4 Material und Methoden
4.1 Mikrobiologische Methoden und Säugerzellkultur
4.1.1 Mikrobiologische Methoden
Kultivierung, Anzucht und Aufbewahrung von E. coli
DieE. coli-Stämme (siehe Tabelle 4.1) wurden sofern nicht anders vermerkt zur Selekti-on, zur Anzucht und zur Expression in flüssigem LB-Medium (1 % (alles in m/V) Bacto-Tryptone, 0.5 % Bacto-Yeast Extract, 1 % NaCl) oder auf Agar (1.5% Agar in LB-Medium) unter Zusatz entsprechender Antibiotika (100µg/ml Ampicillin, 50µg/ml Am-picillin, 34µg/ml Chloramphenicol, 50µg/ml Streptomycin) kultiviert. Als Klonierungs-und Plasmidpräparationsstamm kamen DH10b-Zellen zum Einsatz; für die Proteinex-pression wurde der Stamm BL21(DE3) verwendet.
Flüssigkulturen bis zu einem Volumen von 50 ml wurden mit einzelnen Kolonien von LB-Agar-Platten oder aus einer Stammkultur durch Anstechen mit einem sterilen Zahn-stocher angeimpft. Flüssigkulturen von größerem Volumen wurden im Verhältnis 1:100 mit einer Übernacht-Vorkultur inokuliert. Die Anzucht erfolgte im Schüttler (Inno-va 4200, New Brunswick Scientific) bei 37◦C und 180 U/min über Nacht oder bis zu einer OD600nm von 0.2-0.4. Zur Aufbewahrung eines Klons in Form einer Stammkul-tur wurden steriles Glycerin und VorkulStammkul-tur im Verhältnis 1:1 gemischt und bei -80◦C gelagert.
Proteinexpression in E. coli
Für die Proteinexpression wurden 500 ml-Kulturen aus frisch transformierten Zellen und bei 30◦C zu einer optischen Dichte von OD600nm≈0.5 angezogen. Nach zweistündiger Abkühlung auf 18◦C erfolgte die Induktion der Expression durch Zugabe von 60 µM IPTG bzw. 200 µg/l Anhydrotetrazyklin (Endkonzentration). Die Zellen wurden nach 16-17 h geerntet (30 min, 4000 g, 4◦C, AvantiTMJ-20 XP, Beckmann, Rotor JLA 8.1000) und das Zellpellet zügig in einem Verhältnis von 1.5 ml pro g Zellen Resuspensionspuf-fer (50 mM Na2HPO4 pH 7.5, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM β-Mercaptoethanol,
4 Material und Methoden
1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, ein Tropfen Antischaum A und etwas DNase (beides Sigma)) resuspendiert. Die Zellen wurden nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei -80◦C gelagert oder sofort weiterverarbeitet.
Herstellung CaCl2-kompetenterE. coli-Zellen
Kompetente Zellen wurden über Nacht in 50 ml SOB-Medium (2 % (m/V) Bacto-Tryp-tone, 0.5 % (m/V) Bacto-Yeast Extract, 10 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2) kultiviert, und anschließend in 200 ml SOB-Medium auf eine OD600nm≈0.3-0.4 angezogen. Die geernteten Zellen (7 min, 2400 U/min, 4◦C, Megafuge 1.0 R mit Ausschwingrotor, Thermo) wurden in 15 ml TfbI-Puffer (30 mM Kaliumace-tat, 50 mM MnCl, 100 mM KCl und 15 % (V/V) Glycerin, pH 5.8) resuspendiert und auf Eis inkubiert (DH10b-Zellen 10 min, BL21-Zellen 90 min). Durch erneutes Zentrifu-gieren (5 min, 2000 U/min, 4◦C), Dekantieren und vorsichtiges Resuspendieren in 2 ml eiskaltem TfbII-Puffer (10 mM MOPS, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15 % (V/V) Glycerin, pH 7.0) erhielt man CaCl2-kompetente Zellen, die in Portionen zu je 110µl bei -80◦C aufbewahrt wurden.
Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen
Ausgehend von einer Stammkultur oder einer Kultur auf Agar-Platte wurde zunächst eine Übernacht-Vorkultur bereitet. 5 ml LB-Medium wurden mit 100µl Vorkultur ange-impft und 3 Stunden bei 37◦C und 200 U/min geschüttelt. Die Kultur wurde zu je 1.5 ml portioniert, die Zellen geerntet (11.000 U/min, 4◦C, 30 s, Mikrozentrifuge MiniSpinR, Eppendorf) und anschließend 3 mal mit 1 ml kaltem, sterilen 10 % (V/V)-Glycerin in bi-destilliertem Wasser gewaschen. Die verbleibende Zellsuspension wurde direkt zur Trans-formation durch Elektroporation weiterverwendet bzw. bei -80◦C gelagert.
Hitzeschock-Transformation
Für die CaCl2-Transformation wurden 50µl kompetente Zellen auf Eis aufgetaut, mit 30-100 ng DNA aus einer Plasmidpräparation oder 20µl eines Ligationsansatzes gemischt und 10 min auf Eis gekühlt. Der Hitze-Schock erfolgte für 90 s bei 42◦C in einem Thermo-mixer (ThermoThermo-mixer comfort, Eppendorf) mit anschließendem Abkühlen auf Eis. Nach Zugabe von 500µl LB-Medium ohne Antibiotikum wurde der Ansatz 1 h im Thermo-mixer bei 37◦C und 600 U/min geschüttelt, 30 s bei 11.000 U/min abzentrifugiert und dekantiert. Im verbliebenen Überstand wurde das Zellpellet vorsichtig resuspendiert, auf einer LB-Agar-Platte mit Antibiotikum verteilt und für 16 h bei 37◦C inkubiert.
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4.1 Mikrobiologische Methoden und Säugerzellkultur
Transformation durch Elektroporation
Zur Durchführung einer Elektroporation wurden maximal 20 ng Plasmid-DNA mit ei-nem Aliquot elektrokompetenter Zellen gemischt und 1 min auf Eis gelagert. Der Elek-troschock erfolgte in einer gekühlten Elektroporationsküvette (Electroporation Cuvettes plus, 1 mm, BTX) mit einem Elektroporator (ElectroCellManipulator ECM 630, BTX) bei folgenden Geräteeinstellungen: Spannung 1500 V, Widerstand 125 Ω und Kapazität 50µF. Die Zellen wurden unmittelbar darauf in 500µl LB-Medium aufgenommen, für 1 h bei 37◦C und 650 U/min inkubiert und auf einer LB-Agar-Platte mit Antibiotikum angezogen.
Funktionstest auf MacConkey-Agar
Elektrokompetente Zellen des Adenylatzyklase defizienten Stammes BTH101 wurden mit den Expressionskonstrukten für die vier kleinen PACs transformiert und auf LB-Agar selektiert. Positive Klone wurden in 5 ml Flüssigkultur bei 30◦C angezogen und PAC in Anwesenhait von 200µM IPTG 2 Stunden exprimiert. Anschließend wurden die Kulturen mit einer Impföse auf MacConkey-Agar (Difco, pH 7.5) mit 1 % Maltose aufgebracht und zum Sichtbarwerden der Färbung über Nacht im Dunkeln oder im Weisslicht (durchschnittliche Intensität 8µW mm−2) bei 30◦C inkubiert.
Übersicht über verwendete Vektoren und E. coli-Stämme
E. coli-Stamm Genotyp Bezug
DH10b F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1
endA1 araΔ139 Δ(ara, leu)7697 galUgalKλ-rpsL (StrR) nupG Invitrogen BL21(DE3) F-ompT hsdSB(r-Bm-B) galdcm (DE3) Novagen BTH101 F-cya-99 araD139 galE15 galK16 rpsL1 (StrR) hsdR2 mcrA1 mcrB1 Euromedex
Abbildung 4.1: Verwendete E. coli-Stämme
4 Material und Methoden
Plasmid Verwendung und Merkmale Bezug
pET28a(+) Expressionsvektor;
kanR, T7-Promoter, lac-Operator, 6 x His-Tag(N), Protease Thrombin, T7-Tag(N)
Novagen
pETSUMO Expressionsvektor;
kanR, T7-Promoter, lac-Operator, 6 x His-Tag(N), SUMO-ORF, TA-Klonierungsstelle
Invitrogen
pASK43p Expressionsvektor;
ampR, tet-Promoter/ Operator, 6 x His-Tag(N), Strep-Tag (C) IBA pGEM-HE Vektor für in vitroTranskription; Abkömmling des
pGEM3Z-Vektors, modifiziert nach Liman et al. 1992; ampR, T7-Promoter, lac-Operator
Promega
pET28(a)-ec_bPAC Ausgangsvektor für Konstrukte mit dem E. coli
codon-adaptierten Gen W. Gärtner,
MPI Mühlheim
pGEM-HE-h_bPAC-cmyc in vitro Transkription von human-codon-adaptierter
bPAC-RNA S. Tsunoda,
HU Berlin
pGEM-HE-CNGA2-C460W-E583M in vitro Transkription von CNG-Kanal RNA W. Karpen, OHSU Portland
Abbildung 4.2: Verwendete Vektoren und Konstrukte
Nicht aufgeführte Konstrukte wurden aus den Ausgangsvektoren und synthetisch erworbenen Genen erhalten.
4.1.2 Zellbiologische Methoden
Auftauen und Einfrieren vonChinese-Hamster-Ovary-Zellen
Die cAMP-sensitive CHO-Reporterzelllinie [186] wurde von der Firma Bayer auf Tro-ckeneis erhalten. Zum Auftauen wurden die Zellen im 37◦C warmen Wasserbad ange-taut und zügig in vorgewärmtes DMEM/F12 mit GlutaMAX (Gibco) und 20 % fötalem Kälberserum (Biochrom) überführt. Nach Entfernung des DMSO-haltigen Überstandes (3 min, 500 g) wurden die Zellen in 5 ml frischem Medium aufgenommen und in einer T25-Zellkulturflasche bis zur Konfluenz kultiviert. Für die Herstellung von Kulturen zur Dauerlagerung wurden 1- 2·106 Zellen in 2 ml DMEM/F12 mit 20% foetales Kälberserum und 10 % DMSO aufgenommen und in einem Kühlblock (Nalgene) bei -80◦C über 24 h eingefroren.
Kultivierung von Chinese-Hamster-Ovary-Zellen
Die Kultivierung der stabilen CHO-Zelllinie erfolgte adhärent in DMEM/F12 mit Gluta-MAX und 10% fötalem Kälberserum unter Zusatz der Antibiotika 50 U/ml Penicillin, 50µg/ml Streptomycin, 0.25 mg/ml Zeocin und 0.6 mg/ml Hygromycin. Je 0.4·106 Zel-len wurden auf 5 ml Kulturmedium in eine T25-Zellkulturflasche eingesät und im
Brut-110