5.2.1 Methodik der Probenahme
Da der Dickdarm von Mensch und warmblütigen Tieren als natürliches Habitat von E. coli angesehen wird, basieren die meisten Prävalenzuntersuchungen von VTEC bzw. E. coli O157 auf der Untersuchung von Kotproben bzw. Darminhalt. KEEN und ELDER (2002) konnten in einer Studie bei Mastrindern allerdings zeigen, daß durch Beprobung der Maulhöhle (Tupferproben ohne Flächenbezug) sowie verschiedenen Hautbezirken (Tupferproben von jeweils 500 cm2) höhere Nachweisraten als durch Untersuchung von 10 g Fäzes zu erzielen waren. Überraschenderweise waren
ins-besondere solche Hautpartien besonders stark mit E. coli O157 kontaminiert, welche generell einen relativ geringen Verschmutzungsgrad aufweisen, wie Rücken und Nacken, wohingegen von den häufiger fäkal verschmutzten Partien an Bauch und Hintergliedmaße seltener E. coli O157 isoliert wurden. Eine Erklärung für diese be-merkenswerte Verteilung steht noch aus. Die Autoren geben allerdings zu bedenken, daß die geringere Nachweisbarkeit in Fäzesproben nicht notwendigerweise eine tatsächlich niedrigere Prävalenz widerspiegelt, sondern auch auf eine höhere Nachweisgrenze für die mikrobiell sehr komplex zusammengesetzten Kotproben zurückzuführen sein könnte. Es steht zu vermuten, daß das Vorkommen von E. coli O157 auf der Körperoberfläche von Tieren haltungs- und pflegeabhängig ist und die Ergebnisse von KEEN und ELDER (2002) nicht ohne Weiteres auf die Situation bei Pferden übertragbar sind. Untersuchungen hierzu liegen nicht vor.
Bei der Untersuchung von Fäzes-Material auf E. coli O157:H7 spielt weiterhin die Technik der Probenahme eine Rolle. RICE et al. (2003) konnten bei Rindern de-monstrieren, daß die Beprobung der rektoanalen Schleimhaut mittels Tupfern der Untersuchung von Kotproben (10 g) oftmals überlegen ist. Dies traf insbesondere auf expositionsferne Zeiträume zu, während innerhalb der ersten beiden Wochen nach Exposition sich die Untersuchung von Fäzesproben als sensitiver erwies. Diese Ergebnisse lassen sich anhand des E. coli O157:H7-Kolonisationsmusters im bovinen Magen-Darm-Trakt erklären. Nach NAYLOR et al. (2003) ist das terminale Rektum, welches sich durch eine hohe Dichte an Lymphfollikeln auszeichnet, als dominierende Kolonisierungsstelle für E. coli O157:H7 anzusehen. Dieser Gewebs-tropismus ist u. a. durch die vorliegende Intimin-Variante bestimmt. Für γ-Intimin-tragende E. coli O157:H7-Stämme konnte bereits ein Tropismus für Follikel-asso-ziiertes Epithel aufgezeigt werden (PHILLIPS und FRANKEL, 2000; PHILLIPS et al., 2000). Auch SF E. coli O157:H--Stämme, die in den eigenen Untersuchungen be-sonders berücksichtigt werden sollten, beherbergen die Intimin-Variante γ (KARCH
und BIELASZEWSKA, 2001). Während E. coli O157:H7-Stämme, den dargestellten Er-gebnissen entsprechend, v. a. die Oberfläche der Fäzes kontaminieren, scheinen VTEC anderer Serovare gleichmäßig in den Fäzes verteilt (NAYLOR et al., 2003).
Auch hier ist fraglich, inwieweit sich diese bei Rindern gewonnenen Erkenntnisse auf Pferde übertragen lassen; entsprechende Daten zur Kolonisation bei dieser Tierart liegen nicht vor.
In der Literatur ist bei Pferden und Rindern sowohl die rektale Entnahme von Fäzes-proben (HOLLAND et al., 1996; MØLLER-NIELSEN et al., 2002; RILEY et al., 2003), als auch die Beprobung von frisch abgesetztem Kot beschrieben (HANCOCK et al., 1998;
HEUVELINK et al., 2002; SANDER, 2002; SYNGE et al., 2003). Während die erstge-nannte Methode den Vorteil bietet, ungewollte Kontaminationen aus der Umwelt zu vermeiden, ist sie bei Tieren, die den Umgang mit Menschen nicht gewohnt sind, sowie bei Beprobung großer Tierkollektive kaum durchführbar. Auch in den eigenen Untersuchungen mußte bei lebenden Tieren auf die rektale Entnahme verzichtet werden, da die Pferdebesitzer im Hinblick auf das im Vergleich zu Rindern erhöhte Perforationsrisiko nicht die notwendige Erlaubnis zur rektalen Untersuchung gaben.
5.2.2 Vergleich von Anreicherungsverfahren inklusive
immunomagnetischer Separation (IMS) und Direktausstrich
In der Literatur werden verschiedene Procedere zum selektiven Nachweis von E. coli O157-Stämmen aus Kotproben beschrieben. Mehrere Arbeitsgruppen bescheinigten der Selektivanreicherung eine gesteigerte Sensitivität im Vergleich zu Direktaus-strichverfahren. In der Untersuchung von ZHAO et al. (1995) konnten 48 % aller E. coli O157:H7-positiven bovinen Fäzesproben nur nach Anreicherung in mTSB+N-Bouillon detektiert werden. Eine Selektivanreicherung mittels Vancomycin- und Cefixim-supplementierter TSB-Bouillon verbesserte die Reisolierungsrate von artifi-ziell kontaminierten Rinderkotproben von 37 % auf 80 % und senkte die 50 %-Nach-weisgrenze von 251 KbE/g auf 13 KbE/g (SANDERSON et al., 1995). Artifiziell kontami-nierte Schafkotproben konnten nach Anreicherung mit Cefixim-, Tellurit- und Vanco-mycin-supplementierter TSB-Bouillon bis zu einem Inokulum von 0,06 KbE/g detek-tiert werden, wohingegen im Direktausstrich auch Inokula von 2,4 KbE/g Fäzes nicht reisolierbar waren (KUDVA et al., 1995).
Ebenso wie in der Lebensmitteldiagnostik hat sich auch für die Untersuchung von Kotproben die Anwendung der IMS bewährt. Die Kombination aus Anreicherung und IMS erwies sich in der Studie von CHAPMAN et al. (1994) ca. 100-fach sensitiver als der Direktausstrich. HEUVELINK et al. (1998a) berichteten von einer siebenfachen Steigerung der Isolationsrate im Vergleich zum Anreicherungsverfahren ohne IMS.
SANDERSON et al. (1995) konnten hingegen keine signifikanten Sensitivitätsunter-schiede zwischen Verfahren mit und ohne IMS darstellen.
Die meisten Untersucher verwendeten auch für die Untersuchung von equinen Fäzesproben eine Selektivanreicherung (HEUVELINK et al., 1998b: mEC+N; CHAPMAN
et al., 2000: BPW-VCC; HEUVELINK et al., 2002: mTSB+N) sowie die IMS (CHALMERS
et al., 1997; HEUVELINK et al., 1998b; CHAPMAN et al., 2000; HEUVELINK et al., 2002).
Methodische Vergleichsuntersuchungen für den E. coli O157-Nachweis speziell bei der Tierart Pferd liegen jedoch nicht vor. Aus diesem Grund wurden in der ersten Phase der eigenen Untersuchungen alle Proben parallel mit drei verschiedenen Verfahren untersucht, um die Methodenkaskade zu optimieren. Als Anreicherungs-medien wurden die GN-Bouillon nach HAJNA sowie die mTSB-Bouillon gewählt.
Erstere zeigte sich in der Untersuchung von MÜLLER und BÜLTE (1997) für das Wachstum von VTEC-Reinkulturen inklusive E. coli O157-Stämmen gut geeignet. Die weit verbreitete mTSB-Bouillon wurde für den VTEC-Nachweis in Fäzesproben von TIMM et al. (1998) empfohlen. Da sich der Zusatz von antimikrobiellen Agentien in der Untersuchung von MÜLLER und BÜLTE (1997) als partiell wachstumshemmend er-wies, wurde in den eigenen Untersuchungen auf die Supplementierung mit Novo-biocin verzichtet. Die beiden Anreicherungsverfahren wurden durch die IMS ergänzt, weil diese sich, wie bereits dargelegt, für die Untersuchung verschiedener Substrate als sensitivitätssteigernd erwiesen hatte. Zusätzlich wurden die Proben im Direkt-ausstrich untersucht, wobei die faserige Beschaffenheit der Pferdefäzes der An-wendung der IMS entgegenstand.
In der ersten Versuchsphase konnten aus 34 von 51 Proben (66,7 %) E. coli O157-Stämme isoliert werden. Mit dem Direktausstrich ohne IMS gelang dabei nur in einem
Fall die Detektion von E. coli O157, was einem Anteil von 2,9 % aller positiven Proben entsprach. Nach Selektivanreicherung in GN- bzw. mTSB-Medium in Kombi-nation mit der IMS wurden 28 bzw. 32 Proben als E. coli O157-positiv erkannt; dies entsprach 82,4 % bzw. 94,1 % aller positiven Proben. Die von vielen Untersuchern dargelegte Verbesserung der Sensitivität durch Anwendung von Selektivanreiche-rung und/oder IMS konnte also in den eigenen Untersuchungen bestätigt werden. Da diese beiden Verfahren jedoch nicht unabhängig voneinander zur Anwendung kamen, kann nicht nachvollzogen werden, welchen Anteil sie jeweils einzeln an der Verbesserung des E. coli O157-Nachweises hatten. In Konsequenz dieser Ergeb-nisse konnte in der zweiten Versuchsphase die Methodenkaskade auf die Anwen-dung von mTSB-Bouillon in Kombination mit der IMS reduziert werden.
5.2.3 Subkultivierung und Auswahl typischer Kolonien
Da in den eigenen Untersuchungen die SF E. coli O157:H--Stämme besonders be-rücksichtigt werden sollten, mußte auf das wohl gebräuchlichste Selektivmedium (DE
BOER und HEUVELINK, 2000), den mit Cefixim und Tellurit supplementierten SMAC-Agar, verzichtet werden. Nach Untersuchungen von BIELASZEWSKA et al. (2005b) sind 96,5 % der SF E. coli O157:H--Stämme Tellurit-sensitiv und wachsen auf ent-sprechend supplementierten Nährböden nicht an. Stattdessen wurde der weniger selektive HC-Agar nach SZABO (1986) gewählt, der sich sowohl in der Untersuchung von Hackfleisch (HECKÖTTER, 1999), als auch von bovinen Fäzesproben bewährt hat (BÜLTE et al., 2002). Für erstere wurde berichtet, daß nach 24-stündiger Anreiche-rung die Auswertbarkeit durch Überwuchern der Begleiflora eingeschränkt sein kann.
In den eigenen Untersuchungen wurde aufgrund der für Fäzesproben charakteri-stischen hohen mikrobiellen Kontamination nur eine sechsstündige Anreicherung durchgeführt.
Entgegen der üblichen Auswertung wurden in den eigenen Untersuchungen auch Sorbit-positive Kolonien weiter überprüft, um neben den Sorbit-negativen E. coli O157:H7-Stämmen ggf. auch Sorbit-fermentierende H--Varianten erfassen zu können. Die zweite Schlüsselreaktion des HC-Mediums, die Überprüfung der ß-D-Glucuronidase-Aktivität unter UV-Licht, konnte jedoch aufgrund des teilweise dichten Koloniewachstums nicht zuverlässig erfaßt werden und wurde deshalb nicht in die Auswertung miteinbezogen.
5.2.4 Untersuchung des Virulenzprofils
Die besondere Lokalisation der Verotoxin-Gene beeinflußt auch die anzuwendende Nachweismethodik. Bei Subkultivierung muß mit dem Verlust der Toxin-tragenden Phagen gerechnet werden, wie KARCH et al. (1992) es bei 15 von 45 klinischen Isolaten beobachten konnten. Da die in den eigenen Untersuchungen durchgeführte Methodenkaskade mehrere Subkultivierungsschritte beinhaltete, bevor die Isolate auf das Vorhandensein von Verotoxin-Genen untersucht wurden, wurden parallel alle Kolonien auf das Vorhandensein des eae-Gens geprüft. Dieses ist auf einer Patho-genitätsinsel lokalisiert und somit als stabiler anzusehen. Das für den Haftungsfaktor Intimin codierende Gen gilt als wichtiger Marker zur Abschätzung des
Pathogenitäts-potentials eines Stammes; BÜLTE (2000; 2001) bezeichnet solche eae-positiven VTEC auch als „potentielle EHEC“. Durch die parallele Untersuchung wäre also ein potentiell hochpathogenes Isolat auch nach Verlust des vtx-Gens über das eae-Gen detektiert worden.