bPAC im Vergleich mit optogenetischen Werkzeugen und cAMP-StimulatorencAMP-Stimulatoren

Misst man bPAC an den allgemein wünschenswerten Anforderungen eines optogene-tischen Werkzeuges, so besitzt bPAC die Vorteile der geneoptogene-tischen Kodierbarkeit, der natürlichen Kofaktorverfügbarkeit und -stabilität, eines einfachen Aufbaus und einer kleinen Größe. Es kann nahezu unbegrenzt wiederholt und zeitlich definiert geschaltet werden. Dabei erfolgt die Photoaktivierung im Subsekundenbereich und verläuft ähnlich schnell wie die anderer Flavin-basierter Werkzeuge [70, 185]. Die Inaktivierung ist jedoch zumindest im Vergleich mit vielen Kanalrhodopsinen (5 ms bis 100 ms) und OptoXRs (Subsekundenbereich) sowie mit euPACα vergleichsweise langsam, und limitiert die Ge-nauigkeit der Stimulation. In bestimmten Kanalrhodopsin-2 Varianten besteht zudem die Möglichkeit zur lichtinduzierten und Wellenlängen-spezifischen Inaktivierung: Durch Anregung mit grünem Licht kann hier eine Überführung des leitenden Zustandes in den Grundzustand und damit die unmittelbare Kanalschließung induziert werden. In BLUF-Photorezeptoren existiert die Option zur photoinduzierten Rückreaktion nicht [102, 167].

Eine auf definierte Zellbereiche beschränkte cAMP-Kontrolle wurde durch bPAC bislang nicht getestet und ist aufgrund der diffusiblen Natur von cAMP vermutlich nur einge-schränkt möglich.

Besonders wichtig für die erfolgreiche Anwendung eines lichtregulierten Enzyms ist die in vivo erzielbare dynamische Breite. Typische Licht-zu-Dunkelverhältnisse isolierter, Flavin-basierter Photorezeptoren liegen im Bereich bis 10:1 [5, 103, 185]. Die für bPAC gefundene 240-fache Aktivierung in Verbindung mit ihrer geringen Dunkelaktivität qua-lifizieren sie als lichtsensitives, effektives Werkzeug. Eine 1000-fache und damit erheb-lich größere Aktivitätssteigerung im Licht besitzt ledigerheb-lich die LOV-regulierte Histidin-Kinase YF1 [109]. Aufgrund fehlender Zielproteine ist sie in Eukaryoten jedoch nicht nutzbar. Besonders geringe Lichtintensitäten (< 1µW·cm⁻²) erfordert daneben auch das natürliche Gαs-gekoppelte Opsin aus der Qualle Carybdea rastonii (JellyOP). Seine Fähigkeit zur repetitiven und zeitlich steuerbaren Manipulation von cAMP-Konzentra-tionen wurde in Säugerzellen demonstriert [4]. Die effiziente Lichtwahrnehmung geht größtenteils auf die Absorptionseigenschaften des Retinals zurück, dessen

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3.4 bPAC im Vergleich mit optogenetischen Werkzeugen und cAMP-Stimulatoren

koeffizient mit ca. 60000 M⁻¹cm⁻¹) deutlich größer als der von Flavin (12000 M⁻¹cm⁻¹) ist. Die in HEK293-Zellen erzielten Anstiege erreichten im Verlauf von wenigen Mi-nuten einen Maximalwert von 7µM cAMP und gingen im gleichen Zeitbereich wieder zurück. Ob dieser Ansatz auch zur Ansteuerung cAMP-abhängiger Signalwege in an-deren Zellsystemen geeignet ist, bleibt zu zeigen. Aufgrund seiner Membranständigkeit kommt JellyOP, wie auch andere GPCRs, speziell zur Kontrolle von cAMP in membran-assoziierten Kompartimenten in Frage. Im Unterschied dazu wird mit bPAC primär das zytosolische cAMP-Level kontrolliert.

Neben dem klassisch-pharmakologischen und dem optogenetischen Ansatz (siehe auch Tab. 3.4) führten Sample und Kollegen eine Methode zur Manipulation von cAMP in verschiedenen Kompartimenten unter Verwendung einer Bicarbonat aktivierbaren Ade-nylatzyklase (SMICUS, spatiotemporal manipulation of intracellular cAMP using sAC) ein [144]. Um subzelluläre Lokalisation im Zytosol, in den Kern und in die Plasma-membran zu erreichen, wurde die verkürzte katalytische Einheit der löslichen AC aus der Ratte mit Targetsequenzen versehen. Unter Bicarbonat-Zugabe erzeugten diese do-sierbare Anstiege der lokalen cAMP-Spiegel, die nach Pufferwechsel komplett reversibel waren. Die cAMP-Steigerungen bemaßen sich in einer 30 % igen Änderung des Emissions-verhältnisses zwischen dem Donor und Akzeptor des FRET-basierten cAMP-Indikators und waren ausreichend, um die cAMP-abhängige PKA zu aktivieren. Aktivierung und Inaktivierung erfolgen im Bereich von Sekunden bis Minuten und zeigen die begrenz-te zeitliche Schaltbarkeit auch dieses Sysbegrenz-tems. Vorbegrenz-teilhaft ist die subzelluläre cAMP-Kontrolle, die sich prinzipiell auch auf den optogenetischen Ansatz übertragen lässt . Allgemein lassen sich Methoden zur Manipulation von intrazellulärem cAMP in ge-netisch codierbare und chemisch/ pharmakologische Verfahren einteilen (Tabelle 3.4).

Gegenüber den genetisch codierbaren Verfahren (Optogenetik, SMICUS) beruhen che-mischen Verfahren zur transienten Erhöhung von cAMP auf der exogenen Zugabe von teilweise kostenintensiven Agenzien. Ihre Anwendung ist aus Gründen der Applizierbar-keit und mangelnder Spezifität auf Zellkulturen/ Schnittkulturen beschränkt und kann nur durch erneute Agenzienzugabe wiederholt werden. Aufgrund der initial erforderli-chen Membranpenetration erfolgt der zeitliche Anstieg von cAMP einschleierforderli-chend über mehrere Minuten und ist damit langsam. Allein beim cAMP-Uncaging wird die Freiset-zung von cAMP durch UV-Licht ausgelöst und ermöglicht dadurch eine Bereitstellung innerhalb vonµs bis ms ohne Zellspezifität. Der Einsatz fokussierter Lichtquellen erlaubt in diesem Fall zusätzlich, cAMP-Spiegel auch lokal begrenzt zu erhöhen. Nachteile der genannten Verfahren sind die begrenzte Stabilität der Agenzien sowie insbesondere die

3 Diskussion

Stabilität stabil stabil stabil stabil begrenzt begrenzt

Zellspezifität spezifisch spezifisch spezifisch unspezifisch unspezifisch unspezifisch Zelluläre

lebende Tiere Zellkulturen Zellkulturen Zellkulturen Zellkulturen

Zusätze - Kofaktorgabe - ^{- -}

-Preis - - - 100 €je 5mg 200 €je 5mg 26- 200 €je 5 mg

Genetisch codierbare cAMP-Kontrolle Chemisch/ pharmakologische cAMP-Kontrolle

Abbildung 3.4:Anwendungsmerkmale von bPAC und anderen cAMP-Stimu-latoren

Die Tabelle vergleicht die Eigenschaften genetisch codierbarer Werkzeuge (bPAC, JellyOP [4] und SMICUS [144]) und chemischer Agenzien (Forskolin/IBMX, cAMP Uncaging, cAMP Analoga) zur cAMP-Kontrolle. Die chemischen Agenzien sind allgemein membrangängige Substanzen. (∗) bei starker Überexpression können Effekte aufgund von Dunkelaktivität auftreten.

teilweise toxische Wirkung, die sie selbst oder die im UV-Licht entstehenden Nebenpro-dukte besitzen.

Im Vergleich zur chemischen Manipulation von cAMP zeichnen sich die genetisch co-dierbaren Verfahren durch eine bessere Stabilität der Aktivatoren aus und lassen sich zellspezifisch einbringen. cAMP-Steigerungen können wiederholt, im Falle von SMICUS allerdings auch nur nach wiederholter Zugabe von Bicarbonat ausgelöst werden. Die Verknüpfung der codierbaren Werkzeuge mit speziellen Targetsequenzen in SMICUS ermöglicht zusätzlich, cAMP-abhängige Prozesse in verschiedenen Zellkompartimenten anzusteuern. Dabei ist der Einsatz der biologischen Puffersubstanz Bicarbonat als sti-mulierendes Agens zellphysiologisch besonders verträglich. Andererseits ist genau aus diesem Grund die Anwendung von SMICUS in lebenden Tieren problematisch. Durch die Verwendung von Photorezeptoren als cAMP-manipulierende Werkzeuge werden ge-netische Codierbarkeit und lichtabhängige Stimulation kombiniert. Die Verwendung von Licht als Stimulans ermöglicht zeitlich wie räumlich eine präzisere Kontrolle der Anre-gung. Dadurch sind darüber hinaus lebende Tiere in die Anwendung mit

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