt, 1958).
Weitere Untersuchungen und Strukturaufklärungen unterschiedlicher Actinomycine zeigten, dass diese sich sämtlich durch konservative Aminosäure-Substitutionen in den Aminosäurepositionen ihrer Pentapeptidlactonringe unterscheiden und dass der Actinomycin-Chromophor Actinocin immer der Selbe ist (Tabelle 1, Abb. 3). Der Chromophor der Actinomycine hat keine perfekte spiegelsymmetrische Struktur, demgemäß unterscheidet man die Ringe des Tricyclus als - und als -Ring (Abb. 3). Zusätzlich fand man heraus, dass auch die Verteilung der Pentapeptidlactonringe bestimmten Regeln unterliegt. Entsprechend kann man unterschiedliche oder gleiche Ringe auf den beiden Seiten des Chromophor antreffen. Man spricht dann von aniso- bzw. iso-Actinomycinen. Streptomyces chrysomallus zum Beispiel produziert Actinomycin C, welches ein Gemisch aus drei verschiedenen Actinomycinen ist, der Actinomycine C1, C2 und C3. Actinomycin C2 und Actinomycin C3 unterscheiden sich von Actinomycin C1 dadurch, dass ein bzw. beide D-Valine-Reste in der Position 2 durch D-allo-Isoleucin ersetzt sind (Katz, 1967) (Tabelle 1). Aus den Strukturen verschiedener bestimmter Actinomycine kann man ableiten, dass offensichtlich derjenige Ring, der die hydrophoberen Aminosäurereste besitzt, in einem Anisoactinomycin bevorzugt in der -Seite zu finden ist, d. h. dass z. B. das Actinomycin C2 hauptsächlich als C2 vorliegt (siehe Tabelle 1 oder Abb.
3) (Brockmann und Franck, 1960).
Abbildung 3: Struktur des Actinomycin D. Andere Actinomycine unterscheiden sich von Actinomycin D durch
Substitutionen in den angegebenen Positionen der Pentapeptidringe. Sar = Sarkosin, N-Methylglycin, ClThr = 4-Chlorothreonin.
Aus den erhaltenen Actinomycinstrukturen wurde abgeleitet, dass von den Aminosäuren der Peptidringe das in Position I befindliche Threonin und das in Position 4 befindliche Sarkosin nicht substituierbar sind, während die anderen Aminosäurepositionen von Actinomycingemisch zu
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Actinomycingemisch variieren können (Katz, 1967). Diese Variationen betreffen die Aminosäuren in Position 2, wo D-Valin durch D-allo-Isoleucin ersetzt sein kann, die Position 3, wo das Prolin durch Prolinanaloga oder andere Iminosäuren wie z. B. dem Sarkosin, 4-Oxoprolin, 4-Hydroxyprolin ersetzt sein kann (Formica et al., 1968; Formica und Katz, 1973). Schließlich kann bei einigen natürlichen Actinomycinen das N-Methylvalin durch N-Methylalanin ersetzt sein. Einige der in Actinomycin möglichen Aminosäure-Substitutionen sind in Abb. 3 gezeigt.
Eine Ausnahme von der Threonin-Regel der Position 1 ist in der Struktur der Actinomycine des Z-, G- und Y-Komplexes realisiert (Bossi et al., 1958; Lackner et al., 2000, 2000; Bitzer et al., 2006, 2009). Einige Mitglieder dieser Actinomycin-Komplexe enthalten im -Ring statt Threonin das 4-Chlorothreonin. Das 4-Chlorothreonin kann eine zusätzliche Kondensation seiner Seitengruppe mit der 2-Aminogruppe des Chromophors eingehen, was zu einem zusätzlichen Ring in der Actinomycin-Struktur führt (Actinomycin Komplexe G und Y) (Abb. 4).
Abbildung 4: Struktur der Actinomycine D, Y1, G3 und G5. Abbilungen nach Bitzer et al. 2009. Unterschiede zu Actinomycin D sind in rot gekennzeichnet.
1.3. Wirkungsmechanismus des Actinomycin
Untersuchungen des Wirkmechanismus des Actinomycin haben gezeigt, dass Actinomycine in die DNA interkalieren können. Sobell und Mitarbeiter haben den DNA-Actinomycin-Komplex kristallisiert und die Struktur durch Röntgenanalyse bestimmt (Sobell et al., 1971; Sobell, 1985). Sie zeigten, dass
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19 sich der Phenoxazinon-Chromophor des Actinomycins bevorzugt zwischen Basenpaare der GC-Sequenz von der großen Furche der DNA her interkaliert, während sich die beiden Pentapeptidlactonringe entgegengesetzt voneinander in die kleine Furche einlagern (Abb. 5).
Abbildung 5: a) Struktur des Actinomycin D. Der grüne Teil (Phenoxazinone-Chromophor des Actinomycins) interkaliert
bevorzugt zwischen Basenpaare der GC Sequenz von der großen Furche der DNA, während der rote Teil (Pentapeptidlactonringe) sich entgegengesetzt voneinander in die kleine Furche einlagert. (Sar = Sarkosin, N-Methylglycin)
b) Komplex aus zwei Actinomycin Molekülen und DNA. Das DNA Rückgrat ist blau gezeichnet. In der Abbildung binden
zwei Moleküle Actinomycin an den dargestellten DNA Doppelstrang. Die Abbildung ist erstellt aus der PDB-Datei 1MNV durch Paramanathan et al., 2012.
Dieser Einlagerungsmechanismus ist die Basis für die beobachtete Hemmung der Transkription von DNA in Bakterien und Eukaroyten (Reich und Goldberg, 1964). Allerdings hemmt Actinomycin in Eukaryoten bevorzugt die Transkription von rDNA im Nucleolus, welches auf der besonderen Empfindlichkeit der RNA Polymerase III gegenüber Actinomycin-DNA Interkalationen beruhen könnte (Trask und Müller, 1988; Christensen et al., 2004). Zum anderen enthält der Nucleolus 70 % der gesamten Topoisomerase I des Zellkerns. Topoisomerase I ist sowohl an der Transkription als auch der Replikation der DNA beteiligt und wird durch Interkalatoren gehemmt und bindet Actinomycin. Möglicherweise erklären diese Befunde die besondere Sensitivität der rDNA Transkription gegenüber Actinomycin und möglicherweise inhibiert Actinomycin neben der Transkription auch die Replikation (Trask und Müller, 1988). Durch die Interkalation und der spezifischen Wirkung auf die Transkription und indirekt auch auf die Translation ist Actinomycin ein wichtiges Hilfsmittel in der molekularbiologischen Forschung. Das 7-Amino-derivat (7-AAD) von Actinomycin D wird als Fluoreszenzfarbstoff für die Detektion von DNA in der Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie benutzt (Gill et al., 1975).
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1.4. Die Biosynthese des Actinomycin
Untersuchungen der Biosynthese des Actinomycins reichen bis in die frühen 50er Jahre zurück. Erste Arbeiten von Katz und Mitarbeitern beschäftigten sich mit der Bildung und Regulation des Antibiotikums hauptsächlich in den beiden Stämmen S. antibioticus und Streptomyces parvulus (Katz et al., 1958), während Brockmanns Stamm S. chrysomallus nur wenig verwendet wurde (Yajima et al., 1972). S. antibioticus synthetisiert Actinomycine des Komplexes. Die einzelnen Mitglieder des X-Komplexes werden in der Literatur zumeist als Actinomycine I-V bezeichnet (IV ist identisch mit Actinomycin C1, D) (Tabelle 1) (Goss und Katz, 1957; Katz et al., 1958) während im Gegensatz dazu S. parvulus nur ein einzelnes Actinomycin, das Actinomycin D, bildet (Williams und Katz, 1977). Bemerkenswerterweise produziert S. antibioticus Actinomycin nur in Medien mit schwer verwertbaren Kohlenstoffquellen (Goss und Katz, 1957; Katz et al., 1958), während in Gegenwart von Glukose sehr wenig Actinomycin produziert wird (Goss und Katz, 1957; Gallo und Katz, 1972). Diese Arbeiten trugen wesentlich zum Paradigma der Katabolitrepression des Sekundärstoffwechsels bei, dessen Regulation in der Prä-DNA Ära bis ca. 1985 ein weites Forschungsfeld innerhalb der Naturstoffforschung darstellte (Bu’lock, 1961; Aharonowitz und Demain, 1978). Tatsächlich konnte im Fall der Actinomycinsynthese in S. antibioticus Katabolitrepression durch Glukose gezeigt werdend (Gallo und Katz, 1972).
Andere Arbeiten der Gruppe von Katz in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Weissbach in den 1960er Jahren beschäftigten sich mit der Aufklärung der Vorläufer der Aminosäuren, welche sich im Pentapeptidlactonringen und im Chromophor Actinocin der Actinomycine befinden (Weissbach und Katz, 1961; Katz und Weissbach, 1963). In den beiden Stämmen S. antibioticus und S. chrysomallus wurden Fütterungsexperimente mit radioaktiven Aminosäuren durchgeführt, um die Vorläufer der Pentapeptidlactonring-Aminosäuren zu bestimmen. Es wurde gezeigt, dass der Vorläufer des Threonins das freie Threonin ist. Der Vorläufer des D-Valins ist das freie L-Valin (D-Valin wird nicht eingebaut, Katz, 1959), der Vorläufer des Prolins ist das freie Prolin, der Vorläufer des Sarkosins ist das freie Glycin und der Vorläufer des N-Methylvalins ist das freie Valin (Katz und Weissbach, 1963). Über Radioisotopeneinbauexperimente konnte auch gezeigt werden, dass die Methylgruppen des Sarkosins, N-Methylvalins und des Phenoxazinonchromophors alle vom Methionin abstammen. Dies implizierte, dass S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) der Methylgruppen-Donor ist (Katz, 1967). Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit dem Einfluss von Antibiotika auf die Synthese von Actinomycin. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung des Actinomycins durch Chloramphenicol
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21 oder Streptomycin nicht inhibiert wurde, was darauf hinweist, dass die Biosynthese enzymatisch ist und nicht am Ribosom stattfindet (Katz und Weissbach, 1962) (Abb. 3).
1.5. Phenoxazine als Bestandteile von Naturstoffen
Der Actinomycinchromophor Actinocin (2-Amino-4,6-dimethylphenoxazine-3-one-1,9-dicarbonsäure) besitzt eine Phenoxazinonstruktur. Diese Struktur ist auch in anderen Naturstoffen anzutreffen, zum Beispiel ist die Cinnabarinsäure ein häufig in Pilzen anzutreffender Metabolit (Abb. 6) (Smania et al., 2003). Sie stellt das Demethylhomologe des Actinocins dar. Im Unterschied zu letzterem kommt sie nur alleinstehend vor, d. h. ohne Verknüpfung ihrer Carboxylgruppen mit Peptidstrukturen. Das Exfoliazon und das Grixazon sind Phenoxazinone ohne Carboxylfunktion und besitzen wie die Cinnabarinsäure ebenfalls keine C-Methylgruppen, sie werden von Streptomyceten gebildet (Abb. 6) (Imai et al., 1990; Ohnishi et al., 2004). Die bedeutendsten bzw. bekanntesten Phenoxazine sind die Ommochrome, welche als Insekten-Augenpigmente bekannt wurden, aber auch als Pigmente in Krustazeen, Mollusken und Spinnentieren weit verbreitet sind (Linzen, 1967). Auch sie besitzen keine Methylgruppen am Phenoxazinonchromophor. Somit ist das Actinocin das einzige Phenoxazinon, dass zusätzlich zwei Methylgruppen an den - und -Ringen des Tricyclus trägt.
Abbildung 6: a) Aufbau von Xanthommatin ausgehend von 3-Hydroxykynurenin (3-HK); b) Aufbau von Cinnabarinsäure ausgehend von 3-Hydroxyanthranilsäure (3-HA); c) Struktur des Exfoliazon; d) Aufbau von Grixazon B nach Suzuki et al., 2006.
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Die Untersuchungen der Biosynthese der Ommochrome durch Butenandt und Mitarbeiter ergaben, dass das Xanthommatin durch oxidative Kondensation von zwei Molekülen 3-Hydroxykynurenin (3-HK) und die Cinnabarinsäure von zwei 3-Hydroxyanthranilsäure (3-HA) Molekülen entstehen (Abb. 6) (Butenandt und Neubert, 1955; Butenandt, 1957). Gemeinsam ist beiden Ausgangsmolekülen die Präsenz einer o-Aminophenolgruppierung, die für die oxidative Kondensation zum Phenoxazinon (auch Phenoloxidation genannt) essentiell ist. Die Bildung der Ommochrome geht vom Tryptophan aus (Abb. 7). Dabei wird das Tryptophan von einer Tryptophan-2,3-dioxygenase zu Formylkynurenin oxidiert. Im zweiten Schritt wird das Formylkynurenin von einer Kynureninformamidase zu Kynurenin und Ameisensäure hydrolysiert und anschließend im nächsten Schritt wird das Kynurenin durch die Kynureninhydroxylase (Kynurenin-3-Monooxygenase) zu 3-Hydroxykynurenin (3-HK) hydroxyliert. Im vierten Schritt der Synthese wird schließlich das 3-HK durch Phenoloxidation in das Xanthommatin konvertiert. Im Falle der 3-HA wird diese zuvor aus 3-HK durch Wirkung einer Kynureninase oder Hydroxykynureninase generiert.
Abbildung 7: Der Weg von Tryptophan zu Xanthommatin und 3-Hydroxyanthranilsäure (3-HA) (Linzen, 1967).
3-HA ist in vielen Lebewesen (Pilze, Hefen, höhere Eukaryoten und auch in einer kleinen Anzahl an Bakterien) eine essentielle Verbindung als Vorläufer der Nikotinsäure, dem aktiven Baustein des Nikotinadenindinucleotids (NAD) bzw. des Nikotinadenindinucleotidphosphats (NADP) (Lima et al., 2009) (Abb. 8). Genomische Daten zeigen, dass Streptomyceten keine 3-HA produzieren sollten, da ihnen das Gen für die Kynureninmonooxygenase fehlt (Lima et al., 2009). Es wird postuliert, dass sie NAD über den sogenannten Aspartat-Weg synthetisieren. Hierbei wird aus Aspartat und Glycerinaldehyd-3-phosphat die Chinolinsäure gebildet, welche in weiteren Schritten zu Nikotinsäure umgewandelt wird (Mattey und Robbie, 1970; Foster und Moat, 1980).
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Abbildung 8: Aufbau von NAD ausgehend von Asparaginsäure oder 3-Hydroxyanthranilsäure (3-HA).
Aufbauend auf die Arbeiten von Butenandt et al. (Butenandt und Neubert, 1955; Butenandt, 1957) aber auch den oben erwähnten chemischen Actinomycin-Synthesen von Brockmann und Mitarbeitern zeigten Katz und Weissbach, dass der Actinomycin-Chromophor Actinocin in gleicher Weise wie die Ommochrome vom Tryptophan abgeleitet ist (Katz und Weissbach, 1962). Jedoch ist unmittelbarer Vorläufer des Chromophors nicht die 3-HA, sondern der in der Natur ungewöhnliche Vorläufer 3-Hydroxy-4-methylanthranilsäure (kurz 4-MHA). Dieser ergibt durch oxidative Kondensation direkt das Actinocin (Katz und Weissbach, 1962) (Abb. 9). Diese Kondensation war vorher schon von Brockmann und Muxfeldt bei der chemischen Synthese des Actinocins gezeigt und als möglicher Biosyntheseweg diskutiert worden (Brockmann und Muxfeldt, 1958).
Abbildung 9: Oxidation von 4-MHA zu 2-Amino-4,6-dimethyl-3-phenoxazinon-1,9-dicarbonsäure (Actinocin) dem Chromophor der Actinomycine.
Katz und Weissbach (Weissbach et al., 1965) zeigten in in vivo Fütterungsexperimenten an Streptomyces antibioticus Myzelium, dass 4-MHA im Vergleich mit 3-HA oder 3-HK die Actinomycin-Synthese am stärksten stimulierte und somit die Methylgruppe nicht nach Bildung des Chromophors sondern vorher in seinen Vorläufer 4-MHA eingebaut werden sollte. Weiterhin fanden diese Autoren, dass der Chromophor nach Applikation von Benzen-Ring markiertem 14C-Tryptophan oder 14C-Methyl markiertem Methionin radioaktiv markiert war, was bewies, dass Trytophan und die Methylgruppe
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des Methionins Vorläufer der 4-MHA sind (Sivak et al., 1962). Außerdem konnten sie durch Trapping-Experimente in Myzelsuspensionen von S. antibioticus mit Benzen-Ring markierten 14C-Tryptophan in der Anwesenheit überschüssiger nichtmarkierter 4-MHA die Entstehung radioaktiver freier 4-MHA nachweisen, die sich in dem Pool nichtmarkierter überschüssiger 4-MHA anhäufte. Diese Daten zeigen, dass 4-MHA als freie Zwischenstufe in der Zelle der Streptomyceten vorkommt. (Sivak et al., 1962).
Diese Daten fanden Erweiterung durch die Auffindung einer Phenoxazinonsynthase (PHS) in S. antibioticus (Weissbach und Katz, 1961), die in vitro 4-MHA in Actinocin aber auch 3-HA oder andere o-Aminophenole in die entsprechenden Phenoxazinone unter Sauerstoffverbrauch konvertierte. Die PHS war in ihrem zeitlichen Auftreten in S. antibioticus Kulturen mit der Actinomycin-Synthese korreliert und wie diese durch Glukose reprimierbar (Gallo und Katz, 1972). Ob dieses Enzym tatsächlich eine spezifische Rolle im Syntheseweg des Actinomycin spielte, war schon zu der Zeit seiner Entdeckung mit Fragezeichen behaftet, da andere Actinomycin-produzierende Streptomyceten keine Phenoxazinonsynthase Aktivität enthielten und diese offensichtlich nur auf S. antibioticus und auf den Streptomyces erythreus, welcher kein Actinomycin produziert, beschränkt war (Weissbach und Katz, 1961).
Im Gegensatz zu der Identifikation von 4-MHA als direkter Präcursor von Actinocin und auch der Tatsache, dass sie von Tryptophan abgeleitet war, war der Schritt der Einführung der 4-Methylgruppe in den aromatischen Kern lange unklar. Favorisiert wurde die Ansicht, dass 4-MHA durch direkte Methylierung von 3-HA gebildet wird, weil 3-HA Zugabe zu S. antibioticus Myzelium die Actinomycin-Synthese stimulierte (Weissbach et al., 1965; Katz. 1967). Jedoch zeigten Fütterungesexperimente an S. antibioticus mit chemisch synthetisiertem 3-Hydroxy-4-methylkynurenin (4-MHK), dass 4-MHK den Einbau von radioaktivem benzenring-markierten Tryptophan in Actinomycin stärker verdünnte als 3-HA oder 3-HK. Dies wies darauf hin, dass der Methylierungsschritt eher an 3-HK als an 3-3-HA stattfinden könnte (Perlman et al., 1973). Diese Ansicht wurde jedoch zugunsten der 3-HA-Hypothese fallen gelassen, als einige Jahre später über die Auffindung eines 3-HA methylierenden Enzyms aus S. antibioticus berichtet wurde (Fawaz und Jones, 1988; Jones, 1987, 1993). Dieses Enzym wurde gereinigt und als 3-HA Methyltransferase charakterisiert.
1.6. Enzymatische Untersuchung der Actinomycin Synthese
Erste Arbeiten auf zellfreier Ebene mit Enzymen, welchen eine Rolle in der Actinomycin-Biosynthese zugeschrieben wurde, erfolgten mit der Phenoxazinonsynthase (PHS) aus S. antibioticus. PHS wurde
1. Einleitung
25 in der Arbeitsgruppe von Jones und Mitarbeitern biochemisch untersucht. Proteinchemische und enzymatische Studien zeigten, dass es ein Dimer aus zwei Untereinheiten von ca. 70.000 Molgewicht ist (Choy und Jones, 1981). Das Gen der PHS wurde aus S. antibioticus kloniert (Jones und Hopwood, 1984, 1984) und in S. lividans heterolog exprimiert (Jones und Hopwood, 1984, 1984; Jones, 1985, 1986). In der Arbeitsgruppe von Francisco wurde die Kristallisation und Röntgenanalyse des Enzyms durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass es sich bei der PHS um eine oligomere Multikupferoxidase handelt, welche einen Typ I und drei bis vier Typ II Kupferzentren enthält (Smith et al., 2004, 2006). Andere mutmaßliche an der Actinomycin-Chromophor-Biosynthese beteiligten Enzymaktivitäten, wie die Kynureninformamidase und die Kynureninase/Hydroxykynureninase wurden in Actinomycin-produzierendem S. parvulus gefunden und partiell gereinigt (Troost und Katz, 1979; Troost et al., 1980; Brown et al., 1980, 1986). Zwar konnte für diese biosynthetischen Enzymaktivitäten gezeigt werden, dass sie in ihrer spez. Aktivität zeitlich mit dem Beginn der Actinomycin Synthese in den Streptomyceten korrelierten, jedoch interferierten diese Enzymaktivitäten z. T. mit den entsprechenden katabolischen Enzymen des Tryptophanstoffwechsels in diesem Streptomyceten (besonders Kynureninformamidase und Kynureninase), welches eine eindeutige Zuordnung zur 4-MHA Synthese erschwerte.
Brown et al. (1980, 1986) fanden im Fall der Kynureninformamidase zwei Isoformen dieses Enzyms in S. parvulus. Die schwerere Form der Kynureninformamidase (Mr: 42.000) war konstitutiv, während eine nieder-molekulare Form (Mr: 24.000) erst kurz vor der Actinomycinbildung auftrat. Hieraus wurde abgeleitet, dass die leichtere Form der Kynureninformamidase eine Rolle in der Actinomycinsynthese spielt. Auch im Falle der Kynureninase/Hydroxykynureninase konnten zwei verschiedene Formen gefunden werden, die sich in ihren Größen von 82 und 56 kDa unterschieden. Das Kleinere der beiden Enzyme (Hydroxykynureninase) korrelierte zeitgleich und von seiner spezifischen Aktivität während des Kulturverlaufs mit der Actinomycinsynthese (Troost et al., 1980). Es bevorzugte 3-Hydroxykynurenin gegenüber Kynurenin als Substrat. Im Gegensatz dazu bevorzugte das Größere der beiden Enzyme (eine Kynureninase), deren Anwesenheit nicht mit der Actinomycin-Produktionsphase gekoppelt war, das Kynurenin als Substrat.
1.7. Biochemische Untersuchungen zum Aufbau der Peptidketten des
Actinomycins
Die Aufklärung der Biosynthese des Peptidrückgrats des Actinomycin erfolgte in der Arbeitsgruppe Keller (Keller und Schauwecker, 2001). Das erste isolierte und charakterisierte Enzym der
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nichtribosomalen Peptidassemblierung des Actinomycins, war das 4-MHA aktivierende Enzym (Actinomycin Synthetase I, ACMS I) aus S. chrysomallus (Keller et al., 1984). Es ist in der Lage, neben der 4-MHA (Abb. 10) auch andere aromatische Benzencarbonsäuren mit Ähnlichkeit zur 4-MHA als Adenylat zu aktivieren (Keller et al., 1984).
Abbildung 10: Adenylierung von 4-MHA durch die ACMS I. ACMS: Actinomycin Synthetase.
Bevorzugt sind Substrate mit einer Methylgruppe oder Hydroxylgruppe in 4-Position oder mit einer Hydroxylgruppe in der 3-Position. Diese relaxierte Substratspezifität der ACMS I motivierte Untersuchungen des Einflusses solcher 4-MHA-Analoga auf die Bildung von Actinomycin in vivo (Keller et al., 1984). Mehrere dieser aromatischen Carbonsäuren wurden tatsächlich in guten Ausbeuten in neue Verbindungen eingebaut. Die Strukturaufklärung dieser Verbindungen zeigte, dass alle Produkte Strukturanaloga des bis dahin hypothetischen Actinomycin-Halbmoleküls, des 4-MHA-Pentapeptidlactons waren. Diese Strukturanaloga enthielten anstelle der 4-MHA die entsprechenden Benzencarbonsäuren (Abb. 11).
Abbildung 11: Strukturanaloga des Actinomycin Halbmoleküls (MHA Pentapeptidlacton, links), welche anstelle der
4-MHA Pentapeptidlactone gebildet wurden. Von links nach rechts: 3-Hydroxybenzoyl Pentapeptidlacton, 3-Hydroxy-4-methyl-benzoyl Pentapeptidlacton, 4-Aminobenzoyl Pentapeptidlacton.
Das Auftreten dieser Aoryl Pentapeptidlactone in den Fütterungsexperimenten zeigte indirekt, dass Actinomycin tatsächlich durch oxidative Kondensation von zwei 4-MHA-Pentapeptidlactonen entstehen musste und nicht durch nachträgliches Anfügen der Aminosäuren der
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27 Pentapeptidlactonringe an den vorgefertigten Actinomycin Chromophor Actinocin (Abb. 12). Weiterhin konnte deswegen angenommen werden, dass 4-MHA nach seiner Aktivierung zunächst sukzessive mit den Aminosäuren der Peptidkette zu einem 4-MHA Pentapeptid kondensiert wird und nicht, dass 4-MHA zuerst in das Actinocin konvertiert werden würde. In der Folge der Aufklärung der ACMS I wurden die multifunktionellen nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS, Actinomycinsynthetasen II und III) und das 4-MHA Carrierprotein, welches nach ihrer Aktivierung durch ACMS I die 4-MHA als Thioester bindet, aus S. chrysomallus isoliert und charakterisiert.
Abbildung 12: Aufbau des Actinomycins ausgehend von zwei Actinomycin Halbmolekülen (4-MHA Pentapeptidlacton),
(Sar = Sarkosin, N-Methylglycin).
Actinomycinsynthetase II (ACMS II) ist eine bimodulare NRPS, welches die Aminosäuren Threonin und Valin aktiviert, ihr Molgewicht wurde mit 280 kDa bestimmt (Keller, 1987). Dieses Enzym besitzt in seinem zweiten Modul zusätzlich eine Epimerasefunktion zur Epimerisierung von 4-MHA-Thr-L-Valin zu 4-MHA-Thr-D-4-MHA-Thr-L-Valin (Stindl und Keller, 1993). Die ACMS III ist eine trimodulare Peptidsynthetase, welche die Aminosäuren Valin, Prolin und Glycin aktiviert, sein Molgewicht wurde mit 460 kDa bestimmt. Dieses Enzym besitzt in seinem zweiten und dritten Modul jeweils eine N-Methyltransferasedomäne, die das Glycin und das Valin vor ihrem Einbau in die Peptidkette methylieren (Keller, 1987) (Abb. 13).
Zur Initiation der Actinomycin Synthese auf ACMS II wird ein Carrierprotein, das AcmACP, benötigt. AcmACP hat eine Molmasse von 10 kDa und wird spezifisch von ACMS I mit der 4-MHA beladen (Stindl und Keller, 1993; Pfennig et al., 1999; Schmoock et al., 2005). AcmACP besitzt Ähnlichkeit mit dem Acyl Carrier Protein (ACP) der Fettsäuresynthase aus Streptomyces coelicolor. Es ist jedoch substratspezifisch für 4-MHA und seine Homologen, aber nicht für kleine Fettsäuren (Pfennig et al., 1999; Schmoock et al., 2005). Nach seiner Beladung mit 4-MHA katalysiert die C-domäne von ACMS II die Bildung der Peptidbindung zwischen AcmACP- thioestergebundenem 4-MHA und dem ersten Modul von ACMS II thioestergebundenem Threonin. Anschließend erfolgt die Kondensation von 4-MHA-Threonin mit Valin im zweiten Modul von ACMS II, welches 4-4-MHA-Threonin-L-Valin ergibt.
1. Einleitung
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Letzteres wird in einem weiteren Schritt durch die E-Domäne von ACMS II zu 4-MHA-Threonin-D-Valin epimerisiert.
Abbildung 13: Nichtribosomaler Aufbau des 4-MHA Pentapeptidlactons an den Actinomycin Synthetasen (ACMS). ACMS I
(4-MHA aktivierendes Enzym), AcmACP (Carrierprotein), ACMS II (Threonin und Valin aktivierendes Enzym), ACMS III (Prolin, Glycin und Valin aktivierendes Enzym) (Sar = Sarkosin, N-Methylglycin).
ACMS III wurde als Prolin, Glycin und Valin aktivierendes Protein, das zusätzlich noch kovalent gebundenes Glycin und Valin zu den entsprechenden N-Methylaminosäuren methyliert, identifiziert (Keller, 1987). Seine Charakterisierung zeigte, dass es in in vivo Bedingungen auch die Bildung verschiedener Diketopiperazine zwischen Prolin, N-Methylvalin und Sarkosin katalysiert (Stindl, 1987). Die Klonierung des Gens der ACMS III und seine Expression in S. lividans (Schauwecker et al., 2000) ermöglichte schließlich die Ableitung des Gesamtaufbaus des Actinomycin Halbmoleküls. Von der ACMS II ausgehend wird das 4-MHA-Threonin-D-Valin auf die ACMS III übertragen unter der Bildung von 4-MHA-Threonin-D-Valin-Prolin, welches sukzessiv mit Sarkosin (Methylglycin) und N-Methylvalin verlängert wird und schließlich durch die Carboxyterminale Te-Domäne zu Peptidlacton zyklisiert wird (Abb. 13).
Bei den Actinomycinsynthetasen handelt es sich somit um insgesamt sechs Module. Das Initiationsmodul besteht im Vergleich zu den meisten Peptidsynthetasen, wie z. B. der Gramicidin S Synthetase oder der Tyrocidin Synthetase (Stein et al., 1995; Marahiel et al., 1985) aus einer alleinstehenden A-Domäne (ACMS I) und einer allein stehenden T-Domäne (AcmACP). Die fünf konventionellen Elongationsmodule (kanonische Domänenanordnung CAT) werden von den beiden multimodularen ACMS II und ACMS III gestellt. Die Gene dieser Peptidsynthetasen wurden kloniert und sequenziert (Schauwecker et al., 1998; Pfennig et al., 1999; Schauwecker et al., 2000; Keller und
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29 Schauwecker, 2001). Verschiedene rekombinante NRPS wurden mit diesen Genen hergestellt (Schauwecker et al., 2000; Lang, 2007)
1.8. Klonierung des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters
Die Klonierung des Actinomycin-Biosynthese-Ggenclusters gelang ausgehend von
Oligonucleotidproben, die aus tryptischen Peptidsequenzen von ACMS II und der aminoterminalen Sequenz der ACMS I abgeleitet worden waren, durch Hybridisierungs-Suche in einer Cosmidgenbank von S. chrysomallus DNA in E. coli. Es wurden mehrere Cosmide, die ACMS-Gensequenzen enthielten, erhalten. Die Sequenzierung eines ersten Cosmids, Cosmid cosA1, ergab die Gesamtsequenz der vier Peptidsynthetase Gene, flankiert von Sequenzen, die auf das Vorliegen von Kynureninase, Kynureninformamidase und Tryptophan-2,3-dioxygenase Gene schließen ließen. Chromosome-Walking und überlappendes Hybridisierungs-Screening der Cosmidgenbank führten zur Auffindung zweier Anschlusscosmide (cosP1 und 5a1) zu beiden Seiten des ersten Cosmids, mit Hilfe derer ein Gesamtbereich von ca. 50 kb zusammenhängender DNA (Contig) mit den NRPS Genen in der Mitte dargestellt werden konnte (Abb. 14). Die vorläufige Analyse der Gene und ihrer Lage in dem Biosynthese Gencluster ergab das Vorliegen einer besonderen Struktur des Genclusters. Während die NRPS Gene singulär waren, lagen die meisten der anderen Gene (unter ihnen auch zwei der vier präsumtiven 4-MHA Biosynthesegene) dupliziert im gleichen sequentiellen Arrangement vor, so dass zu beiden Seiten des NRPS Genclusters zwei sehr ähnlich Bereiche mit 9 bzw. 11 Genen in invertierter Anordnung vorliegen. Diese ähnelt einem riesigen Palindrom.
Abbildung 14: Das Actinomycin-Biosynthese-Gencluster. Blau: Actinomycin Synthetasen, weiß: Funktion unbekannt, rot:
4-MHA Biosynthese Gene, lila: Regulation, grün: Resistenz, weiß-rot kariert: IS, Insertionselemente.
Zwar konnten aus den Sequenzen der meisten Gene des Clusters mutmaßliche Funktionen insbesondere für die 4-MHA Synthese und auch einiger Resistenzgene abgeleitet werden, jedoch konnte nur die biochemische Charakterisierung Aufschluss über die betreffenden Funktionen der
1. Einleitung
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kodierten Proteine im Biosyntheseweg geben. Insbesondere war die Präsenz von Methyltransferase Genen, deren BLASTP Analyse auf Ähnlichkeit mit O-Methyltransferasen hinwiesen verwirrend, da als einzige Methyltransferase eigentlich nur die 3-HA Methyltransferase in Frage kam, diese aber eine C-Methyltransferase sein sollte. Ohne Expression und Charakterisierung war eine Zuordnung dieser Gene deshalb nicht möglich. Darüber hinaus mussten knock-out Mutationen und Homologievergleiche noch zeigen, inwieweit die anderen Genprodukte der Gene links und rechts der NRPS Gene mit den in früheren biochemischen Untersuchungen in Proteinextrakten von Actinomycin-produzierenden Streptomyceten wie S. parvulus (Troost et al., 1980) oder S. chrysomallus (Haese und Keller, 1988) angereicherten Enzyme identisch waren (Abb. 14).
1.9. Zielsetzung
In der vorliegenden Arbeit sollen die Gene des Actinomycin-Biosynthese-Gencluster mit besonderer Berücksichtigung der Gene für die 4-MHA Synthese analysiert werden. Durch Sequenzanalyse und Annotation der verschiedenen Orfs des Genclusters, der Expression in E. coli ausgewählter Gene und enzymatische Charakterisierung der Genprodukte sollen diesen postulierte Funktionen in der Actinomycin-Biosynthese zugeordnet und mögliche Aussagen zu ihrer Regulation ermöglicht werden. In vitro und in vivo Untersuchungen des Einflusses bzw. Effektes definierter und präsumtiver Präkursoren auf die Biosynthese des Actinomycins sollen die ermittelten enzymatischen Daten ergänzen und helfen ein Gesamtbild der Gesamtactinomycin-Synthese in S. chrysomallus auf molekularer Ebene zu erstellen.
2. Materialien
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2. Materialien
2.1. Chemikalien
Agar (Agar No. 3) Oxoid, Wesel
Agarose (peqGOLD Universal Agarose) peqLab, Erlangen
Ammoniumsulfat (für biol. Zwecke) Merck, Darmstadt
Ampicillin Sigma, Taufkirchen
Bacto-Trypton Roth, Karlsruhe
Benzamidin Sigma, Taufkirchen
Borsäure Merck, Darmstadt
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
BSA Sigma, Taufkirchen
Coomassie Brilliant Blue (G250, R250) Serva, Heidelberg
DTE Biomol, Hamburg
EDTA Biomol, Hamburg
Ethidiumbromid Sigma, Taufkirchen
Glycerin Roth, Karlsruhe
Hefeextrakt Roth, Karlsruhe
und BD Diagnostics, Sparks
His-Tag-Proteinmarker Qiagen, Hilden
Imidazol Fluka, Buchs
IPTG peqLab, Erlangen
Kanamycin Sigma, Taufkirchen
Lambda-DNA Sigma, Taufkirchen
Malzextrakt Merck, Darmstadt
N´,N´-Methylen-bis-Acrylamid Fluka, Buchs
NZ-Amin Sigma, Taufkirchen
Oligonukleotide TibMolbiol, Berlin
PageRuler™ Prestained Protein Ladder Fermentas. St. Leon Rot
PageRuler™ Unstained Protein Ladder Fermentas. St. Leon Rot
PMSF Sigma, Taufkirchen
Quicksafe A-Szintillationsflüssigkeit Zinsser Analytic, Frankfurt
Rindfleischextrakt Roth, Karlsruhe
Roti®-Mark Standard Roth, Karlsruhe
Rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe
Serva DNA Stain G Serva, Heidelberg
Tris Roth, Karlsruhe
Trypton BD Diagnostics, Sparks
β-Mercaptoethanol Sigma, Taufkirchen
2.2. Radiochemikalien
2. Materialien
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[3H-methyl]-S-Adenosyl-L-methionin2, 60 Ci·mmol-1 [14C-methyl]-L-Methionin1, 55 mCi·mmol-1
U-[14C]-Glycin1, 105 mCi·mmol-1
U-[14C]-L-Glutaminsäure1, 238 mCi·mmol-1 U-[14C]-Prolin1, 252 mCi·mmol-1
U-[14C]-Threonin1, 192 mCi·mmol-1 U-[14C]-Tyrosin1, 450 mCi·mmol-1 U-[14C]-Valin1, 260 mCi·mmol-1 L-[5-3H]-Tryptophan1, 17,9 Ci·mmol-1
Hersteller: 1Amersham Biosciences, Freiburg, 2BIOTREND, Köln, Perkin Elmer, Massachusetts
2.3. Reagentien
3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsäure Sigma, Taufkirchen
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (DOPA) Sigma, Taufkirchen
3,4-Dihydroxyzimtsäure (Kaffeesäure) Sigma, Taufkirchen
3-Hydroxyacetophenone Aldrich, Steinheim
3-Hydroxyanthranilsäure Merck, Darmstadt
3-Hydroxybenzoesäure Fluka, Buchs
3-Hydroxy-DL-kynurenin Sigma, Taufkirchen
4-Hydroxy-L-phenylglycin Aldrich, Steinheim
Actinomycin D Applichem, Darmstadt
Anthranilsäure Acros, Nidderau
Dopamin Sigma, Taufkirchen
Formyl-L-kynurenin Calbiochem-Behring, La Jolla
H-Tyr-(Me)-OH Bachem, Bubendorf
L-Glycin Sigma, Taufkirchen
L-Isoleucin Sigma, Taufkirchen
L-Kynurenin Sigma, Taufkirchen
L-Leucin Sigma, Taufkirchen
L-Methionin Sigma, Taufkirchen
L-Phenylalanin Sigma, Taufkirchen
L-Prolin Sigma, Taufkirchen
L-Threonin Sigma, Taufkirchen
L-Tryptophan Sigma, Taufkirchen
L-Tyrosin Sigma, Taufkirchen
D-Tyrosin Aldrich, Steinheim
DL-meta-Tyrosin MP Biomedicals, Solon
L-Homotyrosin Iris Biotech, Marktredwitz
D-Homotyrosin Iris Biotech, Marktredwitz
L-Valin Sigma, Taufkirchen
o-Aminophenol Sigma, Taufkirchen
Pyridoxalphosphat (PLP) Sigma, Taufkirchen
2. Materialien
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2.4. Enzyme
Anti-HIS-monoklonaler Antikörper Qiagen, Hilden
Anti-Mouse IgG monoklonaler Antikörper Sigma, Taufkirchen
Catalase Sigma, Taufkirchen
DNase I Sigma, Taufkirchen
L-Aminosäureoxidase Sigma, Taufkirchen
Lysozym Biomol, Hamburg
Proteinase K Promega, Mannheim
Restriktionsendonukleasen Invitrogen, Karlsruhe
und Fermentas, St. Leon Rot
Ribonuclease A NEB, Ipswich
T4-DNA-Ligase NEB, Ipswich
Taq-DNA-Polymerase NEB, Ipswich
und Fermentas, St. Leon Rot
Vent-DNA-Polymerase NEB, Ipswich
2.5. Kits
CloneJET™ PCR Cloning Kit Fermentas, St. Leon Rot
Jetsorb-Kit Genomed, Löhne
Qiaprep Spin Mini Prep Kit Qiagen, Hilden
TOPO-TA-Cloning Kit Invitrogen, Karlsruhe
Wizard Genomic Purification Kit Promega, Madison
2.6. Mikroorganismen
Escherichia coli DH5 Hanahan, 1983
Escherichia coli M15 Qiagen, Hilden
Streptomyces antibioticus DSM 41481 DSMZ, Braunschweig
Streptomyces chrysomallus ATCC 11523 ATCC (Maryland, USA)
Streptomyces chrysomallus Sc1 Sammlung, AK Keller
Streptomyces chrysomallus X2 Sammlung, AK Keller
Streptomyces chrysomallus white Sammlung, AK Keller
Streptomyces parvulus DSM 40048 DSMZ, Braunschweig
Streptomyces coelicolor A3(2) John Innes Collection
2.7. Vektoren und Plasmide
pQE30 Qiagen, Hilden
pQE50 Qiagen, Hilden
pTZ18U Mead et al., 1988
pCR4-TOPO Invitrogen, Karlsruhe
2. Materialien
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pSP72 Promega, Madison
2.8. PCR-Primer
Alle PCR-Primer, die in dieser Arbeit zur PCR-Amplifikation von Genfragmenten verwendet wurden, wurden von der Firma TIB-MOLBIOL (Berlin) bezogen.
Name Primer Kommentar
F_acmL R_acmL
Klonierung von acmL aus S. chrysomallus in pQE30 5’-GAGGTACCATGCCTCACGCGTCCCCGCTCA-3’ 5’-GCTAAGCTTTCACTTGACCGCGCTGAT CAC-3’ KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle F_acmI R_acmI
Klonierung von acmI aus S. chrysomallus in pQE30 5’-GGAGGTACCATGGCAGACGTCCGCCCCTTC-3’ 5’-CCGGGAGCGGAGAAGCTTTCACTTGACCGC-3’ KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle F_acmL R_acmL
Klonierung von acmL aus S. antibioticus in pJET1.2 5’-GAGGTACCATGCCTCACGCGTCCCCGCTCA-3’ 5’-GCTAAGCTTTCACTTGACCGCGCTGAT CAC-3’ KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle Cyp_Rew Ferro_1
Klonierung von acmM-N in pJET1.2 5´-TTCACCCAGGAATTCGACGGG-3´ 5´-TGCACGAGCTGATGCGCTG-3´ Rew_Hyg
acmH_rev
Klonierung der acmH-Hygromycin Seite in pJET1.2 5´-TGCACTAAGCACATAATTGCTC-3´
5´-GGAAGCTTGAGCACAGGCCGGG-3 HindIII-Schnittstelle
RHyg F_acmK2
Klonierung der acmK-Hygromycin Seite in pJET1.2 5’-CGTCGGTGAAGTCGACGATCCC-3´
5´-TGGTGTGCGGGCAGGTGGA-3´ kynA_F
kynB_R
Klonierung von kynU in pJET1.2 5’-CCCAGTTCAACTCCTACCG-3´ 5’-GTAGAAGTCGACGACCTGGT-3´
Tabelle 2: Zusammenfassung der benutzten Primer.
2.9. Puffer
2.9.1.
Proteinpräparationspuffer
Die Puffer enthielten 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin. Vor der Verwendung wurde der jeweilige Puffer am Wasserstrahlvakuum für 30 min entgast. Das DTE wurde nach dem Entgasen zugegeben.
2. Materialien
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Puffer Glycerin % (w/v)
Tris-HCl [mM] KPO4 [mM] Pipes-Tris [mM] EDTA [mM] DTE [mM] pH-Wert
A 15 100 - - 1 4 8.0 B 10 100 - - 1 4 8.0 C 10 - 50 - 1 4 6,8 D 10 100 - - 1 4 7.7 E 5 - - 50 - 4 6.8 F 5 20 - - - 4 7.7
Tabelle 3: Zusammensetzung der Proteinpräparations-Puffer.
2.9.2.
Ni-NTA Affinitätschromatographiepuffer
Die Puffer enthielten 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin.
Puffer (nach Qiagen) NaH2PO4 [mM] NaCl [mM] Imidazol [mM] pH-Wert
Ni-NTA-Lysepuffer 50 300 10 8.0
Ni-NTA-Waschpuffer 50 300 20 8.0
Ni-NTA-Elutionspuffer 50 300 250 8.0
Tabelle 4: Zusammensetzung der Ni-NTA Affinitätschormatographie-Puffer.
2.10. Lösungen
BCIP-Lösung 3 mg in 300 μl 100 % Dimethylformamid
Blockier-Lösung 3 % BSA in TBS
Bradford-Reagenz 100 mg Coomassie Brilliant Blue G 250, 100 ml 85 %
(v/v)Phosphorsäure, 50 ml Ethanol auf 1000 ml mit dest. Wasser
Bromphenolblau-Lösung 40 % (w/v) Saccharose und 0,25 % (w/v) Bromphenolblau
Coomassie-Färbelösung 1 g Coomassie Brilliant Blue R 250, 500 ml Methanol, 100 ml
Essigsäure und 400 ml dest. Wasser
DNA-Probenpuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau, 0,25 % (w/v) Xylencyanol-FF,
50 % (w/v) Saccharose
Entfärber für Proteingele 10 % (v/v) Essigsäure und 20 % (v/v) Methanol in Wasser
Mix I 50 mM Kaliumphosphat pH 6.8, 12 μM Pyridoxalphosphat,
2 mM Kynurenin
Mix II 25 mM Kaliumphosphat pH 7.5, 8 μM Pyridoxalphosphat,
2 mM Hydroxykynurenin
NBT-Lösung 6,75 mg in 135 μl 70 % Dimethylformamid
NBT/BCIP-Lösung 300 μl BICP-Lösung und 135 μl NBT-Lösung in 15 ml
Substratpuffer
2. Materialien
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SDS-PAGE-Probenpuffer 33,3 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 3,3 % (w/v) SDS, 13,3 % (w/v) Saccharose und 0,083 % (w/v) Bromphenolblau
Semi-Dry-Blotting-Puffer 25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM Glycin und 20 % (v/v) Methanol
Substratpuffer 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl und 5 mM MgCl2
TBE 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA
TBS 50 mM TrisHCl pH 7.4 und 200 mM NaCl
TBS-Tween TBS mit 0,1 % (w/v) Tween 80
TE 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 TES TE / 10% Saccharose, pH 8.0
2.11. Medien
LB-Medium Trypton 10 g Hefeextrakt 5 g NaCl 10 g H2O ad 1 lDer pH-Wert des Mediums wurde bei pH 7.5 mit NaOH eingestellt. LB-Medien mit Selektionsmarkern enthielten Ampicillin (100 μg ml-1 f.c.) bzw. Kanamycin (25 μg ml-1 f.c.). Zur Herstellung von Agarplatten wurde dem Medium vor dem autoklavieren 1,5 % Agar zugesetzt.
HMM-Medium (Hase und Keller, 1988)
Hefeextrakt 5 g
Malzextrakt 5 g
Maltose 5 g
H2O ad 1 l
Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 6.8 mit NaOH eingestellt. Als Kohlenstoffquelle wurden dem Medium teilweise an Stelle der Maltose im gleichen Mengenverhältnis Glukose oder Galaktose zugegeben. Zur Herstellung von Agarplatten wurden dem Medium vor dem autoklavieren 1,5 % Agar zugesetzt. GYM-Medium Glukose 4 g Hefeextrakt 4 g Malzextrakt 10 g CaCO3 2 g Agar 12 g H2O ad 1 l
