Molecular Beacons basierend auf FRET-Wechselwirkungen

Wie Eingangs bereits erwähnt, stützen sich viele Molecular Beacons auf das von T.

Förster 1948 erstmals beschriebenen Prinzip des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET).^[143] Hierbei wird die Energie eines angeregten Donormoleküls strahlungslos auf ein Akzeptormolekül über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen übertragen.^[144] Für diesen Transfer ist die relative Orientierung des Übergangsdipolmoments des Donor- und Akzeptormoleküls von großer Bedeutung.^[145] Der FRET-Prozess lässt sich somit über zwei Wege detektieren.

Erstens über die Emissionsabnahme des Donors und zweitens über die mögliche Zunahme der Fluoreszenzintensität des Akzeptors.^[146] Es müssen jedoch zwei Hauptvoraussetzungen erfüllt sein, damit es zu einem FRET kommen kann:

1. Da die Energietransferrate indirekt proportional zur sechsten Potenz des Abstands zwischen Donor und Akzeptor ist (siehe Gleichung 13), kann üblicherweise ab einer Distanz von mehr als 10 nm kein FRET mehr stattfinden.

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Gleichung 13: Distanzabhängigkeit der Energietransferrate eines FRET-Prozesses.

kT: Energietransferrate

τ_D: Fluoreszenzlebenszeit des Donors in Abwesenheit des Akzeptors R0: Försterradius; Abstand mit 50 % Energietransfereffizienz

r: Distanz zwischen den Chromophoren

2. Das Emissionsspektrum des Donors muss mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappen. Je größer diese spektrale Überlappung ist, umso effizienter ist der Energietransfer.

Theoretischer Hintergrund

Abb. 25: Schematische Darstellung des Absorptions- und Emissionsspektrums eines FRET-Paars; Der Bereich der spektralen Überlappung ist gelb markiert.

Das von Tyagi und Kramer entworfene Molecular Beacon Prinzip wurde zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses von Bao et. al. weiterentwickelt. Bei diesem neuen Prinzip ist zusätzlich zur Schleifenregion ein Stammteil komplementär zur entsprechenden Ziel-DNA (shared-stem Molecular Beacons).^{[139, 140]} Auf diese Weise wird der Fluorophor fester an die Ziel-DNA gebunden, wodurch seine Bewegungsfreiheit eingeschränkt und ein zufälliger FRET mit dem Quencher unwahrscheinlicher wird.

Abb. 26:Schematische Darstellung eines Molecular Beacons erster Generation (links) und eines shared-stem Molecular Beacons (rechts).

Eine weitere Möglichkeit, das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, sind die von Saito et al. entwickelten in-stem Molecular Beacons. Hierbei werden der Fluorophor und der Quencher nicht am 3’- und am 5’-Ende der Stammregion platziert, sondern direkt in der Stammsequenz. Dadurch werden beide Chromophore in direkte räumliche Nähe zueinander gezwungen, wodurch die FRET-Effizienz deutlich steigt und die Hintergrundfluoreszenz stark reduziert wird.^{[147, 148]}

Theoretischer Hintergrund

Abb. 27: Schematische Darstellung eines in-stem Molecular Beacons.^[148]

Beim Prinzip des in-stem Molecular Beacons wird die Emission durch statisches Quenchen gelöscht. Dies steht im Gegensatz zu der dynamischen Fluoreszenzlöschung, wie sie bei Beacons der ersten Generation vorkommt.^[149]

Dynamische Quench-Vorgänge unterteilen sich in Förster- und Dexter-Mechanismus.^[150] Bei diesen Mechanismen ist ein Energietransfer nur möglich, wenn sich der Donor in einem angeregten Zustand befindet.^[151] Der Förster-Mechanismus beruht, wie bereits Eingangs erwähnt, auf eine Energieübertragung über die Dipol-Dipol-Wechselwirkungen zwischen Donor- und Akzeptormolekül.^[144] Beim Dexter-Mechanismus hängt eine effektive Energieübertragung von einer guten Überlappung der Molekülorbitale ab. Die Energietransferrate des Dexter-Mechanismus nimmt exponentiell mit dem Abstand zwischen Donor und Quencher ab

⎟⎠

⎜ ⎞

⎝

∝ ⎛ −

L J R

k_T 2

exp

Abb. 28: Distanzabhängigkeit der Energietransferrate beim Dexter-Mechanismus.^[152]

kT: Energietransferrate

J: Integral der spektralen Überlappung R: Distanz zwischen Donor und Quencher

L: Eindringtiefe der Wellenfunktion in die Umgebung

Bei der statischen Löschung kommt es zur Ausbildung eines Grundzustandkomplexes zwischen Donor und Quencher. Dieses so gebildete intramolekulare Dimer und somit der Grundzustandskomplex unterscheidet sich wesentlich in seinen Eigenschaften von denen der einzelnen Chromophore.

Aufgrund der Aggregation kommt es zu einer nahezu vollständigen Löschung der Emission des Donors.^{[153, 154]} Da die statische Löschung, im Gegensatz zur dynamischen, nur abhängig von der Überlappung der Absorptionsspektren von

Theoretischer Hintergrund

Donor und Quencher ist, vereinfacht dies die Auswahl und Kombination von Chromophoren und somit das Design von Molecular Beacons.^[151]

Dynamische Fluoreszenzlöschung Statische Fluoreszenzlöschung z.B. Förster oder Dexter

schwache Kopplung starke Kopplung intramolekulares Dimer

F Q

F* F Q Q*

E

[FQ]

Grund-zustandskomplex strahlungsloser Energietransfer

Fluorophor Quencher

Abb. 29: Schematische Darstellung der dynamischen und der statischen Fluoreszenzlöschung.^[151]

Entgegen den bisher vorgestellten Molecular Beacons, die auf einem Fluorophor- und einem Quenchermolekül aufbauen, entwickelte Tan et al. einen Beacon mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren am 3’- und 5’-Ende der Stammregion.^[155] Dieses FRET-Paar, bestehend aus Coumarin und 6-FAM, einem Fluoresceinderivat, befindet sich in geschlossener Form in räumlicher Nähe zueinander. Dadurch wird die Emission des angeregten Coumarin durch 6-FAM gelöscht und das so angeregte 6-FAM fluoresziert. Wird der Beacon durch Zugabe einer Ziel-DNA geöffnet, werden die beiden Fluorophore voneinander getrennt. Hierdurch findet kein FRET mehr statt und die Emission des Coumarins kehrt zurück. Somit ist es nicht nur möglich, das Öffnen der Haarnadelschleife über die Rückkehr der gelöschten Emission des Donors zu beobachten, sondern auch über die Abnahme der Fluoreszenzintensität des Akzeptors. Auf diese Art und Weise ist es denkbar, deutlich sensitivere Beacons zu entwickeln. Des Weiteren werden die optischen Messungen dieser Anordnung durch eine geringere Abhängigkeit von der optischen Geometrie und durch einen

Theoretischer Hintergrund

kleineren Einfluss von Bleicheffekten erleichtert.^[149] Schließt man in die Betrachtung der Emissionen nicht nur deren tatsächlichen Werte, sondern auch deren Verhältnisse mit ein, so erleichtert dies zusätzlich die Handhabung und die Wahrscheinlichkeit von verfälschten Signalen nimmt deutlich ab.

Gegenstrang

Abb. 30: Schematische Darstellung des von Tan et al. entwickelten Molecular Beacons.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es noch zahlreiche weitere Ansätze gibt das Signal-Rausch-Verhältnis und die eventuell störende Hintergrundfluoreszenz durch unvollständiges Löschen zu vermindern, z. B. durch zeitaufgelöste Fluoreszenztechniken,^[156] das Nutzen von Stokes-Verschiebung,[155, 157, 158] durch super gelöschte Beacons,^[159] durch die Ausbildungen eines Stamms mit einer Tripel-helix^{[160, 161]} oder durch Stammlose PNA Beacons.^[162]

2.7. DNA-Sonden basierend auf der Ausbildung von Excimeren und