Mikrobiologische und zytologische Proben

Die mikrobiologischen und zytologischen Proben wurden von jeder Stute unmittelbar vor der ersten Besamung (BU1 und ZYTO1) und 48 h nach der zweiten Besamung zum Ende der physiologischen uterinen Clearance (BU2 und ZYTO2) gewonnen. Der mikrobiologische Tupfer wurde auf Blut- und Selektivnährböden ausgestrichen und das Bakterienwachstum 24 und 48 h später beurteilt. Der Endometriumsabstrich wurde auf einem Objektträger abgerollt, nach Pappenheim gefärbt und im Hinblick auf die polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMNs) in 10 Gesichtsfeldern mikroskopisch ausgezählt (siehe Kapitel 3.1.1.6.

und 3.1.1.7.). Außerdem wurden alle verwendeten Besamungsportionen und das Seminalplasma mikrobiologisch überprüft.

Betrachtet man zunächst die Ergebnisse der bakteriologischen und zytologischen Untersuchung von allen Stuten gesamt (n = 94), so konnte kein signifikanter Unterschied zwischen dem mikrobiologischen oder zytologischen Ergebnis der jeweils ersten und zweiten Untersuchung festgestellt werden (BU1 = 54 % (51 / 94) negativ vs. BU2 = 60 % (56 / 94) negativ und ZYTO1 = 47 % (44 / 94) vs. ZYTO2 = 64 % (60 / 949 negativ). Dieses Ergebnis weist auf eine persistierende Entzündung der Gebärmutter mit und ohne mikrobiologische Beteiligung bei diesen subfertilen Stuten hin, die auch nach einer Besamung noch besteht.

Vergleicht man die Behandlungsgruppen hinsichtlich der bakteriologischen und zytologischen Ergebnisse zum Zeitpunkt BU2 / ZYTO 2, da nur hier ein Einfluss der einzelnen Behandlungen sichtbar werden konnte, so gab es bei der zweiten bakteriologischen Untersuchung einen signifikanten Unterschied zwischen der Oxytocin- und der Seminalplasmagruppe. Die Gruppen mit den stärksten uterinen Kontraktionen zeigten also das geringste Bakterienwachstum zum Zeitpunkt BU2, jedoch waren in der Oxytocingruppe

allerdings statistisch nicht nachgewiesen werden, dass ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Kontraktionsstärke und dem Ergebnis der bakteriologischen oder zytologischen Untersuchung besteht, was sich möglicherweise auf einen zu geringen Stichprobenumfang zurückführen ließe. Die Arbeit von NIKOLAKOPOULOS und WATSON (1997) weist nur darauf hin, dass die uterine Kontraktionsaktivität zur Elimination von Flüssigkeit aber nicht von Bakterien aus der Gebärmutter beitrug. Einer Stutengruppe, die als resistent gegenüber einer besamungsinduzierten Endometritis galt, wurde in zwei Zyklen, 24 h nach hCG-Gabe eine Bakterienlösung intrauterin verabreicht, und im zweiten Zyklus wurden eben diese Stuten mit einer intravenösen Clenbuterolgabe zu empfänglichen Stuten „umgewandelt“. Bei der Uterusspülung 48 h nach Bakterieninstillation wurden in beiden Gruppen die gleichen PMN- und Bakterienanzahlen festgestellt. Die Steigerung der negativen bakteriologischen Ergebnisse von 42 % zum Zeitpunkt BU1 auf 75 % zum Zeitpunkt BU2 in der Kontrollgruppe in der eigenen Studie ist dennoch auffällig. Generell gab es eine Steigerung in der Anzahl der negativen Proben zum Zeitpunkt BU2 in allen Gruppen außer der Seminalplasmagruppe (BU1 = 60 % negativ vs. BU2 = 44 % negativ). Eine mögliche uterine Kontamination aufgrund des bei der Besamung zugefügten Seminalplasmas konnte aber ausgeschlossen werden, da alle Seminalplasmaproben als mikrobiell negativ untersucht wurden. Trotzdem wäre es eventuell wünschenswert gewesen, nur Stuten in die Untersuchung einzubeziehen, die direkt vor der ersten Insemination negative Ausgangstupfer gezeigt hätten.

So wäre vielleicht ein Behandlungseffekt noch deutlicher geworden.

Beim Vergleich der zytologischen Proben 48 h nach der zweiten Besamung konnte zwischen den Behandlungsgruppen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die Seminalplasma- und die Kontrollgruppe zeigten jedoch mit 32 bzw. 33 % die geringste Anzahl an positiven Proben. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen auch Studien von MALOUFI et al. (2002) und GÜVENC et al. (2004), in denen 96 bzw. 24 h nach Besamung mit Tiefgefriersperma kein Unterschied in der PMN-Konzentration bei empfänglichen und resistenten Stuten festgestellt werden konnte. Allerdings wurden in diesen Versuchen, wie auch in der vorliegenden Arbeit, die zytologischen Proben zu einem relativ späten Zeitpunkt 48 h nach der Besamung genommen. Die hier genommenen Proben spiegeln also eher das Bild der Eliminationsphase der PMNs oder der persistierenden Entzündung wider, als das Bild der akuten Entzündung. KATILA (1995) zeigte, dass bereits 30 Minuten nach der

Besamung Leukozyten in der Gebärmutter nachgewiesen werden konnten und die akute Phase der Entzündung sich im Zeitraum zwischen 8 und 24 h abspielte. Es stellt sich daher auch die Frage des optimalen Probenentnahmezeitpunktes für die Evaluierung der Frage, inwiefern eine besamungsinduzierte persistierende Endometritis besteht, da Daten, die in der akuten Phase der Entzündung gewonnen werden, nicht direkt auf eine möglicherweise persistierende Entzündung bezogen werden können (MALOUFI et al. 2002).

Da sich in der Seminalplasmagruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen mit subfertilen Stuten prozentual die geringste Anzahl an leukozytenpositiven Proben nachweisen ließ, lässt eine immunsuppressive Wirkung des Seminalplasmas vermuten. TROEDSSON et al. (1998, 2000, 2002) zeigten in In-vitro- und In-vivo-Versuchen, dass Seminalplasma die Chemotaxis in das Gebärmutterlumen und die Phagozytoseaktivität der PMNs durch die Hemmung der Komplementaktivierung verhindert, und dass es zu besseren Trächtigkeitsergebnissen kam, wenn Stuten mit induzierter Endometritis mit Sperma mit einem Zusatz von Seminalplasma besamt wurden.

Betrachtet man abschließend den Zusammenhang zwischen den bakteriologischen und zytologischen Ergebnissen und der Trächtigkeitsrate, so konnte festgestellt werden, dass das Ergebnis der zweiten zytologischen Probe 48 h nach der letzten Besamung der aussagekräftigste Faktor in Bezug auf eine eventuelle Trächtigkeit war, und nicht wie vermutet der in der Praxis auch am meisten verwendete mikrobiologische Tupfer vor der Besamung. In 79% der Fälle mit negativer Trächtigkeitsuntersuchung ließen sich zum Zeitpunkt 2 Leukozyten im Uterus nachweisen und in 60% der Fälle mit positiver Trächtigkeitsuntersuchung war das Ergebnis der zytologischen Untersuchung negativ. Dies deutet darauf hin, dass sich mit Hilfe eines Endometriumsabstrichs eher die Chance einer Trächtigkeit vorhersagen lässt als mit einem bakteriologischen Tupfer. Auch ließe sich bei positiven Ergebnis sofort eine Behandlung einleiten, die die Trächtigkeitschancen möglicherweise verbessern würde. Die Wahl der Probenentnahme und des Entnahmezeitpunktes sollte also im Besamungsmanagement überdacht werden.

Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lässt sich schlussfolgern, dass die postinseminatorische Kontraktionsaktivität des Uterus eine wichtige Rolle beim

Mit Hilfe der transrektalen Ultrasonographie war es möglich, unter Feldbedingungen einen vergleichenden Langzeitüberblick über die Uteruskontraktionen von fertilen und subfertilen Stuten im Proöstrus, vor und nach der Besamung und während der uterinen Clearance zu bekommen. Alle Stuten zeigten nach der Besamung einen deutlichen Anstieg der Uterusaktiviät, der sich bei aufeinanderfolgenden Inseminationen noch signifikant steigern ließ. Dabei zeigten fertile Versuchstiere eine deutlich höhere Kontraktionsaktivität als subfertile Stuten, bei denen sich die myometriale Aktivität zwar durch Oxytocin verbessern ließ, wohingegen mit Seminalplasma dieser Effekt nicht zu erzielen war.

Es konnte kein Nachweis erbracht werden, dass die Uteruskontraktionsaktivität einen Einfluss auf die Ergebnisse der bakteriologischen und zytologischen Proben hatte, sie konnte aber mit der Trächtigkeitsrate in Verbindung gebracht werden. Stuten mit einer guten Uterusmotilität hatten höhere Chancen auf ein positives Befruchtungsergebnis. Auch war bei Stuten, bei denen 48 h nach der Besamung keine Leukozyten in der Gebärmutter nachgewiesen werden konnten, mit einer größeren Wahrscheinlichkeit eine positive Trächtigkeitsuntersuchung zu erwarten.

Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Studie sollte das Besamungsmanagement, grade bei suboptimal fertilen Stuten hinsichtlich der Besamungsfrequenz und der diagnostischen Probenentnahme überdacht werden.

5 Zusammenfassung

Ute Pansegrau (2007):

Klinische Untersuchung zur prospektiven Klassifizierung subfertiler Stuten

Ziel der Untersuchung war es, herauszufinden, inwiefern sich Reproduktionsstörungen bei Problemstuten, die zu besamungsinduzierter Endometritis neigen, auf eine gestörte Kontraktionsaktivität der Gebärmutter zurückführen lassen. Zusätzlich sollte überprüft werden, ob mit Seminalplasma eine ähnliche kontraktionsstimulierende Wirkung wie mit Oxytocin erreicht werden kann, und ob sich diese Behandlung direkt post inseminationem positiv auf die Trächtigkeitsrate auswirkt. Des weiteren wurde untersucht, ob die Uteruskontraktionsaktivität die uterinen mikrobiologischen und zytologischen Befunde prae und post inseminationem beeinflusst, und ob Beziehungen zum Entstehen einer Gravidität bestehen.

Für die Studie standen 62 Warmblutstuten (4 bis 21 Jahre) zur Verfügung, die in 94 Zyklen untersucht wurden. Dabei entfielen 12 Stuten mit Fohlen bei Fuß auf die fertile Kontrollgruppe. Die restlichen 50 Stuten, die in der letzten Decksaison güst geblieben waren, wurden in insgesamt 82 Zyklen untersucht, zufällig auf die drei Versuchsgruppen: Oxytocin (n = 27), Seminalplasma (n = 25) und unbehandelt (n = 30) aufgeteilt und mit Frischsamen zweier fertiler Hengste besamt (Besamungsdosis 500 x 10⁶ vorwärtsbeweglicheSpermien in 12 ml Inseminatvolumen). Dazu wurde die Ovulation bei ultrasonographischem Nachweis eines Follikels von mindestens 35 mm Durchmesser durch die intravenöse Gabe von 2500 IE hCG induziert, und alle Stuten 24 und 48 h nach hCG-Gabe in das Corpus uteri besamt. Je nach Versuchsgruppe wurde den Stuten direkt nach der Besamung 20 IE Oxytocin injiziert, 20 ml Seminalplasma aus einem Seminalplasmapool intrauterin verabreicht oder sie blieben unbehandelt.

Die uterine Kontraktionsaktivität wurde mittels transrektaler Ultrasonographie am Tag 16-18 nach der letzten Rosse (KA1), direkt vor und nach der ersten (KA2 und KA3a/b) und zweiten

Clearance (KA6) bestimmt. Dazu wurde die Ultraschallsonde (Linearschallkopf, 6,0 MHz) quer über das Uterushorn ipsilateral zum dominaten/ovulierten Follikel positioniert und die Gebärmutterkontraktionen über 5, bzw. 10 Minuten nach der ersten Besamung, erfasst. Die Auswertung der Kontraktionsaktivität erfolgte mit Hilfe eines Scoresystems von 0 (keine Kontraktionen) bis IV (sehr starke Kontraktionen).

Zusätzlich wurde von allen Stuten bei der Eingangsuntersuchung ein Endometriumsbioptat gewonnen, sowie vor der ersten und 48 h nach der zweiten Besamung Uterustupferproben für eine mikrobiologische und zytologische Auswertung genommen.

Außerdem wurde mittels einer Uteruslavage, die 2 h nach Insemination durchgeführt wurde, untersucht, inwiefern Oxytocin, direkt postinseminatorisch verabreicht, einen Einfluss auf eine eventuell vorzeitige Elimination der Spermien aus der Gebärmutter hat.

Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:

1. Ein Vergleich der mittleren uterinen Kontraktionsaktivität aller Stuten (n = 94) ergab deutliche Unterschiede zwischen fast allen Messzeitpunkten. So zeigten sich signifikante Unterschiede (P ≤ 0,002) zwischen KA1 (16-18 Tage nach der letzten Rosse) und allen anderen Messzeitpunkten, zwischen den Uteruskontraktionen vor (KA2 und KA4) und nach (KA3a/b und KA5) der Insemination (P ≤ 0,0001), sowie zwischen der Uterusmotilität nach der Besamung (KA3a/b und KA5) und 48 nach der zweiten Besamung (KA6) (P ≤ 0,0001).

Nach der zweiten Insemination war zusätzlich eine hochsignifikant stärkere uterine Kontraktionsaktivität (P ≤ 0,0001) zu verzeichnen als nach der ersten Besamung, während direkt vor den Samenübertragungen nahezu identische Aktivitätsniveaus auffielen.

2. Vergleicht man die Kontraktionsaktivität zwischen den Gruppen, so zeigte die Kontrollgruppe ein allgemein höheres Aktivitätsniveau. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ließen sich zum Zeitpunkt KA1 zwischen der Kontrollgruppe und allen Versuchsgruppen (P ≤ 0,02), zum Messzeitpunkt KA3b nach der ersten Besamung zwischen der Oxytocin- und Kontrollgruppe auf der einen Seite und der Seminalplasma- und der unbehandelten Gruppe auf der anderen Seite (P ≤ 0,02) darstellen. Nach der zweiten Insemination zeigte die Oxytocingruppe signifikant stärkere uterine Kontraktionen als die Seminalplasma- und die unbehandelte Gruppe (P ≤ 0,05), die Kontrollgruppe aber nur noch

gegenüber der unbehandelt gebliebenen Gruppe (P ≤ 0,05). Die Kontraktionsaktivität der Gebärmutter in der Seminalplasma- und der unbehandelten Gruppe unterschied sich zu keinen Zeitpunkt signifikant voneinander.

3. Trotz der verstärkten Uteruskontraktionen bei der mit Oxytocin behandelten Gruppe, die jedoch nicht über das Kontrollniveau hinausging, gab es keine Hinweise darauf, dass Oxytocin, in einer Menge von 20 IE post inseminationem verabreicht, einen frühzeitigen Rückfluss des Inseminats aus dem Uterus bedingte.

4. Zwischen der Uteruskontraktionsaktivität und dem Trächtigkeitsergebnis konnte ein positiver Zusammenhang gezeigt werden. Es konnte aber kein Zusammenhang zwischen der Uterusmotilität und den Ergebnissen der mikrobiologischen und zytologischen Untersuchung der Gebärmutter gebildet werden.

5. Beim Vergleich der zu den zwei Probezeitpunkten (BU1 und ZYTO1 vor der ersten Besamung und BU2 und ZYTO2 48 h nach der zweiten Besamung) gewonnenen bakteriologischen und zytologischen Ergebnissen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Zum Zeitpunkt 1 waren 54 % der bakteriologischen und 47 % der zytologischen Proben, zum Zeitpunkt 2 56% der bakteriologischen und 64 % der zytologischen Proben negativ. Beim Behandlungsgruppenvergleich zeigten sich signifikant weniger positive Proben bei BU2 (P = 0,02) bei der Oxytocin- als bei der Seminalplasmagruppe. Insgesamt ließen sich bei allen Gruppen 48 h nach der zweiten Insemination weniger positive zytologischen Proben als vor der ersten Besamung feststellen.

Gleiches galt auch für die positiven mikrobiologischen Proben, mit Ausnahme bei der mit Seminalplasma behandelten Gruppe.

Außerdem konnte ein signifikanter Zusammenhang (P ≤ 0,0001) zwischen der 48 h nach der Besamung erhobenen zytologischen Probe und dem Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung hergestellt werden. Bei 79 % der nicht tragenden Stuten konnten 48 h nach der zweiten Besamung Leukozyten im Uterus nachgewiesen werden, und 60 % der Stuten mit positivem Befruchtungsergebnis hatten 48 h nach der zweiten Besamung eine negative Zytologie.

6. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass das Biopsieergebnis, sowie die Saison keinen Einfluss auf das Trächtigkeitsergebnis hatten. Jüngere Stuten wurden aber signifikant (P ≤ 0,05) besser tragend als ältere Stuten.

7. Das Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung unterschied sich signifikant (P ≤ 0,05) zwischen der Kontrollgruppe (83 %) und den Versuchsgruppen (40 %).

Die Untersuchungen verdeutlichen, dass die Uteruskontraktionsaktiviät durch die Besamung angeregt wird und sich bei aufeinanderfolgenden Besamungen noch signifikant steigert.

Insgesamt ist bei subfertilen Stuten eine schwächere Myometriumsaktivität feststellbar als bei fertilen Tieren. Die Uteruskontraktionsaktivität ließ sich mit Hilfe von Oxytocin, nicht aber mit zusätzlich intrauterin verabreichtem Seminalplasma steigern. Die niedrige Trächtigkeitsrate in der Oxytocingruppe konnte nicht mit einer vorzeitigen Elimination der Spermien aus der Gebärmutter aufgrund einer direkt postinseminatorisch verabreichten Oxytocininjektion in Zusammenhang gebracht werden. Da ein positiver Zusammenhang zwischen der Kontraktionsaktivität und dem Trächtigkeitssergebnis festgestellt werden konnte, ist eine verringerte uterine Aktivität als eine Ursache von suboptimaler Fertilität bei Stuten zu sehen. Hinsichtlich eines positiven Trächtigkeitsergebnisses war auch der Nachweis von PMNs im Uterus 48 h nach der Besamung von Bedeutung. Stuten mit einem positiven zytologischen Tupfer zu diesem Zeitpunkt hatten die geringsten Trächtigkeitschancen.

Daher sollte über eine optimale Besamungsfrequenz und die Art und den Zeitpunkt der Probennahme aus der Gebärmutter nachgedacht werden.