Gewinnung rekombinanter PACs aus Escherichia coli

Da die funktionelle Expression kleiner PACs in E. coli bereits auf MacConkey-Agar gezeigt ist, wird die Überproduktion und Aufreinigung aus dem gängigen, bakteriellen Expressionssystem versucht. E. coli ist attraktiv aufgrund seines schnellen Wachstums zu hohen Zelldichten, der großen Anzahl an regulierbaren Expressionsvektoren und be-darfsgerecht modifizierten Wirtsstämmen. Sein Unvermögen zur Ausführung posttrans-lationaler Modifikationen wie z.B. Glykosylierung scheint die Aktivität kleiner PACs

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2.2 Charakterisierung kleiner PACsin vitro nicht zu beeinträchtigen. Die Neigung von E. coli zur Bildung unlöslichen, fehlgefalte-ten Proteins in Form von Einschlusskörpern (inclusion bodies) erweist sich häufig als problematisch.

Heterologe Expression und Aufreinigung am Beispiel von bPAC

Das erarbeitete Verfahren zur heterologen Expression und Aufreinigung kleiner PACs wird im Folgenden exemplarisch am Beispiel von bPAC dargestellt: Zunächst wurde die Überproduktion des bPAC-Gens in einem pET28(a)-Expressionsplasmid in Verbindung mit dem E. coli-Laborstamm BL21(DE3) versucht [107]. Das Konstrukt enthielt einen N-terminalen 6-fach Polyhistidin-Affinitätsmarker und die E. coli adaptierte Sequenz, die zwischen die NdeI und HindIII Restriktionsschnittstelle kloniert war, und unter-steht der Kontrolle des lac-induzierbaren T7-Promoters [126]. Diese Kombination er-laubt nach Zugabe des Induktors IPTG die selektive Transkription von bPAC durch die ebenfalls IPTG-induzierte, chromosomal codierte T7-RNA-Polymerase. Aufgrund der großen Effektivität der T7-RNA-Polymerase ermöglicht das T7lac-Expressionssystem hohe Expressionslevels, besitzt aber häufig in Verbindung mit komplexen Nährmedien, die Lactose enthalten, den Nachteil einer Basalexpression.

Abbildung 2.8 A zeigt den Verlauf der Aufreinigung auf einem denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gel. Die im Zellhomogenisat bei 40 kDa nur schwach erkennbare Über-expressionsbande von bPAC ist nach Zentrifugation komplett ins Pellet übergegangen.

Auf diese Weise konnte aus dem Überstand kein lösliches bPAC präpariert werden.

Verbesserung der Ausbeute an löslichem bPAC

Eine Möglichkeit um Faltung und Löslichkeit rekombinanter Proteine zu verbessern, ist Expression in Verbindung mit einem N-terminalen Fusionsprotein. Löslichkeits-vermit-telnde Fusionsproteine fördern die natürliche Proteinfaltung, indem sie das Protein in Lösung halten und faktisch als Faltungskeim dienen. Aufgrund seiner geringen Größe wurde das 11.6 kDa große small ubiquitine-related-modifier(SUMO)-Protein verwendet.

SUMO ist ein in Eukaryoten weit verbreitetes Protein zur Modulation von Proteinstruk-tur und Funktion [65] und hat die Fähigkeit, die Expression rekombinanter Proteine zu erhöhen und deren Löslichkeit zu verbessern [94]. SUMO kann durch die SUMO-Protease abgespalten werden; die Trennung beruht auf der Erkennung von Tertiärstruktur und ist daher hochspezifisch.

Für die Expression als SUMO-Fusionskonstrukt wurde dasE.coli adaptierte bPAC-Gen überBamHI undHind III in den pET-SUMO-Vektor kloniert und unter den gleichen

Be-2 Ergebnisse

pET28a-ec_bPAC pETSUMO-ec_bPAC pET28a-ec_bPAC mit Chaperon

M H P L K M H P L K M H P L K

Abbildung 2.8:Präparation von bPAC aus E. coli unter Verwendung ver-schiedener Expressionskonstrukte

Die SDS-Gele dokumentieren die Präparationsverläufe von bPAC in Form der Expressions-konstrukte pET28(a) (A), pET-SUMO (B) und pET28(a) plus Chaperon (C) aus E. coli BL21(DE3). Aufgetragen wurden jeweils Marker (M), homogenisierte Zellfraktion (H), Zellpellet nach Ultrazentrifugation (P), lösliche Fraktion nach Ultrazentrifugation (L) sowie dialysiertes und aufkonzentriertes Eluat (K). Die Pfeile weisen auf die Banden an löslichem bPAC bei der zu erwartenden Größe des Konstruktes (A und C: 40.0 kDa, B: 53.6 kDa) hin.

dingungen wie zuvor exprimiert und gereinigt. Der Präparationsverlauf (Abbildung 2.8 B) zeigt eine starke Überexpression bei der zu erwartenden Größe des Konstruktes von 53.6 kDa. Der Großteil davon erscheint jedoch erneut als unlösliches Protein in der Pel-letfraktion und ist im löslichen Überstand nicht als Einzelbande wahrnehmbar. Dennoch erhöht die Anwesenheit des SUMO-Motives die Löslichkeit des Konstruktes, sodass ein kleiner Anteil lösliches SUMO-bPAC aufgereinigt werden kann. Das konzentrierte Eluat zeigt neben der Bande von SUMO-bPAC noch zwei weitere in der Präparation ent-haltene Proteinbanden bei 72 und 20 kDa. Diese Banden zeigen vermutlich Verunrei-nigungen mit unspezifischer Affinität zum Säulenmaterial z.B. Hitzeschockproteine an.

Die 72 kDa-Bande kann allerdings auch auf assoziiertes bPAC oder auf stabile Dime-re zurückgehen. Im Fall der kleineDime-ren Bande ist auch das Vorhandensein von bPAC-Bruchstücken möglich. Falls es sich dabei nicht zufällig um Proteine mit intrinsischer Adenylatzyklase-Aktivität handelt, ist die Anwesenheit dieser Verunreinigungen für die weiteren geplanten spektroskopischen und biochemischen Untersuchungen weitestgehend unerheblich. Eine Erhöhung des Kultiviervolumens auf 6 l ermöglichte die Reinigung re-kombinanten bPACs mit einer Ausbeute von etwa 0.17 mg pro 10 g Zellmaterial. Diese Menge ist gering, für grundlegende biochemische und spektroskopische Untersuchungen doch zunächst ausreichend.

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2.2 Charakterisierung kleiner PACs in vitro Zu einem fortgeschrittenen Zeitpunkt der Arbeit wurde im Rahmen der Kooperation mit der AG Schlichting (MPI Heidelberg) ein BL21(DE3)-Expressionsstamm erhalten, der zusätzlich ein Chaperon-codierendes Plasmid enthält (eigene Konstruktion, E. Hart-mann). Chaperone sind als Helferproteine in den Faltungsprozess involviert; ihre Ko-expression trägt häufig zur verbesserten Löslichkeit rekombinanter Proteine bei [59].

Erneut enthält das konzentrierte Eluat eine zusätzliche Bande bei 53 kDa. In diesem Fall handelt es sich um eine Verunreinigung durch Chaperone (pers. Kommunikation, E.

Hartmann). Unter Verwendung des Chaperon-Stammes erzielt die Überproduktion des Konstruktes pET28-bPAC einen Ertrag von 1.7 mg pro 10 g Zellen. Das entspricht der 10-fachen Menge bPAC gegenüber dem SUMO-Konstrukt (siehe Tabelle 2.9).

Gewinnung von rekombinanten nPACs

Aufgrund des positiven Einflusses von SUMO auf die Löslichkeit von bPAC wurden auch die nPAC-Gene unter Verwendung der BamHI undHindIII-Schnittstellen in pET-SUMO kloniert und unter den für bPAC gefundenen Bedingungen zur Expression ge-bracht. Die Präparation ergab für alle drei nPACs lösliches Protein (nicht gezeigt). Die Ausbeuten von nPAC35 und nPAC75 waren mit<1 mg pro 10 g gering und vergleichbar zu bPAC (siehe Tabelle 2.9); nPAC76 konnte in deutlich größerer Menge von 20 mg pro 10 g Zellen aufgereinigt werden.

Um den Einfluss des SUMOs auf die Löslichkeit der Proteine abschätzen zu können, wurde die Expression des gut löslichen nPAC76 ohne N-terminale Fusion getestet.

Protein Expressionsvektor Ausbeute [mg/10g Zellen]

bPAC pET-SUMO

pET28a plus Chaperon 0.17 1.7

nPAC75 pET-SUMO 0.65

nPAC35 pET-SUMO 0.93

nPAC76 pET-SUMO pET28a pASK43p

2.420 10

Abbildung 2.9: Proteinausbeuten aus verschiedenen Expressionskonstrukten Die Tabelle gibt die PAC-Ausbeuten an, die unter Verwendung des jeweiligen Expressionsvektors bei vergleichbaren Expressions-und Präparationsbedingungen aus E. coli BL21(DE3) erhalten wurden.

Zu diesem Zweck wurde nPAC76 nach dem N-terminalen 6-fach Polyhistidin-Affinitäts-marker über BamHI und XhoI zum einen in pET28, zum anderen in pASK43p

einge-2 Ergebnisse

führt. Im Gegensatz zum T7lac-Expressionssystem erfolgt die Regulation der Expres-sion in pASK mit einem Tetrazyklin (tet)-induzierbaren Promoter, der unabhängig von genetischen Hintergrund des Expressionsstammes durch die E. coli eigene Polymerase abgelesen wird [153]. Der Vorteil des Systems für die Expression schwer löslicher Proteine ist eine im Vergleich zur T7-RNA-Polymerase geringere Prozessivität und eine geringe Basalexpression.

Beide Konstrukte wurden unter vergleichbaren Bedingungen überproduziert und auf-gereinigt. Die Ausbeute an nPAC76 aus pET beträgt 2.4 mg pro 10 g Zellmaterial, die Ausbeute aus pASK43 beträgt durchschnittlich 10 mg nPAC76 pro 10 g Zellmaterial (Ta-belle 2.9). Unter Verwendung des pASK-Systems wird demnach die 4-fache Menge an löslichem Protein erhalten. Diese Menge ist ausreichend, um eine genauere spektroskopi-sche Analyse ihrer Photochemie und Thermostabilität vorzunehmen. Die entsprechenden Arbeiten wurden von Herrn Prof. Alfons Penzkofer (Universität Regensburg) durchge-führt (siehe Kapitel 2.2.3).

bPAC bildet in Lösung Dimere

Um den oligomeren Zustand und die Reinheit der präparierten Proteine beurteilen zu können, wurde die Größe von BLUF (bPAC), bPAC und der SUMO-bPAC Varian-te Y7F mitVarian-tels Größenausschlusschromatographie bestimmt. bPAC-BLUF (ResVarian-te 1 bis 125), bPAC sowie SUMO-bPAC-Y7F eluieren mit ihrem Hauptpeak bei 52.6, 57.7 und 59.8 min (Abb. 2.10 A).

A B

0 100

Abbildung 2.10:Bestimmung der molekularen Größe von bPAC und Varian-ten mittels Größenausschlusschromatographie

A Elutionsprofile von bPAC (rot), bPAC-BLUF (blau) und SUMO-bPAC-Y7F (grün). B Die Ferguson-Darstellung mit Standardproteinen und bPAC-Proben. Die Analyse ergibt für bPAC, bPAC-BLUF und SUMO-bPAC-Y7F eine scheinbare, molekulare Masse von 47, 60 und 80 kDa.

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2.2 Charakterisierung kleiner PACsin vitro Das Chromatogramm von SUMO-bPAC-Y7F zeigt zusätzlich eine Schulter bei 56.4 min und eine weitere Bande bei 60.9 min. Diese weisen auf ein heterogen vorliegendes Protein oder auf Verunreinigungen bzw. Bruchstücke in der Präparation hin. Aus der Ferguson-Darstellung mit den Standardproteinen Rinderserumalbumin, Ovalbumin, α-Amylase und Lysozym (Abb. 2.10 B) wird die scheinbare, molekulare Masse von BLUF (Monomer:

17 kDa) auf 47 kDa, von bPAC (Monomer: 40.0 kDa) auf 59.9 kDa und von SUMO-bPAC-Y7F (Monomer: 53.6 kDa) auf 79 kDa bestimmt. Es ist daher wahrscheinlich, dass bPAC und SUMO-bPAC als Dimer in Lösung vorliegen. Die BLUF-Domäne alleine scheint dagegen Trimere auszubilden. Da das Elutionsverhalten der Proteine wesentlich durch ihren hydrodynamischen Radius bestimmt wird, sind Abweichungen vom tatsächlichen Molekulargewicht denkbar.