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2. Materialien

2.1. Chemikalien

Agar (Agar No. 3) Oxoid, Wesel

Agarose (peqGOLD Universal Agarose) peqLab, Erlangen Ammoniumsulfat (für biol. Zwecke) Merck, Darmstadt

Ampicillin Sigma, Taufkirchen

Bacto-Trypton Roth, Karlsruhe

Benzamidin Sigma, Taufkirchen

Borsäure Merck, Darmstadt

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

BSA Sigma, Taufkirchen

Coomassie Brilliant Blue (G250, R250) Serva, Heidelberg

DTE Biomol, Hamburg

EDTA Biomol, Hamburg

Ethidiumbromid Sigma, Taufkirchen

Glycerin Roth, Karlsruhe

Hefeextrakt Roth, Karlsruhe

und BD Diagnostics, Sparks

His-Tag-Proteinmarker Qiagen, Hilden

Imidazol Fluka, Buchs

IPTG peqLab, Erlangen

Kanamycin Sigma, Taufkirchen

Lambda-DNA Sigma, Taufkirchen

Malzextrakt Merck, Darmstadt

N´,N´-Methylen-bis-Acrylamid Fluka, Buchs

NZ-Amin Sigma, Taufkirchen

Oligonukleotide TibMolbiol, Berlin

PageRuler™ Prestained Protein Ladder Fermentas. St. Leon Rot PageRuler™ Unstained Protein Ladder Fermentas. St. Leon Rot

PMSF Sigma, Taufkirchen

Quicksafe A-Szintillationsflüssigkeit Zinsser Analytic, Frankfurt

Rindfleischextrakt Roth, Karlsruhe

Roti®-Mark Standard Roth, Karlsruhe

Rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe

Serva DNA Stain G Serva, Heidelberg

Tris Roth, Karlsruhe

Trypton BD Diagnostics, Sparks

β-Mercaptoethanol Sigma, Taufkirchen

2.2. Radiochemikalien

[14C-methyl]-S-Adenosyl-L-methionin1, 60 mCi·mol-1

2. Materialien

32

[3H-methyl]-S-Adenosyl-L-methionin2, 60 Ci·mmol-1 [14C-methyl]-L-Methionin1, 55 mCi·mmol-1

U-[14C]-Glycin1, 105 mCi·mmol-1

U-[14C]-L-Glutaminsäure1, 238 mCi·mmol-1 U-[14C]-Prolin1, 252 mCi·mmol-1

U-[14C]-Threonin1, 192 mCi·mmol-1 U-[14C]-Tyrosin1, 450 mCi·mmol-1 U-[14C]-Valin1, 260 mCi·mmol-1 L-[5-3H]-Tryptophan1, 17,9 Ci·mmol-1

Hersteller: 1Amersham Biosciences, Freiburg, 2BIOTREND, Köln, Perkin Elmer, Massachusetts

2.3. Reagentien

3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsäure Sigma, Taufkirchen

3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (DOPA) Sigma, Taufkirchen 3,4-Dihydroxyzimtsäure (Kaffeesäure) Sigma, Taufkirchen

3-Hydroxyacetophenone Aldrich, Steinheim

3-Hydroxyanthranilsäure Merck, Darmstadt

3-Hydroxybenzoesäure Fluka, Buchs

3-Hydroxy-DL-kynurenin Sigma, Taufkirchen

4-Hydroxy-L-phenylglycin Aldrich, Steinheim

Actinomycin D Applichem, Darmstadt

Anthranilsäure Acros, Nidderau

Dopamin Sigma, Taufkirchen

Formyl-L-kynurenin Calbiochem-Behring, La Jolla

H-Tyr-(Me)-OH Bachem, Bubendorf

L-Glycin Sigma, Taufkirchen

L-Isoleucin Sigma, Taufkirchen

L-Kynurenin Sigma, Taufkirchen

L-Leucin Sigma, Taufkirchen

L-Methionin Sigma, Taufkirchen

L-Phenylalanin Sigma, Taufkirchen

L-Prolin Sigma, Taufkirchen

L-Threonin Sigma, Taufkirchen

L-Tryptophan Sigma, Taufkirchen

L-Tyrosin Sigma, Taufkirchen

D-Tyrosin Aldrich, Steinheim

DL-meta-Tyrosin MP Biomedicals, Solon

L-Homotyrosin Iris Biotech, Marktredwitz

D-Homotyrosin Iris Biotech, Marktredwitz

L-Valin Sigma, Taufkirchen

o-Aminophenol Sigma, Taufkirchen

Pyridoxalphosphat (PLP) Sigma, Taufkirchen

S-Adenosyl-L-methionin Sigma, Taufkirchen

2. Materialien

33

2.4. Enzyme

Anti-HIS-monoklonaler Antikörper Qiagen, Hilden

Anti-Mouse IgG monoklonaler Antikörper Sigma, Taufkirchen

Catalase Sigma, Taufkirchen

DNase I Sigma, Taufkirchen

L-Aminosäureoxidase Sigma, Taufkirchen

Lysozym Biomol, Hamburg

Proteinase K Promega, Mannheim

Restriktionsendonukleasen Invitrogen, Karlsruhe

und Fermentas, St. Leon Rot

Ribonuclease A NEB, Ipswich

T4-DNA-Ligase NEB, Ipswich

Taq-DNA-Polymerase NEB, Ipswich

und Fermentas, St. Leon Rot

Vent-DNA-Polymerase NEB, Ipswich

2.5. Kits

CloneJET™ PCR Cloning Kit Fermentas, St. Leon Rot

Jetsorb-Kit Genomed, Löhne

Qiaprep Spin Mini Prep Kit Qiagen, Hilden

TOPO-TA-Cloning Kit Invitrogen, Karlsruhe

Wizard Genomic Purification Kit Promega, Madison

2.6. Mikroorganismen

Escherichia coli DH5 Hanahan, 1983

Escherichia coli M15 Qiagen, Hilden

Streptomyces antibioticus DSM 41481 DSMZ, Braunschweig Streptomyces chrysomallus ATCC 11523 ATCC (Maryland, USA)

Streptomyces chrysomallus Sc1 Sammlung, AK Keller

Streptomyces chrysomallus X2 Sammlung, AK Keller

Streptomyces chrysomallus white Sammlung, AK Keller

Streptomyces parvulus DSM 40048 DSMZ, Braunschweig

Streptomyces coelicolor A3(2) John Innes Collection

2.7. Vektoren und Plasmide

pQE30 Qiagen, Hilden

pQE50 Qiagen, Hilden

pTZ18U Mead et al., 1988

pCR4-TOPO Invitrogen, Karlsruhe

pJET1.2/blunt Fermentas, St. Leon Rot

2. Materialien

34

pSP72 Promega, Madison

2.8. PCR-Primer

Alle PCR-Primer, die in dieser Arbeit zur PCR-Amplifikation von Genfragmenten verwendet wurden, wurden von der Firma TIB-MOLBIOL (Berlin) bezogen.

Name Primer Kommentar

F_acmL R_acmL

Klonierung von acmL aus S. chrysomallus in pQE30 5’-GAGGTACCATGCCTCACGCGTCCCCGCTCA-3’

5’-GCTAAGCTTTCACTTGACCGCGCTGAT CAC-3’

KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle

F_acmI R_acmI

Klonierung von acmI aus S. chrysomallus in pQE30 5’-GGAGGTACCATGGCAGACGTCCGCCCCTTC-3’

5’-CCGGGAGCGGAGAAGCTTTCACTTGACCGC-3’

KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle

F_acmL R_acmL

Klonierung von acmL aus S. antibioticus in pJET1.2 5’-GAGGTACCATGCCTCACGCGTCCCCGCTCA-3’

5’-GCTAAGCTTTCACTTGACCGCGCTGAT CAC-3’

KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle

Cyp_Rew Ferro_1

Klonierung von acmM-N in pJET1.2 5´-TTCACCCAGGAATTCGACGGG-3´

5´-TGCACGAGCTGATGCGCTG-3´

Rew_Hyg acmH_rev

Klonierung der acmH-Hygromycin Seite in pJET1.2 5´-TGCACTAAGCACATAATTGCTC-3´

5´-GGAAGCTTGAGCACAGGCCGGG-3 HindIII-Schnittstelle

RHyg F_acmK2

Klonierung der acmK-Hygromycin Seite in pJET1.2 5’-CGTCGGTGAAGTCGACGATCCC-3´

5´-TGGTGTGCGGGCAGGTGGA-3´

kynA_F kynB_R

Klonierung von kynU in pJET1.2 5’-CCCAGTTCAACTCCTACCG-3´

5’-GTAGAAGTCGACGACCTGGT-3´

Tabelle 2: Zusammenfassung der benutzten Primer.

2.9. Puffer

2.9.1. Proteinpräparationspuffer

Die Puffer enthielten 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin. Vor der Verwendung wurde der jeweilige Puffer am Wasserstrahlvakuum für 30 min entgast. Das DTE wurde nach dem Entgasen zugegeben.

2. Materialien

35 Puffer Glycerin

% (w/v)

Tris-HCl [mM] KPO4 [mM] Pipes-Tris [mM] EDTA [mM] DTE [mM] pH-Wert

A 15 100 - - 1 4 8.0

B 10 100 - - 1 4 8.0

C 10 - 50 - 1 4 6,8

D 10 100 - - 1 4 7.7

E 5 - - 50 - 4 6.8

F 5 20 - - - 4 7.7

Tabelle 3: Zusammensetzung der Proteinpräparations-Puffer.

2.9.2. Ni-NTA Affinitätschromatographiepuffer

Die Puffer enthielten 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin.

Puffer (nach Qiagen) NaH2PO4 [mM] NaCl [mM] Imidazol [mM] pH-Wert

Ni-NTA-Lysepuffer 50 300 10 8.0

Ni-NTA-Waschpuffer 50 300 20 8.0

Ni-NTA-Elutionspuffer 50 300 250 8.0

Tabelle 4: Zusammensetzung der Ni-NTA Affinitätschormatographie-Puffer.

2.10. Lösungen

BCIP-Lösung 3 mg in 300 μl 100 % Dimethylformamid

Blockier-Lösung 3 % BSA in TBS

Bradford-Reagenz 100 mg Coomassie Brilliant Blue G 250, 100 ml 85 % (v/v)Phosphorsäure, 50 ml Ethanol auf 1000 ml mit dest.

Wasser

Bromphenolblau-Lösung 40 % (w/v) Saccharose und 0,25 % (w/v) Bromphenolblau Coomassie-Färbelösung 1 g Coomassie Brilliant Blue R 250, 500 ml Methanol, 100 ml

Essigsäure und 400 ml dest. Wasser

DNA-Probenpuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau, 0,25 % (w/v) Xylencyanol-FF, 50 % (w/v) Saccharose

Entfärber für Proteingele 10 % (v/v) Essigsäure und 20 % (v/v) Methanol in Wasser Mix I 50 mM Kaliumphosphat pH 6.8, 12 μM Pyridoxalphosphat,

2 mM Kynurenin

Mix II 25 mM Kaliumphosphat pH 7.5, 8 μM Pyridoxalphosphat, 2 mM Hydroxykynurenin

NBT-Lösung 6,75 mg in 135 μl 70 % Dimethylformamid

NBT/BCIP-Lösung 300 μl BICP-Lösung und 135 μl NBT-Lösung in 15 ml Substratpuffer

SDS-PAGE-Laufpuffer 50 mM Tris, 0,38 M Glycin und 0,2 % (w/v) SDS

2. Materialien

36

SDS-PAGE-Probenpuffer 33,3 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 3,3 % (w/v) SDS, 13,3 % (w/v) Saccharose und 0,083 % (w/v) Bromphenolblau

Semi-Dry-Blotting-Puffer 25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM Glycin und 20 % (v/v) Methanol

Substratpuffer 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl und 5 mM MgCl2

TBE 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA

TBS 50 mM TrisHCl pH 7.4 und 200 mM NaCl

TBS-Tween TBS mit 0,1 % (w/v) Tween 80

TE 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8.0

TES TE / 10% Saccharose, pH 8.0

2.11. Medien

LB-Medium

Trypton 10 g

Hefeextrakt 5 g

NaCl 10 g

H2O ad 1 l

Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 7.5 mit NaOH eingestellt. LB-Medien mit Selektionsmarkern enthielten Ampicillin (100 μg ml-1 f.c.) bzw. Kanamycin (25 μg ml-1 f.c.). Zur Herstellung von Agarplatten wurde dem Medium vor dem autoklavieren 1,5 % Agar zugesetzt.

HMM-Medium (Hase und Keller, 1988)

Hefeextrakt 5 g

Malzextrakt 5 g

Maltose 5 g

H2O ad 1 l

Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 6.8 mit NaOH eingestellt. Als Kohlenstoffquelle wurden dem Medium teilweise an Stelle der Maltose im gleichen Mengenverhältnis Glukose oder Galaktose zugegeben. Zur Herstellung von Agarplatten wurden dem Medium vor dem autoklavieren 1,5 % Agar zugesetzt.

GYM-Medium

Glukose 4 g

Hefeextrakt 4 g

Malzextrakt 10 g

CaCO3 2 g

Agar 12 g

H2O ad 1 l

2. Materialien

37 Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 7.2 mit NaOH eingestellt. Bei Flüssigmedium wurde das CaCO3 nicht zugegeben.

Minimal Medium (MM) (Hopwood, 1967)

L-Asparagin 0,5 g

K2HPO4 0,5 g

MgSO4x7H2O 0,2 g FeSO4x7H2O 0,01 g

Agar 10 g

H2O ad 1 l

Der pH-Wert wurde bei 7.0-7.2 mit NaOH eingestellt. Als Kohlenstoffquelle wurden dem Medium nach dem autoklavieren 1 % Glukose, Maltose, Fruktose oder Galaktose zugegeben.

GMM Medium (Katz et al., 1958)

K2HPO4 1 g

NaGlutamat 2,3 g

CaCl2 25 mg

FeSO4x7H2O 25 mg

MgSO4x7H2O 25 mg

ZnCl2 25 mg

H2O ad 1 l

Als Kohlenstoffquelle wurden dem Medium nach dem autoklavieren 1 % Glukose, Maltose, Fructose oder Galaktose zugegeben.

NZ-Amin Medium (Katz und Goss, 1959)

NZ-Amin 25 g

Rindfleischextrakt 10 g

H2O ad 1 l

Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 7.0 mit NaOH eingestellt.

2.12. Chromatographiematerialien

Kieselgel 60 F254 Merck, Darmstadt

CHIRALPLATE® Macherey-Nagel, Düren

Ni-NTA-Agarose-Resin Qiagen, Hilden

PD-10 Säulen (Sephadex-G25) Amersham Biosciences, Freiburg

Q-Sepharose Fast Flow Amersham Biosciences, Freiburg

Resource Q (6 ml) Amersham Biosciences, Freiburg

SuperdexTM 75 Amersham Biosciences, Freiburg

SuperdexTM 200 Amersham Biosciences, Freiburg

2. Materialien

38

MonoQ (HR/5R) Amersham Biosciences, Freiburg

Dowex 50WX8-100 (H+-Form) Sigma, Taufkirchen

Eurospher 100 C18 Knauer, Berlin

EnCaPharm 100 C18 Molnar Institute, Berlin

Centricons Millipore, Billerica, USA

2.13. Laufmittel

Laufmittel 1 n-Butanol-Essigsäure-H2O (4:1:1; v/v/v)

Laufmittel 2 Hexan-Essigsäureethylester-Essigsäure (8:2,5:0,5; v/v/v) Laufmittel 3 Chloroform-Essigsäure-H2O (9:1; v/v)

Laufmittel 4 Essigsäureethylester-Methanol-H2O-DMF (100:3:3:1; v/v/v/v) Laufmittel 5 Essigsäureethylester-Methanol-H2O-DMF (100:5:5:2; v/v/v/v) Laufmittel 6 i-Propanol-Dibutylether-Essigsäure-H2O (4:3:3:2; v/v/v/v) Laufmittel 7 Methanol-H2O (1:7; v/v)

Laufmittel 8 Aceton-Methanol-H2O (4:2:2; v/v/v)

2.14. Weitere Materialien

Nylon Membran 0,45 μm Whatman, England

Protran Nitrocellulose Transfer Membran Whatman, England

X-Ray Film Medical Konica, Japan

2.15. Geräte

E.A.S.Y.-plus Imaging System Herolab, Wiesloch

French-Press-Zelle AMINCO, Silver Spring (USA)

GENios microplate reader Tecan, Crailsheim (Austria)

Infinite M200 microplate reader Tecan, Crailsheim (Austria)

FPLC-System Amersham Biosciences, Freiburg

HPLC Pharmacia Smart-System Amersham Biosciences, Freiburg

HPLC Waters System Waters, Eschborn

Kühlzentrifuge Minifuge II Heraeus Christ, Hanau

Kühlzentrifuge RC2-B Sorvall, Bad Homburg

Microelisa Auto Reader Dynatech, Denkendorf

MS Biomax-Film/LE-Transscreen Kodak, Rochester (USA)

SDS PAGE-System Hoefer, San Francisco

RITA-STAR Isotopenmessgerät Raytest, Straubenhardt

Rotoren: GSA und SS34 DuPont, Bad Homburg

Semi-Dry-Blotter (2117-250 Novablot) Amersham Biosciences, Freiburg Schüttelinkubator New Brunswick G25 New Brunswick, (USA)

Szintillationszähler (Wallac 1409) Wallac, Freiburg

Tischzentrifuge Eppendorf 5436 Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge Hermle Z 233 MK-2 Hermle, Wehingen

2. Materialien

39 UV/VIS Spektralphotometer 551S Perkin Elmer, Waltham (USA)

Thermocycler (UNO-Thermoblock) Biometra, Göttingen

2.16. Software

Für die Analyse der Sequenzen aus dem Actinomycin Biosynthese Gencluster wurden verschiedene Programme verwendet. Multiple Alignments von Aminosäure- und DNA-Sequenzen wurden mit ClustalX2 und ClustalW2 (Larkin et al., 2007; Goujon et al., 2010) berechnet. Anzeige und gegebenenfalls manuelle Nachbearbeitung der so erhaltenen Alignments erfolgte mit GeneDoc (Nicholas et al., 1997). Sequenzierungs-Chromatogramme wurden mit Chromas Lite 2.01 (Technelysium Pty Ltd., www.technelysium.com.au) ausgewertet. Für das Zeichnen der verschiedenen Plasmide wurde das Programm pDraw32 (http://www.acaclone.com/) verwendet. Für die Protein-Struktur- und Funktion-Vorhersage wurden die Programme Phyre (Kelley und Sternberg, 2009) und I-TASSER (Zhang, 2008) verwendet.

Außerdem wurden verschiedene Software Programme (http://molbiol-tools.ca/) online bezogen:

Datenbank Referenzen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (BLAST und PubMed) Multiple Alignements: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/

Protein Parameter: http://www.expasy.ch/ (Translate, ProtParam, Compute pI/MW) Phylogenetische Analysen: http://www.phylogeny.fr/

DotBlot Analyse: http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/dotmatcher

Promoter Analyse: http://linux1.softberry.com/berry.phtml (FGENES-B, BPROM, FindTerm)

Die Gensequenzen des Actinomycin Biosynthese Genclusters sind hinterlegt unter der Genbank Acc.

Nr. HM038106. Die Kynureninase kynU Sequenz ist hinterlegt unter der Genbank Acc. Nr. HM038107.

2. Materialien

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