2.1 Funktionale Expression kleiner PACs
2.1.2 Kleine PACs aktivieren cAMP-induzierte Membranströme in Xenopus laevis-Oozytenlaevis-Oozyten
Ein Funktionstest, der die gleichzeitig variable Expression von PAC und einem cAMP-Sensor sowie die zeitaufgelöste Detektion der cAMP-vermittelten Antworten erlaubt, ist der elektrophysiologische Assay in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis. Auf-grund seiner eukaryotischen Natur besitzt er größere Anwendungsrelevanz. Das Prin-zip des Assays beruht auf der Verwendung von cAMP-aktivierbaren Kationenkanälen (CNG-Kanälen), die neben PAC in den Oozyten zur Expression gebracht werden. Licht-abhängige cAMP-Produktion kann daher indirekt über den Zeitverlauf der Membran-leitfähigkeit nachvollzogen werden (Abb. 2.2 A) [145].
Um eine hohe cAMP-Empfindlichkeit sowie Spezifität des Assays zu erreichen, wurde eine mutierte olfaktorische CNG-Kanal Untereinheit aus der Ratte
(CNG-A2-C460W-2 Ergebnisse
E583M) verwendet (zur Verfügung gestellt durch W. Karpen, Oregon) [139]. Die damit erzielbare Sensitivität liegt mit 0.1-5µM cAMP am unteren Ende des physiologischen Konzentrationsbereiches; die Kanäle reagieren etwa 7-mal empfindlicher auf cAMP als auf cGMP.
A B
Abbildung 2.2: PAC-Funktionsassay in Xenopus-Oozytennach [145]
AKoexprimiert man PAC und cAMP-aktivierbare CNG-Kanäle in Oozyten, führt Applikation von Licht zu einer Öffnung der CNG-Kanäle und ruft eine Leitfähigkeitsänderung der Membran hervor. Kurze, negative Spannungspulse bewirken Kationeneinströme, deren zeitlicher Verlauf es erlaubt Änderungen der cAMP-Konzentration elektrophysiologisch zu verfolgen [145].BInjiziert man bPAC- und CNG-Kanal-RNA in einem molekularen Verhältnis von 1:92 in Oozyten, so zieht ein 0.5 s Lichtpuls (blauer Pfeil) einen Anstieg der CNG-Ströme nach sich. Diese Ströme gehen durch die Aktivität endogener Phosphodiesterasen innerhalb von 5 min auf das Ausgangsniveau zurück. Die Spannung der Abfagepulse betrug -40 mV. Das Ergebnis wurde ursprünglich in [156]
publiziert. cthe American Society for Biochemistry and Molecular Biology.
Damit lichtinduzierte CNG-Ströme messbar werden, muss die cAMP-Produktion einer PAC an den Sensitivitätsbereich der Kanäle individuell angepasst werden. Um für den Nachweis der Lichtwirkung optimale Bedingungen zu finden, wurde zunächst das mo-lekulare Injektionsverhältnis von PAC:CNG-RNA im Bereich zwischen 1:200 und 1:1 variiert. Dabei kommt beim Verhältnis 1:200 1 PAC-Molekül auf 200 Kanal-Moleküle.
Die injizierte Menge an Kanal-RNA pro Eizelle betrug standardmäßig 20 ng. Mit dem Ziel, die Belastung für die Zellen durch kontinuierlich einströmende Ionen gering zu halten, wurden alle Messungen in einem diskontinuierlichem Modus ausgeführt: Mittels 100 ms kurzer Spannungs-Pulse wurde die Leitfähigkeit der Membran abgefragt. Die ge-messenen Stromwerte wurden im zeitlichen Verlauf dargestellt. Alle hier beschriebenen elektrophysiologischen Messungen wurden von Frau Maila Reh ausgeführt.
34
2.1 Funktionale Expression kleiner PACs
bPAC ruft große, langanhaltende Photoströme in Xenopus laevis-Oozyten hervor Exprimiert man bPAC und CNG-Kanäle im RNA-Verhältnis von 1:92, erhält man nach 3 bis 4 Tagen deutliche, lichtinduzierbare Stromsignale. In Abbildung 2.2 B ist eine typi-sche, an einer Oozyte gemessene Stromkurve dargestellt. Die Stromkurve entsteht nach einem 0.5 s langen Lichtimpuls und ergibt sich aus der cAMP-vermittelten Öffnung der CNG-Kanäle. Sie durchläuft nach ca. 50 s einen Maximalwert und geht im Verlaufe von 5 Minuten auf ihr Ausgangsniveau zurück. Dabei zeigt dieses reversible Verhalten die Aktivität endogener Phosphodiesterasen an. An einer Zelle waren durchschnittlich bis zu 5 Wiederholungsmessungen mit reproduzierbar großen Strömen möglich. Die Stan-dardabweichung der Stromamplitude lag bei 264 nA±77 nA (n= 7). Mit zunehmender Anzahl durchgeführter Messungen nahmen der Dunkelstrom und die Stromamplitude zu und zeigten das Absinken des Membranwiderstandes an. In Oozyten derselben Char-ge variierte die Stromamplitude um ca. 25 %.
Unter den gewählten Expressionsbedingungen erwies sich ein bPAC:CNG-Verhältnis von 1:92 als optimal: Während Oozyten, mit geringem bPAC-Anteil keine oder nur schwache lichtabhängige Stromsignale zeigten, führte eine zu starke bPAC-Expression zur Desta-bilisierung der Zellmembran. Letzteres Verhalten kann durch eine basale Enzymaktivität bPACs im Dunkeln verursacht werden. Kontrollmessungen wurden sowohl mit unbehan-delten Oozyten als auch mit Oozyten ausgeführt, die jeweils nur die CNG-Kanäle bzw.
nur die bPACs enthielten. In keinem Fall ergaben sich dabei lichtabhängige Ströme. Der Expressionsnachweis von bPAC erfolgte durch Immunoblotting gegen den C-terminalen Myc-Affinitätsmarker, so dass Messartefakte ausgeschlossen werden können.
Um die Lichtabhängigkeit der Ströme zu zeigen, wurde eine Reihe von Stromkurven bei abgeschwächter Intensität des Anregungslichtes aufgenommen (Abbildung 2.3 A). Dabei ergab sich, dass die Amplituden der Stromkurven zur produzierten cAMP-Menge und damit zur Lichtmenge proportional sind. Eine Sättigung der CNG-Ströme durch cAMP wurde bei der verwendeten Photonenflussrate (0.85 mMol·m−2s−1) nicht erreicht. Wegen der begrenzten Belastbarkeit einer Oozyte konnte der kinetische Verlauf nicht detaillier-ter aufgeschlüsselt werden; es deutet sich aber an, dass bei geringen Lichtintensitäten die Dauer der Stromantworten nur im schwachem Maß von der applizierten Lichtmenge abhängt.
Mehrfache Anregung der Zellen mit 400 ms-Lichtpulsen bewirkte eine gleichmäßige Stei-gerung des Photostromes auf bis zu -900 nA (Abbildung 2.3 B). Das Abklingen des Stromes bleibt davon unbeeinflusst. Die Ergebnisse zeigen, dass die Stärke der licht-induzierten Zellantwort über die Lichtdosis eingestellt werden kann.
2 Ergebnisse
A B
Abbildung 2.3:bPAC-vermittelte Photoströme sind durch die Lichtdosis ti-trierbar
A Lichtinduzierte CNG-Ströme nach Applikation eines 400 ms Lichtpulses (blauer Pfeil) un-terschiedlicher Intensität (0.85, 0.42, 0.21 und 0.04 mMol·m−2s−1). Die Maximalwerte der CNG-Ströme steigen mit zunehmender Lichtdosis (Ausschnitt). Die gepulsten Messungen wurden nach 4 Tagen in einzelnen bPAC- und CNG-Kanal-exprimierenden Oozyten bei einer Spannung von -40 mV durchgeführt.BCNG-Stromkurve nach repetitiver Anregung (blaue Pfeile). Applikation von sechs 400 ms-Lichtpulsen (0.85 mMol·m−2s−1) vergrößert die Amplitude der Stromkurve. Die Messungen wurden nach 7 Tagen Expression bei einer Spannung von -40 mV durchgeführt.
nPAC76 ruft kurzlebige Photoströme, nPAC35 und nPAC75 rufen zeitverzögerte Stromantworten inXenopus laevis-Oozyten hervor
Im Vergleich zu bPAC wurden für die drei untersuchten nPACs nur unter deutlich stärke-ren Expressionsbedingungen reproduzierbare Photoströme erhalten. Wähstärke-rend für bPAC bereits ein molekulares PAC:CNG-Kanal Verhältnis von 1:92 zu optimalen Stromantwor-ten führt, steigt für nPAC75 der PAC-RNA-Anteil auf 1:15, für nPAC35 und nPAC76 auf 1:5 (Tabelle 2.4 A). Ein hoher PAC-Anteil deutet auf eine geringe PAC-Aktivität hin; nicht berücksichtigt ist bei dieser Abschätzung z.B. die Auswirkung unterschiedli-cher Expressionsstärken.
In Abb. 2.4 B sind die mit den drei nPACs erhaltenen Stromantworten dargestellt. Für nPAC76 ergeben sich mit ca. -200 nA CNG-Ströme, die mit denen von bPAC vergleichbar sind. Abweichend davon wird der maximale Stromwert bereits nach einem Fünftel der für bPAC notwendigen Zeit erreicht. Der Rückgang auf das Ausgangsniveau erfolgt in-nerhalb von 40 s; nPAC76-vermittelte Stromantworten sind damit deutlich kurzlebiger.
Die im Vergleich zu bPAC reduzierte Ladungsmenge weist auf eine geringere cAMP-Produktion von nPAC76 hin. Für nPAC35 und nPAC75 ergeben sich mit -700 nA bis zu -1600 nA deutlich größere lichtabhängige Ströme.
36
2.1 Funktionale Expression kleiner PACs
RNA molekulares Verhältnis PAC:CNG-Kanal
bPAC 1:92
nPAC75 1:15
nPAC35 1:5
nPAC76 1:5
A B
Abbildung 2.4: Injektionsverhältnisse und nPAC-vermittelte Photoströme in Xenopus-Oozyten
AMolekulare Injektionsverhältnisse für PAC- und Kanal-RNA. Aufgelistet sind die optimierten RNA-Injektionsverhältnisse PAC:Kanal (Anzahl an PAC-Molekülen zu Anzahl an CNG-Kanal-Molekülen), die zu größtmöglichen lichtinduzierten Strömen geführt haben. B Lichtin-duzierte CNG-Ströme hervorgerufen durch nPAC76 (rote Kurve), nPAC35 (blaue Kurve) und nPAC75 (grüne Kurve). Die Messungen wurden nach 5 Tagen Expression, 2 s Licht mit einem 50 % Graufilter (nPAC76), nach 4 Tagen Expression, 300 ms Licht mit einem 60 % Graufilter (nPAC35) und nach 2 Expressionstagen, 50 s Licht mit einem 50 % Graufilter (nPAC75) un-ter den in Aangegebenen RNA-Injektionsverhältnissen bei einer Abfragespannung von -40 mV erhalten. Der blaue Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Lichtpulse an.
Kontrollen, die ausschließlich CNG-Kanäle exprimieren, zeigen im Messzeitraum keine vergleichbaren Ströme. Die detektierten Stromantworten sind daher auf die Wirkung der PACs zurückzuführen. Ihre Amplituden können jedoch nur teilweise durch den höheren PAC-Anteil begründet werden. Gleichzeitig sprechen die Ströme erst nach ca. einer Mi-nute auf den Lichtpuls an und erreichen die Strommaxima nach weiteren 6 min (nPAC35) bzw. nach 34 min (nPAC75). Dieses unerwartete Verhalten kann anhand der vorliegen-den experimentellen Daten nicht erklärt wervorliegen-den. Es ist aber wahrscheinlich, dass der durch die lange Messdauer deutlich gesteigerte Calcium-Einstrom Sekundäreffekte pro-voziert. Während eine Calcium-Calmodulin induzierte Inaktivierung der CNG-Kanäle eine Reduktion der Stromamplitude zur Folge haben müsste, ist eine zeitlich verzöger-te Überlagerung durch Calcium aktivierverzöger-te Chlorid-Ströme als Ursache denkbar. Da die voltage-clamp Methode nur Nettoströme erfasst, kann eine Beteiligung anderer Ionen-kanäle nicht von den CNG-Strömen separiert werden. Der Kurvenverlauf deutet auf eine lichtinitiierte Aktivität durch nPAC75 und nPAC35 hin; diese kann aber auf Grundlage der Oozyten-Experimente nicht eindeutig nachgewiesen werden.
2 Ergebnisse
Über den bakteriellen Assay hinaus ist im elektrophysiologischen Oozyten-Assay der Nachweis gelungen, dass bPAC und nPAC76 photoaktivierte Adenylatzyklasen sind. Aus dem Zeitverlauf der lichtinduzierten CNG-Ströme, sowie aus den ermittelten Injektions-verhältnissen lässt sich vermuten, dass bPAC die größte Aktivität besitzt.
2.1.3 Kleine PACs aktivieren cAMP-vermittelte Lumineszenz in Chinese-Hamster-Ovary-Zellen
Da Optogenetik speziell im humanmedizinischen Bereich großes Anwendungspotenzi-al besitzt, wurden auch Säugerzellen in die Verwendung miteinbezogen. Säugerzellen verfügen über das größte Maß an biochemischer Komplexität, gleichzeitig ist ihre Kul-tivierung anspruchsvoll und kostenintensiv. Um einen Funktionstest zu erhalten, der möglichst selektiv cAMP-induzierte Effekte wiedergibt, wurde ein CNG-basierter Assay in einer adhärent kultivierten Chinese-Hamster-Ovary Reporterzelllinie von Dr. Frank Wunder (Fa. Bayer) durchgeführt [186]. Diese exprimiert neben CNG-Kanälen auch den Calcium-Lumineszenz-Reporter Aequorin stabil. CNG-Kanäle kommen nativ als funk-tionelle Heterotetramere vor. Durch die Kombination von drei unterschiedlichen CNG-Einheiten (CNG-A4, CNG-A2-T537A und CNG-B1b) aus dem olfaktorischen Organ von Bos bovis erzielt dieser Assay eine cAMP-Empfindlichkeit, die durch eine pEC50 (negativer Logarithmus der molaren Konzentration von Forskolin, die die halbmaxima-le Aequorin-Lumineszenz stimuliert) von 6.6 charakterisiert ist und als hoch eingestuft wurde.
Das Prinzip des Assays beruht auf dem Nachweis eines cAMP-induzierten und CNG-vermittelten Anstiegs der intrazellulären Calcium-Konzentration durch Aequorin (siehe Abbildung 2.5). Photoaktivierung von PAC startet diese Signalkaskade und führt un-ter Zugabe von Calcium und in Anwesenheit des Aequorin-Substrates Coelenun-terazin zu blauer Lumineszenz.
Um die Expression von PAC quantitativ abschätzen zu können, wurden die PAC-Gene C-terminal mit einem rot-fluoreszierenden Protein (mCherry) markiert. Dies ermöglicht die durch PAC ausgelöste Lumineszenz auf die Expressionsstärke zu normieren. Zu-nächst wurden kultivierte CHO-Zellen mit den PAC-Genen transient transfiziert und ihre Transfektionseffizienz anhand der Fluoreszenz optimiert. Der Anteil transfizierter Zellen lag bei allen vier Konstrukten im Schnitt bei ca. 35 %. Vor jeder Messung wurde die Expressionsstärke über die mCherry-Fluoreszenz bestimmt. Die Lumineszenz wur-de in Platten mit 96 Vertiefungen an einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Da eine Wellenlängen-spezifische PAC-Anregung bei hoher Lichtintensität in dem Gerät nicht
38
2.1 Funktionale Expression kleiner PACs
450nm
ATP cAMP
Abbildung 2.5:PAC-Funktionsassay in CHO-Reporterzellen [186]
In der Reporterzelllinie, die Kanäle und Aequorin stabil exprimiert, vermitteln CNG-Kanäle cAMP-abhängig einen Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration. Dieser Anstieg ruft blaue Lumineszenz des Calcium-Bindeproteins Aequorin unter Verbrauch seines Substrates Coelenterazin hervor.
möglich war, erfolgte die Belichtung extern durch eine blaue LED. Zwischen Anregung und Auslesebeginn ergab sich daraus ein 10 s Zeitversatz, der auf das Einfahren der Platte zurückgeht und den initialen Lumineszenz-Anstieg überdeckt. Aus diesem Grund wurden die Messungen im „Inkubationsmodus“ durchgeführt: CHO-Zellen wurden ex-tern vorbelichtet; die Calcium-abhängige Lumineszenz-Reaktion wurde im Anschluss durch Geräte-interne Injektion von Calcium gestartet. Da es sich bei dem beschriebe-nen Verfahren um Messungen an Zellpopulatiobeschriebe-nen handelt, ist die Aussage des Assays statistisch.
bPAC ruft lang anhaltende, cAMP-vermittelte Lumineszenzeffekte in CHO-Zellen hervor
Am ersten Tag nach Transfektion löst 10 s-Belichtung einen Anstieg der Lumineszenz in bPAC-exprimierenden CHO-Reporterzellen aus (Abbildung 2.6). Die Lumineszenz er-reicht im Verlauf von 2 s ihr Maximum und klingt innerhalb von 1 min wieder ab. Zur Kontrolle wurde Calcium zu unbelichteten transfizierten Zellen hinzugegeben. Dies er-zeugt spontane Lumineszenz, die aber nur einen Anteil von 10 % am lichtabhängigen Gesamtsignal hat und als Hintergrundsignal betrachtet wird.
Die Befunde bestätigen die Funktion von bPAC als photoaktivierte Adenylatzyklase. Die lichtinduzierte cAMP-Produktion ist ausreichend, um die biochemische Signalkaskade zu initiieren. Die kurzlebige Natur des Lumineszenz-Signals kann den Einfluss
verschiede-2 Ergebnisse
ner Faktoren reflektieren. Als Ursachen sind der cAMP-Abbau durch endogene Phos-phodiesterasen, eine Calmodulin-abhängige Inhibierung der CNG-Kanäle oder auch der Verbrauch von Aequorin denkbar. Aufgrund der irreversiblen Substrat-Umsetzung und seiner langen Regenerationsdauer kann jedes Aequorin-Molekül nur einmalig ein Photon emittieren.
A B
Abbildung 2.6:Optische Kontrolle des cAMP-Spiegels in CHO-Zellen durch bPAC
ACalcium-Zugabe zu vorbelichteten, bPAC-exprimierendenCHO-Zellen (blaue Kurve) im Ge-gensatz zu dunkeladaptierten Zellen (schwarze Kurve) ruft einen 1-minütigen Anstieg der Lumi-neszenz hervor. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichung (n= 8).BVerhalten der Ge-samtlumineszenz bei zeitlich verzögerter Calcium-Zugabe. Die GeGe-samtlumineszenz nimmt nach bPAC-Anregung mit zunehmend verzögerter Calcium-Zugabe ab. Das Abklingverhalten spiegelt den Abbau des cAMPs durch endogene Phosphodiesterasen wider (RLU, relative light units).
Die Lumineszenz wurde auf die mCherry-Fluoreszenz bei 610 nm bezogen. Die blauen Balken zeigen die Belichtung an.
Um eine Abschätzung für den durch bPAC erzeugten cAMP-Verlauf inCHO-Zellen zu erhalten, wurde als Maß für die cAMP-Menge die Gesamtlumineszenz durch Calcium-Zugabe zu verschiedenen Zeiten nach Belichtung bestimmt. Das durch 10 s-Belichtung entstehende cAMP wird inCHO-Zellen über eine Zeitraum von 10 min abgebaut (Abbil-dung 2.6 B). Das Lumineszenzsignal erinnert im Verlauf an bPAC-vermittelte Photoströ-me in Oozyten; der cAMP-Abbau durch die zellspezifischen Phosphodiesterasen erfolgt langsam und kann damit als Ursache für die kurzlebige Natur des Lumineszenz-Signals ausgeschlossen werden.
40
2.1 Funktionale Expression kleiner PACs
nPACs rufen cAMP-vermittelte Lumineszenz in CHO-Zellen nur nach minutenlanger Vorbelichtung hervor
Unter bPAC-äquivalenten Expressions- und Messbedingungen wurden für nPAC76, nPAC35 und nPAC75 keine lichtinduzierten Effekte gemessen. Lumineszenz-Werte ober-halb der Dunkelkontrolle konnten in nPAC-exprimierenden CHO-Zellen erst nach be-trächtlicher Verlängerung der Anregungszeit erhalten werden. Für nPAC76 war eine An-regungszeit von 2 min, für nPAC35 und nPAC75 waren jeweils 20 min erforderlich. Um den Einfluss variabler Expressionstärken auszugleichen, wurde in Abbildung 2.7 B die Lu-mineszenz auf die mCherry-Fluoreszenz normiert. In nicht-transfizierten Zellen bewirkte die extensive Belichtung keine Lumineszenz-Effekte. Die Hintergrund-Lumineszenz ist vergleichbar der Lumineszenz in den Dunkelkontrollen (Abbildung 2.7 A). Dies belegt, dass auch die drei nPACs lichtabhängig die CNG-vermittelte Signalkaskade aktivieren können und dass es sich um funktionelle PACs handelt. Die vergleichsweise geringe Si-gnalamplitude weist auf geringe cAMP-Produktion in Folge schwacher Adenylatzyklase-Aktivität von nPAC76, nPAC35 und nPAC75 hin.
A B
20 min 2 Tage 20 min
1 Tag
2 min 1 Tag
10 s 1 Tag
Abbildung 2.7: PAC-vermittelte Lumineszenz in CHO-Zellen
A In nPAC35-exprimierenden CHO-Zellen führt eine Vorbelichtung von 20 min und Calcium-Zugabe zu einem geringen Lumineszenzanstieg (blaue Kreise) gegenüber der Dunkelkontrolle (schwarze Kreise) und der Kontrolle in nicht-transfizierten Zellen (helle Dreiecke). Der blaue Balken zeigt die Belichtung an. B bPAC und nPACs rufen unter den Bedingungen 20 min Licht, 2 Tage Expression (nPAC75, grün), 20 min Licht, 1 Tag Expression (nPAC35, blau), 2 min Licht, 1 Tag Expression (nPAC76, rot) und 10 s Licht, 1 Tag Expression (bPAC, grau) in CHO-Reporterzellen Lumineszenzeffekte hervor. Die Lumineszenzeinheiten (RLU, relative light units) sind auf die mCherry-Fluoreszenz beiλ=610 nm normiert.
Die Analyse der vier PACs im CHO-Test bestätigt, dass alle kleinen PACs funktionell regulierte Adenylatzyklasen sind. Darüber hinaus zeigen bPAC und nPAC76 die
deut-2 Ergebnisse
lichste Lichtabhängigkeit. Aufgrund der Stärke der lichtinduzierten Zellantworten im bakteriellen Genreporter-Assay, im elektrophysiologischen Oozyten-Assay und im Funk-tionstest in CHO-Zellen ist festzuhalten, dass bPAC die stärksten Lichteffekte hervor-ruft und daher die größte Aktivität besitzt. Aufgrund unterschiedlicher Zeitverläufe der Lichteffekte lässt sich vermuten, dass die vier PACs zudem unterschiedliche enzymati-sche Eigenschaften hinsichtlich Kinetik und Licht-Dunkel-Verhältnis besitzen. Für die optogenetische Anwendung hat bPAC soweit das größte Potenzial.
Da Funktionstests in lebenden Zellen immer eine durch die zelluläre Umgebung modi-fizierte und meist abgeschwächte Aktivität des Enzyms wiedergeben, wird im nächsten Schritt eine biochemische und biophysikalische Charakterisierung der Enzyme unter de-finierten Bedingungenin vitro angestrebt. Dazu wurde an der Gewinnung von rekombi-nantem Protein gearbeitet; die Ergebnisse sind im Folgenden beschrieben.