Die elektrophysiologischen Untersuchungen in dieser Dissertation an Glycin-Rezeptoren zeigen erstmalig einfache strukturelle Determinanten von Phenolderivaten auf, die selektiv die Potenz von Phenolderivaten zur Coaktivierung von Glycin-Rezeptoren steigern. Es wird nachgewiesen, dass die Halogenierung eines Phenolderivates mit einem Chlorid in para-Position eine deutliche Steigerung der Potenz zur Coaktivierung des Glycin-Rezeptors bewirkt. Weiterhin kann gezeigt werden, dass eine Coaktivierung des Glycin-Rezeptors durch methylierte Phenolderivate unabhängig von der Anzahl oder der Position der Methyl-Gruppen am Phenolring hervorgerufen wird. Beim GABAA-Rezeptor jedoch ist die Größe der Substituenten in ortho-Position entscheidend für die Aktivierung (Krasowski et al., 2001).
Während eine direkte Aktivierung des GABAA-Rezeptors nur durch in ortho-Position methylierte Phenolderivate bewirkt wird (Mohammadi et al., 2001), wird in dieser Arbeit gezeigt, dass bei der direkten Aktivierung des Glycin-Rezeptors die Anzahl der Substituenten die entscheidende Rolle spielt. Messbare direkte Aktivierung des Glycin-Rezeptors wird nur durch doppelt methylierte Phenolderivate bewirkt, unabhängig von deren Position am Phenolring.
GABAA- und Glycin-Rezeptoren sind die wesentlichen Schaltstellen bei der Übertragung hemmender Signale im ZNS (Laube et al., 2002). GABA ist der wichtigste hemmende Neurotransmitter im Gehirn (McCormick, 1989), Glycin spielt dagegen eine wesentliche Rolle im Rückenmark und im Hirnstamm (Kuhse et al., 1995; Zafra et al., 1997). Während der GABAA-Rezeptor bereits als ein Angriffspunkt verschiedener sedativ- und anxiolytisch-wirkender Medikamente identifiziert wurde (Banks und Pearce, 1999; Belelli et al., 1996;
Hales und Lambert, 1991), steht dies für den Glycin-Rezeptor noch aus. Es wird vermutet, dass Substanzen, die spezifisch Glycin-Rezeptoren erregen, analgetische und muskelrelaxierende Wirkungen vermitteln könnten (Laube et al., 2002).
Alle in dieser Arbeit untersuchten Phenolderivate coaktivieren Chlorid-Ströme an Glycin-Rezeptoren, die durch eine niedrig konzentrierte Glycin-Lösung (10 µM) ausgelöst werden.
Eine entscheidende strukturelle Determinante für die Potenz zur Coaktivierung ist die Halogenierung in para-Position zur Hydroxyl-Gruppe des Phenolringes. Das Hinzufügen einer zweiten Methyl-Gruppe an einen in ortho-Position methylierten Phenolring steigert die Potenz zur Aktivierung des Glycin-Rezeptors jedoch nicht weiter. Auch die Position der Methyl-Gruppen, bezogen auf die Hydroxyl-Gruppe am Phenolring, hat keinen Einfluss auf die Stärke der Coaktivierung. Bei hohen Konzentrationen (> 300 µM) wird bei den
halogenierten Verbindungen (3-Methyl-4-chlorophenol und 3,5-Dimethyl-4-chlorophenol) der coaktivierende Effekt überlagert durch hemmende Effekte, die sich durch eine Reduktion der Stromamplitude im Bereich höherer Konzentrationen und einen beschleunigten Abfall des Stromes nach Aktivierung des Kanals bemerkbar machen. Nach Beendigung der Coapplikation mit einer 1000 µM Glycin-Lösung erfolgt eine erneute Öffnung des Kanals.
Diese Beobachtungenkönnten durch einen Offen-Kanal-Block erklärt werden. Diese Dualität der Effekte (Coaktivierung in niedriger Konzentration, hemmende Effekte in hoher Konzentration) wird bisher sowohl für die Modulation des GABAA-Rezeptors durch inhalative Anästhetika (Banks und Pearce, 1999; Hapfelmeier et al., 2001) als auch für die Modulation des Glycin-Rezeptors durch Propofol (Ahrens et al., 2004; Dong und Xu, 2002) beschrieben. Keine der untersuchten halogenierten Verbindungen bewirkt eine direkte Aktivierung des Rezeptors.
Die Struktur-Wirkungsbeziehung für die Coaktivierung von Glycin-Rezeptoren durch Phenolderivate zeigt deutliche Parallelen zur Blockade spannungsgesteuerter Natrium-Kanäle.
In beiden Fällen bewirkt eine Halogenierung in para-Position eine Steigerung ihrer Wirkung auf den Kanal (Haeseler et al., 2001). Die Konzentrationen für eine halbmaximale Coaktivierung des Glycin-Rezeptors sind jedoch 30-fach (3-Methyl-4-chlorophenol) bzw. 10-fach (3,5-Dimethyl-4-chlorophenol) geringer als die Konzentrationen, die für eine halbmaximale Blockade des Natrium-Kanals benötigt werden (Haeseler et al., 1999; Haeseler et al., 2001). Während eine Halogenierung in para-Position zu einer verstärkten Coaktivierung des Glycin-Rezeptors führt, ist dies nicht der Fall bei einer zweiten Methylierung in meta-Position. Im Gegensatz zum Effekt am Glycin-Rezeptor, steigert eine zweite Methylgruppe in meta-Position aber die Potenz zur Blockade des Natrium-Kanals (Haeseler et al., 2001;
Haeseler und Leuwer, 2002).
Im Falle der nicht halogenierten, zweifach methylierten Phenolderivate (3,5-Dimethylphenol und 2,6-Dimethylphenol) wird die Coaktivierung im gleichen Konzentrationsbereich beobachtet wie die Blockade von Natrium-Kanälen. Eine halbmaximale Blockade von Natrium-Kanälen zeigt sich bei einer Konzentration von 131 µM für 2,6-Dimethylphenol bzw. bei 187 µM für 3,5-Dimethylphenol (Haeseler et al., 2002a; Haeseler und Leuwer, 2002;
Haeseler et al., 2002b). Eine halbmaximale Coaktivierung des Glycin-Rezeptors bewirken 2,6-Dimethylphenol und 3,5-Dimethylphenol in Konzentrationen von 373 ± 51 µM bzw. 308
± 46 µM. Eine direkte Aktivierung des Glycin-Rezeptors zeigen die 2-fach methylierten Verbindungen (3,5-Dimethylphenol und 2,6-Dimethylphenol) nur bei Verwendung von hohen Konzentrationen (> 1000 µM).
Zusammengefasst lässt sich schlussfolgern, dass halogenierte Phenolderivate in sehr niedrigen Konzentrationen zunächst eine Coaktivierung des Glycin-Rezeptors, in höheren Konzentrationen eine Blockade von spannungsgesteuerten Natrium-Kanälen und in sehr hohen Konzentrationen einen Offen-Kanal-Block am Glycin-Rezeptor bewirken. Nicht-halogenierte, 2-fach methylierte Phenolderivate erzeugen in mittleren Konzentrationen eine Coaktivierung am Glycin-Rezeptor, sowie eine Blockade von Natrium-Kanälen. In hohen Konzentrationen aktivieren sie den Glycin-Rezeptor direkt. Nicht-halogenierte Phenolderivate mit nur einer Methylgruppe besitzen potenzierende Effekte am Glycin-Rezeptor in Konzentrationen, in denen sie am Natrium-Kanal nur eine leichte Blockade hervorrufen.
Im Gegensatz zum Glycin-Rezeptor beeinflusst eine Substitution in para-Position die Effekte am GABAA-Rezeptor kaum (Krasowski et al., 2001; Trapani et al., 1998). Die Potenzierung von Strömen am GABAA-Rezeptor hängt wesentlich von der Größe und dem Aufbau der Alkylgruppen in ortho-Position am Phenolring ab (Krasowski et al., 2001). 2,6-Dimethylphenol coaktiviert GABAA-Rezeptoren mit einer halbmaximalen Konzentration von 135 µM (Krasowski et al., 2001) und ist damit nur wenig potenter als am Glycin-Rezeptor (EC50 = 386 µM). Für den Verlust des Aufstell-Reflexes bei Kaulquappen ist es mit Konzentrationen von 60 µM (Krasowski et al., 2001) weniger potent als das Propofol mit Konzentrationen von 1-10 µM (Tonner et al., 1992). In vivo Experimente zeigen, dass 2,6-Dimethylphenol im Bezug auf die Erzeugung einer Hypnose ähnlich potent ist wie das Thiopental und etwa 8-fach weniger potent als Propofol ist (James und Glen, 1980).
Direkte Aktivierung des GABAA-Rezeptors konnte mit in ortho-Position methylierten Verbindungen erreicht werden (Mohammadi et al., 2001). In einer Konzentration von 230 µM bewirkt 2,6-Dimethylphenol eine halbmaximale Direktaktivierung des GABAA-Rezeptors (Mohammadi et al., 2001). Am Glycin-Rezeptor zeigt sich in den Versuchen dieser Dissertation eine halbmaximale Direktaktivierung erst bei einer Konzentration > 1000 µM.
Auch das einfach methylierte Phenolderivat 2-Methylphenol ist in der Lage den GABAA -Rezeptor direkt zu aktivieren (EC50 = 980 µM) (Mohammadi et al., 2001), während es den Glycin-Rezeptor nicht direkt aktiviert.
Die Auswirkungen einer Methylierung in meta-Position auf die Potenz zur Aktivierung des Glycin-Rezeptors werden erstmals in dieser Arbeit untersucht. Phenolderivate, die ihre Methylgruppen in meta-Position tragen, erweisen sich sowohl in der Coaktivierung als auch in der Direktaktivierung als genauso potent wie ihre in ortho-Position methylierten Analoga.
Die Ergebnisse dieser Dissertation lassen erkennen, dass die direkte Aktivierung und die Coaktivierung des Glycin-Rezeptors durch Phenolderivate an bestimmte strukturelle
Voraussetzungen gebunden ist. Eine direkte Aktivierung des Glycin-Rezeptors bewirken lediglich nicht-halogenierte Phenolderivate mit mindestens zwei Methylgruppen. Die Position der Methylierungen bezogen auf die Hydroxyl-Gruppe am Phenolring spielt dabei keine Rolle. Eine Coaktivierung des Glycin-Rezeptors ist äquipotent sowohl durch einfach methylierte als auch durch doppelt methylierte Substanzen möglich. Phenolderivate, die ein Chlorid in para-Position zur Hydroxyl-Gruppe am Phenolring tragen, besitzen eine deutlich gesteigerte Potenz, Chlorid-Ströme an Glycin-Rezeptoren zu coaktivieren.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte von Phenolderivaten auf Glycin-Rezeptoren lassen vermuten, dass es möglich sein könnte, Substanzen zu finden, welche weniger Natrium-Kanäle oder GABAA-Rezeptoren, sondern hauptsächlich Glycin-Rezeptoren beeinflussen.
Eine optimale Kombination antinozizeptiver, muskel-relaxierender und anti-konvulsiver Eigenschaften könnte eine Möglichkeit für eine wirkungsvollere Behandlung von Schmerzen oder Spastiken bieten.
Weitergehende in vivo Studien könnten zeigen, ob dieser in vitro Effekt tatsächlich mit einem antinozizeptiv-spasmolytischen Wirkprofil halogenierter Phenolderivate einhergeht.
5. Zusammenfassung
Glycin spielt eine Hauptrolle als inhibitorischer Transmitter im unteren Hirnstamm und im Rückenmark. Zur Zeit wird vermutet, dass die durch Anästhetika induzierte Analgesie und Immobilisation im Wesentlichen durch die Aktivierung von Glycin- und GABAA -Rezeptoren im Rückenmark vermittelt wird. Phenolderivate bilden eine Gruppe von Verbindungen, die potenziell neuromodulatorische Eigenschaften besitzen, wobei das Anästhetikum Propofol das einzige Phenolderivat aus dieser Gruppe ist, das zur Zeit in klinischem Gebrauch ist.
In dieser Dissertation wird erstmals gezeigt, dass die Aktivierung des Glycin-Rezeptors, wie sie für Propofol beschrieben wird, auch durch andere Phenolderivate ausgelöst werden kann.
Die Glycin-Rezeptoren werden heterolog in menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK 293 Zelllinie) exprimiert. Ihre Beeinflussung durch Phenolderivate wird mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik in whole-cell-Experimenten untersucht.
Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Studien mit Propofol und seinem nicht anästhetisch wirksames Strukturanalogon 2,6-Di-tert-butylphenol weisen nach, dass eine Coaktivierung sowohl durch Propofol als auch durch 2,6-Di-tert-butylphenol im gleichen Konzentrationsbereich induziert wird. Propofol besitzt jedoch - anders als 2,6-Di-tert-butyl-phenol - in höheren Konzentrationen die Fähigkeit zur direkten Aktivierung des Glycin-Rezeptors. Aus den hier gezeigten Ergebnissen der in vitro Experimente mit Propofol und 2,6-Di-tert-butylphenol lässt sich ableiten, dass die Coaktivierung des Glycin-Rezeptors durch Propofol nicht bedeutsam für die Anästhesie ist, obwohl sie in Konzentrationen zu beobachten ist, die als klinisch relevant angesehen werden. Die direkt aktivierenden Effekte des Propofols, die für 2,6-Di-tert-butylphenol nicht nachgewiesen werden können, könnten in vivo in einem neuronalen Netzwerk einen Beitrag zum anästhetischen Effekt leisten. Die Ergebnisse dieser Dissertation führen zu der Annahme, dass die durch Propofol erzeugte Anästhesie über einen anderen Mechanismus als die Coaktivierung des Glycin-Rezeptors entstehen muß.
Die Potenz zur Aktivierung des Glycin-Rezeptors kann auf bestimmte strukturelle Eigenschaften eines Phenolderivates zurückgeführt werden. Halogenierte Phenolderivate, die ein Chlorid in para-Position zur Hydroxyl-Gruppe am Phenolring tragen, sind in der Lage, den Effekt einer niedrig konzentrierten Glycin-Lösung (10 µM) bereits in
Konzentrationen < 10 µM deutlich zu potenzieren. Für den gleichen Effekt sind bei den nicht halogenierten Phenolderivaten 30- bis 50-fach höhere Konzentrationen erforderlich.
Ohne Anwesenheit des natürlichen Agonisten Glycin aktivieren nur die zweifach methylierten Phenolderivate den Rezeptor in sehr hohen Konzentrationen (> 1000 µM) direkt. Die halogenierten und die einfach methylierten Substanzen besitzen diese Fähigkeit nicht. Die Position der Methyl-Gruppen am Phenolring ist ohne Einfluß auf die Potenz zur Coaktivierung.
Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass das entscheidende Strukturmerkmal für eine wirkungsvolle Aktivierung des Glycin-Rezeptors die Halogenierung in para-Position am Phenolring ist. Weitergehende in vivo Studien könnten zeigen, ob dieser in vitro Effekt tatsächlich mit einem antinozizeptiv-spasmolytischen Wirkprofil halogenierter Phenolderivate einhergeht.
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GABA(A) receptor blockade antagonizes the immobilizing action of propofol but not
GABA(A) receptor blockade antagonizes the immobilizing action of propofol but not