31
2. Materialien
2.1. Chemikalien
Agar (Agar No. 3) Oxoid, Wesel
Agarose (peqGOLD Universal Agarose) peqLab, Erlangen Ammoniumsulfat (für biol. Zwecke) Merck, Darmstadt
Ampicillin Sigma, Taufkirchen
Bacto-Trypton Roth, Karlsruhe
Benzamidin Sigma, Taufkirchen
Borsäure Merck, Darmstadt
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
BSA Sigma, Taufkirchen
Coomassie Brilliant Blue (G250, R250) Serva, Heidelberg
DTE Biomol, Hamburg
EDTA Biomol, Hamburg
Ethidiumbromid Sigma, Taufkirchen
Glycerin Roth, Karlsruhe
Hefeextrakt Roth, Karlsruhe
und BD Diagnostics, Sparks
His-Tag-Proteinmarker Qiagen, Hilden
Imidazol Fluka, Buchs
IPTG peqLab, Erlangen
Kanamycin Sigma, Taufkirchen
Lambda-DNA Sigma, Taufkirchen
Malzextrakt Merck, Darmstadt
N´,N´-Methylen-bis-Acrylamid Fluka, Buchs
NZ-Amin Sigma, Taufkirchen
Oligonukleotide TibMolbiol, Berlin
PageRuler™ Prestained Protein Ladder Fermentas. St. Leon Rot PageRuler™ Unstained Protein Ladder Fermentas. St. Leon Rot
PMSF Sigma, Taufkirchen
Quicksafe A-Szintillationsflüssigkeit Zinsser Analytic, Frankfurt
Rindfleischextrakt Roth, Karlsruhe
Roti®-Mark Standard Roth, Karlsruhe
Rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe
Serva DNA Stain G Serva, Heidelberg
Tris Roth, Karlsruhe
Trypton BD Diagnostics, Sparks
β-Mercaptoethanol Sigma, Taufkirchen
2.2. Radiochemikalien
[14C-methyl]-S-Adenosyl-L-methionin1, 60 mCi·mol-1
2. Materialien
32
[3H-methyl]-S-Adenosyl-L-methionin2, 60 Ci·mmol-1 [14C-methyl]-L-Methionin1, 55 mCi·mmol-1
U-[14C]-Glycin1, 105 mCi·mmol-1
U-[14C]-L-Glutaminsäure1, 238 mCi·mmol-1 U-[14C]-Prolin1, 252 mCi·mmol-1
U-[14C]-Threonin1, 192 mCi·mmol-1 U-[14C]-Tyrosin1, 450 mCi·mmol-1 U-[14C]-Valin1, 260 mCi·mmol-1 L-[5-3H]-Tryptophan1, 17,9 Ci·mmol-1
Hersteller: 1Amersham Biosciences, Freiburg, 2BIOTREND, Köln, Perkin Elmer, Massachusetts
2.3. Reagentien
3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsäure Sigma, Taufkirchen
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (DOPA) Sigma, Taufkirchen 3,4-Dihydroxyzimtsäure (Kaffeesäure) Sigma, Taufkirchen
3-Hydroxyacetophenone Aldrich, Steinheim
3-Hydroxyanthranilsäure Merck, Darmstadt
3-Hydroxybenzoesäure Fluka, Buchs
3-Hydroxy-DL-kynurenin Sigma, Taufkirchen
4-Hydroxy-L-phenylglycin Aldrich, Steinheim
Actinomycin D Applichem, Darmstadt
Anthranilsäure Acros, Nidderau
Dopamin Sigma, Taufkirchen
Formyl-L-kynurenin Calbiochem-Behring, La Jolla
H-Tyr-(Me)-OH Bachem, Bubendorf
L-Glycin Sigma, Taufkirchen
L-Isoleucin Sigma, Taufkirchen
L-Kynurenin Sigma, Taufkirchen
L-Leucin Sigma, Taufkirchen
L-Methionin Sigma, Taufkirchen
L-Phenylalanin Sigma, Taufkirchen
L-Prolin Sigma, Taufkirchen
L-Threonin Sigma, Taufkirchen
L-Tryptophan Sigma, Taufkirchen
L-Tyrosin Sigma, Taufkirchen
D-Tyrosin Aldrich, Steinheim
DL-meta-Tyrosin MP Biomedicals, Solon
L-Homotyrosin Iris Biotech, Marktredwitz
D-Homotyrosin Iris Biotech, Marktredwitz
L-Valin Sigma, Taufkirchen
o-Aminophenol Sigma, Taufkirchen
Pyridoxalphosphat (PLP) Sigma, Taufkirchen
S-Adenosyl-L-methionin Sigma, Taufkirchen
2. Materialien
33
2.4. Enzyme
Anti-HIS-monoklonaler Antikörper Qiagen, Hilden
Anti-Mouse IgG monoklonaler Antikörper Sigma, Taufkirchen
Catalase Sigma, Taufkirchen
DNase I Sigma, Taufkirchen
L-Aminosäureoxidase Sigma, Taufkirchen
Lysozym Biomol, Hamburg
Proteinase K Promega, Mannheim
Restriktionsendonukleasen Invitrogen, Karlsruhe
und Fermentas, St. Leon Rot
Ribonuclease A NEB, Ipswich
T4-DNA-Ligase NEB, Ipswich
Taq-DNA-Polymerase NEB, Ipswich
und Fermentas, St. Leon Rot
Vent-DNA-Polymerase NEB, Ipswich
2.5. Kits
CloneJET™ PCR Cloning Kit Fermentas, St. Leon Rot
Jetsorb-Kit Genomed, Löhne
Qiaprep Spin Mini Prep Kit Qiagen, Hilden
TOPO-TA-Cloning Kit Invitrogen, Karlsruhe
Wizard Genomic Purification Kit Promega, Madison
2.6. Mikroorganismen
Escherichia coli DH5 Hanahan, 1983
Escherichia coli M15 Qiagen, Hilden
Streptomyces antibioticus DSM 41481 DSMZ, Braunschweig Streptomyces chrysomallus ATCC 11523 ATCC (Maryland, USA)
Streptomyces chrysomallus Sc1 Sammlung, AK Keller
Streptomyces chrysomallus X2 Sammlung, AK Keller
Streptomyces chrysomallus white Sammlung, AK Keller
Streptomyces parvulus DSM 40048 DSMZ, Braunschweig
Streptomyces coelicolor A3(2) John Innes Collection
2.7. Vektoren und Plasmide
pQE30 Qiagen, Hilden
pQE50 Qiagen, Hilden
pTZ18U Mead et al., 1988
pCR4-TOPO Invitrogen, Karlsruhe
pJET1.2/blunt Fermentas, St. Leon Rot
2. Materialien
34
pSP72 Promega, Madison
2.8. PCR-Primer
Alle PCR-Primer, die in dieser Arbeit zur PCR-Amplifikation von Genfragmenten verwendet wurden, wurden von der Firma TIB-MOLBIOL (Berlin) bezogen.
Name Primer Kommentar
F_acmL R_acmL
Klonierung von acmL aus S. chrysomallus in pQE30 5’-GAGGTACCATGCCTCACGCGTCCCCGCTCA-3’
5’-GCTAAGCTTTCACTTGACCGCGCTGAT CAC-3’
KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle
F_acmI R_acmI
Klonierung von acmI aus S. chrysomallus in pQE30 5’-GGAGGTACCATGGCAGACGTCCGCCCCTTC-3’
5’-CCGGGAGCGGAGAAGCTTTCACTTGACCGC-3’
KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle
F_acmL R_acmL
Klonierung von acmL aus S. antibioticus in pJET1.2 5’-GAGGTACCATGCCTCACGCGTCCCCGCTCA-3’
5’-GCTAAGCTTTCACTTGACCGCGCTGAT CAC-3’
KpnI-Schnittstelle HindIII-Schnittstelle
Cyp_Rew Ferro_1
Klonierung von acmM-N in pJET1.2 5´-TTCACCCAGGAATTCGACGGG-3´
5´-TGCACGAGCTGATGCGCTG-3´
Rew_Hyg acmH_rev
Klonierung der acmH-Hygromycin Seite in pJET1.2 5´-TGCACTAAGCACATAATTGCTC-3´
5´-GGAAGCTTGAGCACAGGCCGGG-3 HindIII-Schnittstelle
RHyg F_acmK2
Klonierung der acmK-Hygromycin Seite in pJET1.2 5’-CGTCGGTGAAGTCGACGATCCC-3´
5´-TGGTGTGCGGGCAGGTGGA-3´
kynA_F kynB_R
Klonierung von kynU in pJET1.2 5’-CCCAGTTCAACTCCTACCG-3´
5’-GTAGAAGTCGACGACCTGGT-3´
Tabelle 2: Zusammenfassung der benutzten Primer.
2.9. Puffer
2.9.1. Proteinpräparationspuffer
Die Puffer enthielten 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin. Vor der Verwendung wurde der jeweilige Puffer am Wasserstrahlvakuum für 30 min entgast. Das DTE wurde nach dem Entgasen zugegeben.
2. Materialien
35 Puffer Glycerin
% (w/v)
Tris-HCl [mM] KPO4 [mM] Pipes-Tris [mM] EDTA [mM] DTE [mM] pH-Wert
A 15 100 - - 1 4 8.0
B 10 100 - - 1 4 8.0
C 10 - 50 - 1 4 6,8
D 10 100 - - 1 4 7.7
E 5 - - 50 - 4 6.8
F 5 20 - - - 4 7.7
Tabelle 3: Zusammensetzung der Proteinpräparations-Puffer.
2.9.2. Ni-NTA Affinitätschromatographiepuffer
Die Puffer enthielten 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin.
Puffer (nach Qiagen) NaH2PO4 [mM] NaCl [mM] Imidazol [mM] pH-Wert
Ni-NTA-Lysepuffer 50 300 10 8.0
Ni-NTA-Waschpuffer 50 300 20 8.0
Ni-NTA-Elutionspuffer 50 300 250 8.0
Tabelle 4: Zusammensetzung der Ni-NTA Affinitätschormatographie-Puffer.
2.10. Lösungen
BCIP-Lösung 3 mg in 300 μl 100 % Dimethylformamid
Blockier-Lösung 3 % BSA in TBS
Bradford-Reagenz 100 mg Coomassie Brilliant Blue G 250, 100 ml 85 % (v/v)Phosphorsäure, 50 ml Ethanol auf 1000 ml mit dest.
Wasser
Bromphenolblau-Lösung 40 % (w/v) Saccharose und 0,25 % (w/v) Bromphenolblau Coomassie-Färbelösung 1 g Coomassie Brilliant Blue R 250, 500 ml Methanol, 100 ml
Essigsäure und 400 ml dest. Wasser
DNA-Probenpuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau, 0,25 % (w/v) Xylencyanol-FF, 50 % (w/v) Saccharose
Entfärber für Proteingele 10 % (v/v) Essigsäure und 20 % (v/v) Methanol in Wasser Mix I 50 mM Kaliumphosphat pH 6.8, 12 μM Pyridoxalphosphat,
2 mM Kynurenin
Mix II 25 mM Kaliumphosphat pH 7.5, 8 μM Pyridoxalphosphat, 2 mM Hydroxykynurenin
NBT-Lösung 6,75 mg in 135 μl 70 % Dimethylformamid
NBT/BCIP-Lösung 300 μl BICP-Lösung und 135 μl NBT-Lösung in 15 ml Substratpuffer
SDS-PAGE-Laufpuffer 50 mM Tris, 0,38 M Glycin und 0,2 % (w/v) SDS
2. Materialien
36
SDS-PAGE-Probenpuffer 33,3 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 3,3 % (w/v) SDS, 13,3 % (w/v) Saccharose und 0,083 % (w/v) Bromphenolblau
Semi-Dry-Blotting-Puffer 25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM Glycin und 20 % (v/v) Methanol
Substratpuffer 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl und 5 mM MgCl2
TBE 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA
TBS 50 mM TrisHCl pH 7.4 und 200 mM NaCl
TBS-Tween TBS mit 0,1 % (w/v) Tween 80
TE 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8.0
TES TE / 10% Saccharose, pH 8.0
2.11. Medien
LB-Medium
Trypton 10 g
Hefeextrakt 5 g
NaCl 10 g
H2O ad 1 l
Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 7.5 mit NaOH eingestellt. LB-Medien mit Selektionsmarkern enthielten Ampicillin (100 μg ml-1 f.c.) bzw. Kanamycin (25 μg ml-1 f.c.). Zur Herstellung von Agarplatten wurde dem Medium vor dem autoklavieren 1,5 % Agar zugesetzt.
HMM-Medium (Hase und Keller, 1988)
Hefeextrakt 5 g
Malzextrakt 5 g
Maltose 5 g
H2O ad 1 l
Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 6.8 mit NaOH eingestellt. Als Kohlenstoffquelle wurden dem Medium teilweise an Stelle der Maltose im gleichen Mengenverhältnis Glukose oder Galaktose zugegeben. Zur Herstellung von Agarplatten wurden dem Medium vor dem autoklavieren 1,5 % Agar zugesetzt.
GYM-Medium
Glukose 4 g
Hefeextrakt 4 g
Malzextrakt 10 g
CaCO3 2 g
Agar 12 g
H2O ad 1 l
2. Materialien
37 Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 7.2 mit NaOH eingestellt. Bei Flüssigmedium wurde das CaCO3 nicht zugegeben.
Minimal Medium (MM) (Hopwood, 1967)
L-Asparagin 0,5 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4x7H2O 0,2 g FeSO4x7H2O 0,01 g
Agar 10 g
H2O ad 1 l
Der pH-Wert wurde bei 7.0-7.2 mit NaOH eingestellt. Als Kohlenstoffquelle wurden dem Medium nach dem autoklavieren 1 % Glukose, Maltose, Fruktose oder Galaktose zugegeben.
GMM Medium (Katz et al., 1958)
K2HPO4 1 g
NaGlutamat 2,3 g
CaCl2 25 mg
FeSO4x7H2O 25 mg
MgSO4x7H2O 25 mg
ZnCl2 25 mg
H2O ad 1 l
Als Kohlenstoffquelle wurden dem Medium nach dem autoklavieren 1 % Glukose, Maltose, Fructose oder Galaktose zugegeben.
NZ-Amin Medium (Katz und Goss, 1959)
NZ-Amin 25 g
Rindfleischextrakt 10 g
H2O ad 1 l
Der pH-Wert des Mediums wurde bei pH 7.0 mit NaOH eingestellt.
2.12. Chromatographiematerialien
Kieselgel 60 F254 Merck, Darmstadt
CHIRALPLATE® Macherey-Nagel, Düren
Ni-NTA-Agarose-Resin Qiagen, Hilden
PD-10 Säulen (Sephadex-G25) Amersham Biosciences, Freiburg
Q-Sepharose Fast Flow Amersham Biosciences, Freiburg
Resource Q (6 ml) Amersham Biosciences, Freiburg
SuperdexTM 75 Amersham Biosciences, Freiburg
SuperdexTM 200 Amersham Biosciences, Freiburg
2. Materialien
38
MonoQ (HR/5R) Amersham Biosciences, Freiburg
Dowex 50WX8-100 (H+-Form) Sigma, Taufkirchen
Eurospher 100 C18 Knauer, Berlin
EnCaPharm 100 C18 Molnar Institute, Berlin
Centricons Millipore, Billerica, USA
2.13. Laufmittel
Laufmittel 1 n-Butanol-Essigsäure-H2O (4:1:1; v/v/v)
Laufmittel 2 Hexan-Essigsäureethylester-Essigsäure (8:2,5:0,5; v/v/v) Laufmittel 3 Chloroform-Essigsäure-H2O (9:1; v/v)
Laufmittel 4 Essigsäureethylester-Methanol-H2O-DMF (100:3:3:1; v/v/v/v) Laufmittel 5 Essigsäureethylester-Methanol-H2O-DMF (100:5:5:2; v/v/v/v) Laufmittel 6 i-Propanol-Dibutylether-Essigsäure-H2O (4:3:3:2; v/v/v/v) Laufmittel 7 Methanol-H2O (1:7; v/v)
Laufmittel 8 Aceton-Methanol-H2O (4:2:2; v/v/v)
2.14. Weitere Materialien
Nylon Membran 0,45 μm Whatman, England
Protran Nitrocellulose Transfer Membran Whatman, England
X-Ray Film Medical Konica, Japan
2.15. Geräte
E.A.S.Y.-plus Imaging System Herolab, Wiesloch
French-Press-Zelle AMINCO, Silver Spring (USA)
GENios microplate reader Tecan, Crailsheim (Austria)
Infinite M200 microplate reader Tecan, Crailsheim (Austria)
FPLC-System Amersham Biosciences, Freiburg
HPLC Pharmacia Smart-System Amersham Biosciences, Freiburg
HPLC Waters System Waters, Eschborn
Kühlzentrifuge Minifuge II Heraeus Christ, Hanau
Kühlzentrifuge RC2-B Sorvall, Bad Homburg
Microelisa Auto Reader Dynatech, Denkendorf
MS Biomax-Film/LE-Transscreen Kodak, Rochester (USA)
SDS PAGE-System Hoefer, San Francisco
RITA-STAR Isotopenmessgerät Raytest, Straubenhardt
Rotoren: GSA und SS34 DuPont, Bad Homburg
Semi-Dry-Blotter (2117-250 Novablot) Amersham Biosciences, Freiburg Schüttelinkubator New Brunswick G25 New Brunswick, (USA)
Szintillationszähler (Wallac 1409) Wallac, Freiburg
Tischzentrifuge Eppendorf 5436 Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge Hermle Z 233 MK-2 Hermle, Wehingen
2. Materialien
39 UV/VIS Spektralphotometer 551S Perkin Elmer, Waltham (USA)
Thermocycler (UNO-Thermoblock) Biometra, Göttingen
2.16. Software
Für die Analyse der Sequenzen aus dem Actinomycin Biosynthese Gencluster wurden verschiedene Programme verwendet. Multiple Alignments von Aminosäure- und DNA-Sequenzen wurden mit ClustalX2 und ClustalW2 (Larkin et al., 2007; Goujon et al., 2010) berechnet. Anzeige und gegebenenfalls manuelle Nachbearbeitung der so erhaltenen Alignments erfolgte mit GeneDoc (Nicholas et al., 1997). Sequenzierungs-Chromatogramme wurden mit Chromas Lite 2.01 (Technelysium Pty Ltd., www.technelysium.com.au) ausgewertet. Für das Zeichnen der verschiedenen Plasmide wurde das Programm pDraw32 (http://www.acaclone.com/) verwendet. Für die Protein-Struktur- und Funktion-Vorhersage wurden die Programme Phyre (Kelley und Sternberg, 2009) und I-TASSER (Zhang, 2008) verwendet.
Außerdem wurden verschiedene Software Programme (http://molbiol-tools.ca/) online bezogen:
Datenbank Referenzen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (BLAST und PubMed) Multiple Alignements: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
Protein Parameter: http://www.expasy.ch/ (Translate, ProtParam, Compute pI/MW) Phylogenetische Analysen: http://www.phylogeny.fr/
DotBlot Analyse: http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/dotmatcher
Promoter Analyse: http://linux1.softberry.com/berry.phtml (FGENES-B, BPROM, FindTerm)
Die Gensequenzen des Actinomycin Biosynthese Genclusters sind hinterlegt unter der Genbank Acc.
Nr. HM038106. Die Kynureninase kynU Sequenz ist hinterlegt unter der Genbank Acc. Nr. HM038107.
2. Materialien
40