DNA-Sonden basierend auf der Ausbildung von Excimeren und

Die in Kapitel 2.4 behandelte Methode der Excimer bzw. Exciplexbildung lässt sich leicht auf die Entwicklung von DNA-Sonden anwenden. Die bekanntesten Chromophore hierbei sind die Pyrene und Perylene und deren Derivate. DNA-Sequenzen mit diesen Molekülen besitzen sowohl mit Interstrang- als auch mit Intrastrangdimeren die erwartete Excimeremission.

Theoretischer Hintergrund

Ebata et al. synthetisierte zwei Oligonukleotide mit je einem Pyren am 3’- oder 5’-Ende.^{[163, 164]} Durch Zugabe eines passenden Gegenstrangs hybridisieren beide

„Split probes“ an diesen. Infolgedessen werden die beiden Chromophore in räumliche Nähe zueinander gezwungen, wodurch sich ein Excimer formt. Aufgrund des Unterschieds zwischen Monomer und Excimeremission war es möglich, 16S rRNA in sehr niedrigen Konzentrationen von bis zu 10 nM nachzuweisen. Paris et al.

gelang es, durch strukturelle Optimierung dieses Systems die Sensitivität auf 4 nM zu steigern.^[165] Nach dem gleichen Prinzip entwickelten Bichenkova et al. „Split probes“ mit einem Pyren- und einem N,N’-dialkylnaphthalinmotiv an den terminalen Enden.^[166] Diese beiden Chromophore bilden zusammen einen Exciplex aus, dessen Emission sich deutlich von der Monomeremission unterscheidet. Jedoch erreichten sie nur eine geringe Sensitivität von 400 nM.^[167]

Abb. 31: Schematische Darstellung der DNA-Sonde nach Ebata et al.^[168]

In der Gruppe von Wagenknecht et al. wurde eine DNA-Sonde mit zwei künstlichen Perylenbisimidbausteinen entworfen. Diese beiden Chromophore befinden sich in der Mitte einer Oligonukleotidsequenz und werden von einem Andenosin als Zwischenbase voneinander getrennt. Dieser räumliche Abstand verhindert in Gegenwart des passenden Gegenstrangs jegliche Wechselwirkung zwischen den Chromophoren und es tritt ausschließlich die Perylenbisimid-Monomeremission auf.

Wird anstelle der Wildtyp-DNA eine Mutante-DNA mit einer Fehlpaarung zum Adenosin hinzugegeben, stört diese Basenfehlpaarung den sich bildenden Duplex.

Der Abstand zwischen den beiden Farbstoffen wird verändert und sie treten in Wechselwirkung zueinander. Auf diese Weise ändert sich die Monomeremission zur Excimeremission. Zugleich war es möglich, nicht nur zwischen Wildtyp und Mutante zu unterscheiden, sondern anhand des Verhältnisses beider Emissionen auch noch deren Anteil an der Probenlösung zu ermitteln.^[169]

Ziel-DNA

Theoretischer Hintergrund

Abb. 32: DNA-Sonde von Wagenknecht et al.;^[169] links: Sondensequenz mit Perylenbisimid-baustein; rechts Emissionsspektren mit Wildtyp (rot) und Mutanten (schwarz).

Der erste Excimer – Monomer Molecular Beacon mit Pyrenbausteinen an den terminalen Enden wurde von Fujimoto et al. synthetisiert.^[170] Dieser Beacon mit einer Stammlänge von fünf Basenpaaren und einem Loop von 19 Basen wurde bereits durch Zugabe von nur einem Äquivalent an Gegenstrang vollständig geöffnet und hatte eine Sensitivität von 1 nM. Des Weiteren war es möglich, präzise zwischen Wildtyp und SNP-Mutanten zu unterscheiden. Da die beiden Chromophore über einen Succinimid-Ester mit dem bereits fertig synthetisierten Oligonukleotidstrang verknüpft wurden, besticht dieser Beacon zusätzlich mit seiner synthetischen Einfachheit.

Abb. 33: Schematische Darstellung des Excimer – Monomer Molecular Beacon von Fujimoto et al.^[170]

Häner et al. entwickelten diesen Excimer – Monomer Molecular Beacon weiter und synthetisierten einen excimerkontrollierten in stem Molecular Beacon mit jeweils zwei artifiziellen Pyren- und Perylenbisimidnukleosiden (PBI) in der Stammregion. In der geschlossenen Form befinden sich die vier Chromophore in räumlicher Nähe

Ziel-DNA

Theoretischer Hintergrund

zueinander und es entsteht ein durch π-π-Wechselwirkungen gekoppeltes EYEY Motiv. Da Pyren elektronenreich ist und Perylenbisimide einen elektronenarmen Charakter besitzen, kommt es zu Donor (Pyren) Akzeptor (PBI) Wechselwirkungen und die Emission des Pyrens wird vollständig gelöscht. Hierdurch war es möglich, die Hintergrundfluoreszenz zu eliminieren. Durch Zugabe des entsprechenden Gegenstrangs wird das EYEY-Motiv zerstört und die beiden Chromophorgruppen voneinander getrennt. Die beiden Pyren Einheiten formen nun ein Dimer YY, dessen spezifische Excimeremission detektiert werden kann. Durch die hohe Quantenausbeute und des großen Extinktionskoeffizienten des Pyrens konnte eine Sensitivität von 0.3 nM erreicht werden.^[171]

Abb. 34: Schematische Darstellung des Excimer-kontrollierten in-stem Molecular Beacon nach Häner et al.^[171]

Der in-stem Molecular Beacon von Asanuma et al. basiert auf einem ähnlichen Prinzip, wurde jedoch in der Funktionsweise erweitert. Auch dieser Beacon baut in der geschlossenen Form auf einen Löschprozess zwischen zwei Chromophoren auf.

Asanuma verwendete hierzu zwei durch eine Zwischenbase getrennte Perylenbausteine als Emitter und Anthrachinon als Quencher. Durch Öffnung der Stammregion kommt es zu einer Trennung dieses Donor-Akzeptor-Paares und die Monomeremission des Perylens kehrt zurück. Befindet sich im Gegenstrang in der Region gegenüber der trennenden Zwischenbase eine Deletion, so treten die beiden Chromophore in räumliche Nähe zueinander und emittieren die typische Excimerfluoreszenz. Es ist somit möglich, nicht nur zwischen geschlossener (keine Emission) und offener Form (blaue Emission) mit dem bloßen Auge zu

Theoretischer Hintergrund

unterscheiden, sondern auch zwischen offener Form und einem Gegenstrang mit einer entsprechenden Deletion (grüne Emission).^[148]

Abb. 35: Schematische Darstellung des in-stem Molecular Beacon von Asanuma et al.^[148]

Muto et al. entwickelten die Idee eines Kaliumsensors auf der Grundlage der DNA vermittelten Excimerbildung von Pyren. Jedes Sensormonomer besteht aus drei Teilbereichen. Einem Kronenether als Ionendetektor, einer kurzen Oligonukleotidsequenz als strukturgebende Einheit und einem Chromophor (Pyren) der je nach Zustand des Systems ein spezifisches optisches Signal aussendet. Sind keine Kaliumionen im System vorhanden, existieren nur Sensormonomere, da der Oligonukleotidbereich zu kurz ist, um eine stabile Doppelhelix auszubilden. Die Chromophore kommen somit nicht in näheren Kontakt und nur die Pyrenmonomeremission ist detektierbar. Durch Zugabe der passenden Ionen werden diese durch den Kronenether komplexiert. Wegen dieser Vororganisation ist es dem kurzen DNA Bereich nun möglich, einen stabilen Doppelstrang auszubilden, wodurch die terminalen Chromophore in räumliche Nähe zueinander kommen. Dieser Prozess kann anhand der Abnahme der Monomeremission und der Zunahme der Excimeremission verfolgt werden.^[172]

Theoretischer Hintergrund

Abb. 36: Schematische Darstellung des excimerbasierten Kaliumionensensors.^[172]

Dies waren einige ausgewählte Beispiele aus einer schier unendlichen Anzahl von DNA-Sonden, die auf der Ausbildung von Excimeren und Exciplexen basieren.

Leider ist abschließend noch anzumerken, dass die Zahl der praktikablen Anwendungen mit Pyren und Perylenbisimid als Chromophor in der Oligonukleotidanalytik stark begrenzt ist, da beide Farbstoffe im angeregten Zustand in der Lage sind Guanin zu oxidieren und so ihre Emission gelöscht wird.^{[173, 174]}

Perylenbisimid als artifizielle DNA-Base